Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis
24 de enero de 2017
Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.
El objetivo general de este procedimiento es identificar las proteínas que interactúan con un cofactor nuclear mediante el análisis LC-MS/MS. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con los mecanismos transcripcionales en el campo de la regulación génica. La principal ventaja de esta técnica es que podemos identificar las proteínas que interactúan con un cofactor nuclear.
Además, este método nos permite comprender mejor los mecanismos de regulación transcripcional de los factores nucleares objetivo. Recoja las células HEK 293 que expresan ARIP4 marcado con bandera 36 horas después de la transvección lavando la lámina de células con PBS helado y recogiendo las células con un raspador de células. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros y luego centrifugue a 8000 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la celda en cinco veces el volumen del pellet del tampón de alta sal. Gire la mezcla durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de 20 minutos de rotación, centrifugar el tubo a 17.700 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de dos mililitros y agregue tampón de dilución hasta tres veces el volumen del sobrenadante. Realice otra cetrifugación y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros. Durante la centrifugación de 10 minutos, lave 50 microlitros de perlas anti-bandera con PBS.
A continuación, centrifugar el tubo a 2000 g durante un minuto a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y repita los pasos de lavado primero con clorhidrato de glicina molar 1 molar y luego con clorhidrato tris molar. A continuación, lavar dos veces con tampón bajo en sal.
A continuación, mezcle 50 microlitros de perlas lavadas con extractos de células enteras. Gire suavemente la mezcla durante cuatro horas a dos o cuatro grados centígrados. A continuación, utilice una punta roma para transferir la muestra a una microcolumna de centrifugado y permitir que la solución gotee en un tubo de 1,5 mililitros.
Congele el flujo en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados. A continuación, lave las cuentas de la bandera con tampón bajo en sal cinco veces. Para eluir, coloque la columna en un tubo de 1,5 mililitros y centrifuga a 2000 g durante un minuto para secar las perlas.
Tape la parte inferior de la columna y luego agregue 50 microlitros de clorhidrato de glicina 1 molar. Agite suavemente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, coloque la columna en un nuevo tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 2000 g durante un minuto.
Neutralizar la solución eluida con 10 microlitros de un molar de clorhidrato tris y mezclar bien mediante pipeteo y vórtice. Agrega 50 microlitros de bicarbonato amónico de 100 milimolares. 10 microlitros de acetonitrilo, dos microlitros de ditiotreitol y 50 microlitros de muestra neutralizada.
Incubar durante 30 minutos a 56 grados centígrados. Después de la incubación, deje la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego agregue 10 microlitros de yodoacetamida 333 milimolares a la muestra e incube en la oscuridad durante 30 minutos a 37 grados C. Agregue 10 microlitros de tripsina a la mezcla e incube durante la noche a 37 grados Celsius.
Al día siguiente, transporte el producto final a una instalación de LC-MS/MS o a un laboratorio de espectrometría de masas de terceros para su análisis. Esta imagen muestra la tinción de plata del epítopo bandera marcado con ARIP4 expresado en células HEK 293 después de la precipitación inmunal con un anticuerpo específico de bandera y la separación por electroforesis. Como control, se realizó un simulacro de purificación en células HEK 293 que no expresaban proteínas exógenas.
Usando nuestro método, es posible identificar cofactores nucleares putativos a través de su factor transcripcional de interés y mejorar aún más nuestra comprensión de los mecanismos reguladores transcripcionales.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para identificar proteínas que interactúan con cofactores nucleares mediante análisis por LC-MS/MS. El método consiste en la inmunoprecipitación de un cofactor nuclear marcado con una etiqueta flag a partir de células HEK 293, seguida de espectrometría de masas para descubrir interacciones proteína-proteína relevantes para la regulación transcripcional. Este enfoque permite a los investigadores elucidar las redes complejas que gobiernan la expresión génica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología molecular
- Proteómica
- Regulación transcripcional
Antecedentes
- Los coreguladores transcripcionales son esenciales para la regulación eficiente de la estructura de la cromatina nuclear.
- Los coreguladores interactúan con factores de transcripción, modifican histonas y proteínas, y pueden alterar la conformación de la cromatina.
