Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis
January 24th, 2017
Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.
El objetivo general de este procedimiento es identificar las proteínas que interactúan con un cofactor nuclear mediante el análisis LC-MS/MS. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con los mecanismos transcripcionales en el campo de la regulación génica. La principal ventaja de esta técnica es que podemos identificar las proteínas que interactúan con un cofactor nuclear.
Además, este método nos permite comprender mejor los mecanismos de regulación transcripcional de los factores nucleares objetivo. Recoja las células HEK 293 que expresan ARIP4 marcado con bandera 36 horas después de la transvección lavando la lámina de células con PBS helado y recogiendo las células con un raspador de células. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros y luego centrifugue a 8000 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la celda en cinco veces el volumen del pellet del tampón de alta sal. Gire la mezcla durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de 20 minutos de rotación, centrifugar el tubo a 17.700 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de dos mililitros y agregue tampón de dilución hasta tres veces el volumen del sobrenadante. Realice otra cetrifugación y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros. Durante la centrifugación de 10 minutos, lave 50 microlitros de perlas anti-bandera con PBS.
A continuación, centrifugar el tubo a 2000 g durante un minuto a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y repita los pasos de lavado primero con clorhidrato de glicina molar 1 molar y luego con clorhidrato tris molar. A continuación, lavar dos veces con tampón bajo en sal.
A continuación, mezcle 50 microlitros de perlas lavadas con extractos de células enteras. Gire suavemente la mezcla durante cuatro horas a dos o cuatro grados centígrados. A continuación, utilice una punta roma para transferir la muestra a una microcolumna de centrifugado y permitir que la solución gotee en un tubo de 1,5 mililitros.
Congele el flujo en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados. A continuación, lave las cuentas de la bandera con tampón bajo en sal cinco veces. Para eluir, coloque la columna en un tubo de 1,5 mililitros y centrifuga a 2000 g durante un minuto para secar las perlas.
Tape la parte inferior de la columna y luego agregue 50 microlitros de clorhidrato de glicina 1 molar. Agite suavemente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, coloque la columna en un nuevo tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 2000 g durante un minuto.
Neutralizar la solución eluida con 10 microlitros de un molar de clorhidrato tris y mezclar bien mediante pipeteo y vórtice. Agrega 50 microlitros de bicarbonato amónico de 100 milimolares. 10 microlitros de acetonitrilo, dos microlitros de ditiotreitol y 50 microlitros de muestra neutralizada.
Incubar durante 30 minutos a 56 grados centígrados. Después de la incubación, deje la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego agregue 10 microlitros de yodoacetamida 333 milimolares a la muestra e incube en la oscuridad durante 30 minutos a 37 grados C. Agregue 10 microlitros de tripsina a la mezcla e incube durante la noche a 37 grados Celsius.
Al día siguiente, transporte el producto final a una instalación de LC-MS/MS o a un laboratorio de espectrometría de masas de terceros para su análisis. Esta imagen muestra la tinción de plata del epítopo bandera marcado con ARIP4 expresado en células HEK 293 después de la precipitación inmunal con un anticuerpo específico de bandera y la separación por electroforesis. Como control, se realizó un simulacro de purificación en células HEK 293 que no expresaban proteínas exógenas.
Usando nuestro método, es posible identificar cofactores nucleares putativos a través de su factor transcripcional de interés y mejorar aún más nuestra comprensión de los mecanismos reguladores transcripcionales.
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Información general
Este estudio presenta un método para purificar proteínas de interacción coreguladora utilizando análisis de LC-MS/MS. La técnica tiene como objetivo identificar proteínas que interactúan con un cofactor nuclear, mejorando nuestra comprensión de los mecanismos regulatorios transcripcionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Regulación génica
Antecedentes
- Entender los mecanismos transcripcionales es crucial en la regulación génica.
- Identificar interacciones de proteínas puede revelar información sobre los procesos celulares.
- LC-MS/MS es una herramienta poderosa para analizar interacciones de proteínas.
- Este método se enfoca en los cofactores nucleares y sus roles reguladores.
Propósito del estudio
- Identificar proteínas que interactúan con un cofactor nuclear.
- Elucidar mecanismos regulatorios transcripcionales.
- Proporcionar un método confiable para la purificación de proteínas.
Métodos utilizados
- Recolección de células HEK 293 que expresan ARIP4 marcada con flag.
- Lavado de células con PBS helado.
- Recolección de células usando un raspador celular.
- Centrifugación de células a 8000g durante dos minutos a 4°C.
Resultados principales
- Identificación exitosa de proteínas que interactúan con cofactores nucleares.
- Mejora en la comprensión de los mecanismos transcripcionales.
- Demostración de la efectividad del método LC-MS/MS.
- Aplicaciones potenciales en la investigación de la regulación génica.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para estudiar interacciones de proteínas.
- Contribuye a una comprensión más amplia de la regulación génica.
- Estudios futuros pueden construir sobre esta técnica para obtener más información.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
