Name: Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprende a identificar proteínas que interactúan con cofactores nucleares mediante inmunoprecipitación y análisis LC-MS/MS en células HEK 293. Este método permite estudiar redes de regulación transcripcional.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Astellas para la Investigación de Trastornos Metabólicos (HT), la Fundación de Ciencia Takeda (HT) y por una Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia Becas de Ayuda para Jóvenes Científicos (B) a HT.

1. La transfección <ol><li> Sembrar las células HEK293 en placas de cultivo de 100 mm (2 x 10 6 células / placa). Cultivar las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 unidades / ml de penicilina. Se incuban las células en un incubador humidificado a 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> El día siguiente, transfectar las células con 10 g de plásmido ARIP4 marcado con FLAG utilizando 40 l de reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante 11. </li></ol> 2. Extracción de proteínas <ol><li> Aproximadamente 36 horas después de la transfección, se lavan las células con PBS enfriado con hielo y la cosecha de las células utilizando un raspador. La transferencia de las células en un 1,5 mltube y centrifugar a 8000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 5 veces el volumen de tampón de pellet M KCl 0,4 (tampón de alta sal: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, MM MgCl 5 2, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x cóctel inhibidor de proteasa). Rotar la mezcla durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Se centrifuga el tubo a 17.700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante (extracto de células enteras) a un nuevo tubo de 2 ml y añadir 3 veces el volumen inicial de tampón 0 M KCl (tampón de dilución: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl 2, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoetanol, 1x cóctel inhibidor de proteasa). </li><li> Realice otra centrifugación (17.700 xg durante 10 min a 4 ° C) y transferir el sobrenadante (extracto de células enteras) a un nuevo tubo de 2 ml. </li></ol> 3. La inmunoprecipitación <ol><li> Durante la centrifugación (2.4), lavar 50 l de perlas de anti-marca con PBS, 0,1 M glicina-clorhidrato, y luego 1 M Tris-hidrocloruro, seguido de lavado dos veces con 0,1 M de tampón de KCl (tampón bajo en sal: Tris 20 mM HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoetanol, 1x cóctel inhibidor de la proteasa). La centrifugación durante este proceso de lavado se realiza a 2.000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Mezclar 50 l de perlas de marca con los extractos de células enteras y girar suavemente la mezcla durante 4 horas a 2-4 ° C (1% del extracto de células enteras de la etapa 2.4 también debe mantenerse a -80 ° C para uso futuro como una entrada). </li><li> Transferir la muestra a una columna de centrifugación micro (caída de la gravedad). Mantener el flujo a través de un tubo de 1,5 ml, congelarla con nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 ° C (comprobar los niveles de proteína de la entrada y de flujo continuo utilizando el análisis de Western blot). </li><li> Añadir 1 ml de tampón 0,1 M KCl (tampón bajo en sal) para lavar las perlas FLAG (caída de la gravedad). </li><li> Repita el paso 3.4, al menos, cuatro veces más (para un total de cinco lavados). </li></ol> 4. La elución <ol><li> Colocar la columna en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2.000 g durante 1 min; las perlas se secan. </li><li> Se tapa el fondo della columna. </li><li> Añadir 50 l (igual al volumen de perlas de FLAG) de 0,1 M glicina-HCl (pH 2,5). </li><li> Agitar suavemente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Colocar la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2000 xg que para 1 min. </li><li> La solución eluida se neutraliza con 10 l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0); mezclar bien con la pipeta o mediante el uso de una máquina de vórtice. </li></ol> 5. La alquilación y tripsinización <ol><li> Añadir 50 l de 100 mM NH 4 HCO 3, 10 l de CH3CN, y 2 l de ditiotreitol a la mezcla (112 l de volumen total). </li><li> Incubar la muestra durante 30 min a 56 ° C. </li><li> Colocar la muestra a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Añadir 10 l de 333 mM yodoacetamida a la muestra e incubar en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 10 l de tripsina (33 ng / l) a la mezcla y se incuba durante la noche a 37 ° C. </li></ol><ol><li> Después de tripsinización durante la noche, transportar el producto final a una instalación de LC-MS / MS o de un laboratorio de espectrometría de masas de terceros para el análisis 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
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<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

transfección eficiente es esencial para obtener un resultado exitoso con este protocolo. En consecuencia, se recomienda el uso de Western blot para determinar los niveles de proteína marcada con FLAG inmunoprecipitadas. Este paso permite a los usuarios para verificar que su proteína de interés se sobreexpresa adecuadamente y, por otra parte, que la IP se realizó con éxito. los niveles de proteína marcada con FLAG también deben ser revisadas antes del análisis de espectrometría de masas. Una ...

Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel importante en muchas funciones biológicas. Como tal, estas interacciones se han implicado en la transducción de señales; el transporte de proteínas a través de las membranas celulares; el metabolismo celular; y varios procesos nucleares, incluyendo la replicación del ADN, el ADN a reparar el daño, la recombinación y la transcripción 1, 2, 3, 4. La identificación de las proteínas implicadas en estas interacciones tanto, es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de estos procesos celulares. Inmunoprecipitación (IP) es una técnica validado utilizado para analizar interacciones proteína-proteína. Con el fin de facilitar la identificación de las proteínas co-inmunoprecipitado, espectrometría de masas se utiliza a menudo 5, 6, 7, 8,9. Al dirigirse a un miembro conocido de un complejo de proteínas con un anticuerpo, es posible aislar el complejo de la proteína y para identificar posteriormente sus componentes desconocidos a través de análisis de espectrometría de masas. ARIP4 (andrógeno proteína del receptor de interacción 4), una coregulator transcripcional, interactúa con las proteínas del receptor nuclear con el fin de activar o reprimir sus promotores diana de una manera dependiente del contexto 9, 10. Para comprender mejor los mecanismos reguladores de la transcripción que regulan estos factores nucleares, se describe un método integral para purificar e identificar las proteínas que interactúan ARIP4 utilizando el sistema LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamina 2000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa (sin EDTA) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Gel de afinidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Columnas</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

una proteína preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando lc-ms / ms análisis

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Los coreguladores transcripcionales son vitales para la regulación transcripcional eficiente de la estructura de la cromatina nuclear. Los correguladores desempeñan una variedad de funciones en la regulación de la transcripción. Estos incluyen la interacción directa con factores de transcripción, la modificación covalente de histonas y otras proteínas, y la alteración ocasional de la conformación de la cromatina. En consecuencia, el establecimiento de métodos relativamente rápidos para identificar las proteínas que interactúan dentro de esta red es crucial para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos reguladores subyacentes. La identificación de socios de unión a proteínas mediada por LC-MS/MS es una técnica validada que se utiliza para analizar las interacciones proteína-proteína. Al inmunoprecipitar un miembro previamente identificado de un complejo proteico con un anticuerpo (ocasionalmente con un anticuerpo para una proteína marcada), es posible identificar sus interacciones proteicas desconocidas mediante análisis de espectrometría de masas. Aquí, presentamos un método de preparación de proteínas para la identificación de alto rendimiento mediada por LC-MS/MS de interacciones de proteínas que involucran cofactores nucleares y sus socios de unión. Este método permite una mejor comprensión de los mecanismos de regulación transcripcional de los factores nucleares objetivo.

Se identificaron una fuerte señal ARIP4, alrededor de 160 KDa, así como las de un control de ejemplo mock y varias otras proteínas desconocidas (Figura 1). Análisis de LC-MS / MS identificó tanto los péptidos complejos ARIP4 y los cofactores de péptidos potenciales dentro de la fracción de perlas de FLAG (Tabla 1). p62 (Sequestosome1), un conocido cofactor ARIP4 11 fue identificado en el análisis (Tabla 1), lo que...

Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.

Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar las proteínas que interactúan con un cofactor nuclear mediante análisis por LC-MS/MS. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con los mecanismos transcripcionales en el campo de la regulación génica. La ventaja principal de esta técnica es que podemos identificar las proteínas que interactúan con un cofactor nuclear.Además, este método nos permite comprender mejor los mecanismos reguladores transcripcionales de los factores nucleares diana. Recoger las células HEK 293 que expresan ARIP4 con etiqueta flag 36 horas después de la transfección, lavando la capa celular con PBS frío y recolectando las células con un raspador celular. Transferir las células a un tubo de 1,5 mililitros y luego centrifugar a 8000g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Aspire el sobrenadante y re-suspenda el botón celular en un volumen cinco veces mayor que el del botón, utilizando tampón de alto contenido salino. Incube la mezcla en rotación durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Tras 20 minutos de incubación en rotación, centrifugue el tubo a 17.700g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.A continuación, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de dos mililitros y agregue tampón de dilución hasta alcanzar un volumen tres veces mayor que el del sobrenadante. Realice una nueva centrifugación y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros. Durante la centrifugación de 10 minutos, lave 50 microlitros de perlas anti-flag con PBS.Luego, centrifugue el tubo a 2000g durante un minuto a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante y repita los pasos de lavado primero con clorhidrato de glicina 1 molar y luego con clorhidrato de tris 1 molar. A continuación, lave dos veces con tampón de baja salinidad.A continuación, mezcle 50 microlitros de perlas lavadas con extractos de células completas. Gire suavemente la mezcla durante cuatro horas a dos o cuatro grados Celsius. Luego, use una punta romada para transferir la muestra a una columna de microcentrifugación y permita que la solución gotee hacia un tubo de 1,5 mililitros.Congele rápidamente el flujo en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados Celsius. A continuación, lave las perlas de etiqueta con tampón de bajo contenido salino cinco veces. Para la elución, coloque la columna en un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 2000g durante un minuto para secar las perlas.Tape la parte inferior de la columna y luego agregue 50 microlitros de glicina hidrocloruro 1 molar. Agite suavemente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, coloque la columna en un nuevo tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 2000g durante un minuto.Neutralice la solución eluida con 10 microlitros de clorhidrato de tris uno molar y mezcle bien mediante pipeteo y vortex. Añada 50 microlitros de bicarbonato de amonio 100 milimolar. 10 microlitros de acetonitrilo, dos microlitros de dithiotreitol y 50 microlitros de la muestra neutralizada.Incubar durante 30 minutos a 56 grados Celsius. Después de la incubación, dejar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregar 10 microlitros de iodoacetamida 333 milimolar a la muestra e incubar en la oscuridad durante 30 minutos a 37 grados C. Agregar 10 microlitros de tripsina a la mezcla e incubar durante la noche a 37 grados Celsius.Al día siguiente, transporte el producto final a una instalación de LC-MS/MS o a un laboratorio externo de espectrometría de masas para su análisis. Esta imagen muestra la tinción con plata de ARIP4 marcado con el epítopo flag expresado en células HEK 293 tras la inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para el flag y la separación mediante electroforesis. Como control, se realizó una purificación simulada en células HEK 293 que no expresaban proteínas exógenas.Mediante nuestro método, es posible identificar cofactores nucleares putativos a través de su factor de transcripción de interés y profundizar así en el entendimiento de los mecanismos reguladores de la transcripción.

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Digestión de proteínas en membrana para preparar proteínas coinmunoprecipitadas para estudios de interacción

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Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Descrito es un flujo de trabajo proteómico para identificar socios de interacción de proteínas a partir de una fracción subcelular nuclear utilizando el enriquecimiento de inmunoafinidad de una proteína dada de interés y espectrometría de masas sin etiquetas. El flujo de trabajo incluye fraccionamiento subcelular, inmunoprecipitación, preparación de muestras asistidas por filtro, limpieza fuera de línea, espectrometría de masas y una canalización bioinformática aguas abajo.

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.

Caracterización del interactoma de lisosoma neuronal con proteómica de etiquetado de proximidad

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la captura e identificación de interacciones proteína-proteína específicas de la enfermedad de células y tejidos nativos utilizando sondas químicas y espectrometría de masas. Los conjuntos de datos de interacción resultantes se analizan a través de una plataforma web dedicada para revelar disfunciones dinámicas de la red y alteraciones de la vía relacionadas con la enfermedad.

Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Un método ChIRP basado en UV para identificar interacciones directas entre ARNN y proteína.

Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Aprende a identificar proteínas que interactúan con cofactores nucleares mediante inmunoprecipitación y análisis LC-MS/MS en células HEK 293. Este método permite estudiar redes de regulación transcripcional.

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