- Comprender las interacciones proteína-proteína dentro de estas redes es fundamental para descifrar los mecanismos reguladores de los genes.
- La LC-MS/MS es una técnica validada para identificar socios de unión proteica.
Objetivo del estudio
- Establecer un método rápido y confiable para identificar proteínas que interactúan con cofactores nucleares.
- Facilitar el análisis de alto rendimiento de complejos proteicos implicados en la regulación transcripcional.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen al control de la expresión génica.
Métodos Utilizados
- Expresión de ARIP4 con marca flag en células HEK 293.
- Recolección de células y lisis usando tampón de alto contenido salino.
- Inmunoprecipitación con perlas anti-flag para aislar complejos proteicos.
- Lavado secuencial y elución de las proteínas retenidas.
- Digestión proteica con tripsina y preparación de muestras para LC-MS/MS.
- Análisis de interacciones proteicas mediante espectrometría de masas.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de ARIP4 con marcaje mediante etiqueta flag y proteínas asociadas a partir de células HEK 293.
- La tinción con plata confirmó la presencia de proteínas inmunoprecipitadas.
- Los experimentos de control validaron la especificidad del proceso de purificación.
- LC-MS/MS permitió la identificación de posibles cofactores nucleares que se asocian como proteínas interaccionantes.
Conclusiones
- El protocolo descrito identifica eficazmente las proteínas que interactúan con cofactores nucleares.
- Este método impulsa el estudio de los mecanismos reguladores de la transcripción.
- Proporciona una base para la exploración posterior de las redes de proteínas en la regulación génica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de alto rendimiento de interacciones de proteínas cofactor nucleares mediante LC-MS/MS es fundamental para reducir riesgos en las fases iniciales del descubrimiento y aclarar las redes reguladoras transcripcionales. Este flujo de trabajo permite a los equipos de biofármacos investigar hipótesis mecanicistas y priorizar objetivos basándose en evidencia directa de interacciones proteína-proteína. La integración de un mapeo robusto del interactoma en la etapa de descubrimiento respalda la confianza predictiva e informa las decisiones de triage del portafolio.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la identificación sistemática de cofactores nucleares que se unen a socios para la validación funcional de dianas.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar las vías reguladoras de la transcripción.
- Proporciona evidencia directa de redes de interacción proteica relevantes para la regulación génica.
- Facilita la priorización de dianas con interacciones moleculares validadas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara complejos proteicos validados para análisis cuantitativo por LC-MS/MS posterior.
- Normaliza la inmunoprecipitación y la preparación de muestras para un perfilado reproducible del interactoma.
- Genera datos cuantitativos que respaldan el desarrollo de ensayos y la preparación para cribado.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre interacciones proteína-proteína.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona datos de interaccionoma con mecanismos transcripcionales relevantes para la enfermedad cuando los cofactores nucleares están implicados en la patología.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mapeo de redes de proteínas reguladoras.
- Proporciona información para tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en conocimientos mecanicistas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Esta preparación de proteínas y el flujo de trabajo de LC-MS/MS se sitúan en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos activos, proporcionando datos fundamentales del interactoma para investigaciones traslacionales posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el mapeo de interacciones de cofactores nucleares.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para el desarrollo de ensayos y la selección de compuestos.
- Análisis: Ofrece identificación y cuantificación basadas en espectrometría de masas de complejos proteicos.
- Investigación Traducional: Permite alinear datos de interacciones moleculares con modelos de enfermedades cuando sea pertinente.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo escalable y reutilizable para el mapeo del interactoma en diferentes objetivos y programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento de complejos proteicos y el análisis por LC-MS/MS para garantizar reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al basar el progreso en datos de interacción directa.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo basada en mecanismos moleculares validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunoprecipitación, química de proteínas y análisis por LC-MS/MS.
- Necesita acceso a instrumentación de espectrometría de masas y a infraestructura analítica.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y análisis de datos.
- Adaptable a diferentes cofactores nucleares y sistemas de proteínas marcadas mediante la optimización del protocolo.
- Depende de la especificidad y calidad del anticuerpo para una inmunoprecipitación fiable.
