Name: El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a aislar células estromales derivadas de tejido adiposo con potencial osteogénico y evaluar su actividad en un ensayo in vivo de curación de calota. Este método permite estudiar la regeneración ósea en biología craneofacial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.D.M. fue apoyado por la Beca de Investigación Residente del Colegio Americano de Cirujanos (ACS). M.S.H. fue apoyado por la beca de formación Clinical Fellow del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) TG2-01159. M.S.H., H.P.L. y M.T.L. contaron con el apoyo de la Sociedad Americana de Cirujanos Maxilofaciales (ASMS)/Fundación de Cirujanos Maxilofaciales (MSF) para la Beca de Investigación. H.P.L. contó con el apoyo de la subvención R01 de los NIH GM087609 y un regalo de Ingrid Lai y Bill Shu en honor a Anthony Shu. H.P.L. y M.T.L. contaron con el apoyo del Laboratorio Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica y la Fundación Oak. M.T.L. recibió el apoyo de las subvenciones U01 HL099776, R01 DE021683-01 y RC2 DE020771 de los NIH. D.C.W. contó con el apoyo de la subvención 1K08DE024269 de los NIH, el Laboratorio Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica y el Premio Scholar del Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford.

Nota: Las muestras fueron obtenidas de pacientes que dieron su consentimiento informado. Todos los protocolos fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Stanford apropiado. Durante la manipulación de células y tejidos humanos, siempre se adhieren a la bioseguridad de nivel 2 (BSL2) precauciones, tal como se especifica por su institución. 1. Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar tampón FACS: Añadir 10 ml de FBS, 5 ml de Poloxámero 188 y 5 ml Pen-Strep a 500 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Preparar digerir la mezcla: Añadir 0,375 g C. hemolyticum colagenasa tipo II en polvo y 5 ml de Poloxámero 188 a 500 ml estéril medianas / EBSS 199. </li><li> Preparar medio estándar: Añadir 50 ml de FBS y 5 ml Pen-Strep a 500 ml de Eagle modificado por Dulbecco. </li></ol> 2. La recolección y aislamiento de ASC NOTA: Asegúrese de que las aprobaciones institucionales adecuados están en su lugar para el uso de tejidos humanos y para aislar hLas células madre Uman. Obtener abdominal humana, flanquear o muslo de grasa subcutánea de un donante sano someterse a una liposucción electiva. Mantener la grasa en un recipiente de plástico de succión. <ol><li> Añadir PBS estéril en una proporción de 1: 1 a la grasa en el recipiente de plástico original. (Si hay 500 ml de grasa, añadir 500 ml de PBS). Mezclar por agitación suave durante 30 s. Permitir que la capa acuosa se asiente a la parte inferior (Figura 1) y luego aspirado y desechar la capa acuosa con una pipeta de 10 ml de plástico unido a la succión. </li><li> Decantar la grasa en un recipiente de plástico grande y añadir digerir mezcla en una proporción de 1: 1. Cierre el contenedor y limpie el exterior con un 70% de etanol. Sellar la tapa con película de parafina. </li><li> Agite este contenedor en un agitador orbital a 180 rpm a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Neutralizar la digestión mediante la adición de medio estándar en una proporción de 1: 1. (Si hay una mezcla de grasas 1.000 ml, 1.000 ml agregar medio estándar). </li><li> Distribuir la mezcla en partes iguales en un número par de 250 ml de plástico tubos de centrífuga cónico y centrifugar la mezcla a 300 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y tener cuidado de dejar la pastilla intacta. pellets de resuspender en 5 ml de medio estándar para cada tubo cónico. </li><li> Se filtra la suspensión a través de un filtro de 100 micras en un tubo cónico de 50 ml de centrífuga. A continuación, se centrifuga a 300 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 ml temperatura ambiente tampón de lisis RBC. Deje que la mezcla repose durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 300 g durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA). </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de medio estándar. De nuevo se filtra a través de un filtro de 100 micras en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. </li><li> En un nuevo cónico de 50 ml, añadir 15 ml de solución de polisucrosa diseñado para la separación basada en la densidad (véase la lista de reactivos). Luego, sosteniendo el tubo en un ángulo de 45 °, la pipeta cuidadosamente las células en el lado deel tubo de manera que la suspensión de células suavemente capas en la parte superior de la solución polisucrosa (Figura 2). NOTA: Es importante para las células de pipeta sobre la superficie de la solución. No añadir solución polisucrosa a una suspensión de células ya que esto crea una mezcla irreversible. Del mismo modo, no se puede pipetear las células en el centro de la solución polisucrosa. </li><li> Centrifugar esta mezcla a 300 xg durante 10 min a TA. Use un nivel bajo de aceleración (2 - 3 de cada 10) y configurar la función de freno de la centrífuga a cero para este paso. NOTA: Tres capas serán visibles: clara en la parte inferior, nublado en el centro y en la parte superior de color salmón. La capa media contiene las células de interés. </li><li> Usando una pipeta de 10 ml retire con cuidado la capa media y la transfiere a un nuevo tubo cónico de 50 ml. NOTA: Es mejor para transferir completamente la capa media y en el proceso de tomar algunas de las capas superior e inferior que dejar atrás algunas de la capa media. </li> &lt;li&gt; Contar las células usando un hemocitómetro y determinar el número total de células vivas. NOTA: lo general el uso de azul de tripano añade a la mezcla de células a una concentración final de 0,8% para ayudar en el recuento de células. células vivas viables no ocupará el colorante azul y aparecerán en blanco. </li></ol> 3. clasificación FACS para BMPR-IB células positivas y Preparación de andamios que contiene células <ol><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en tampón de FACS en una concentración de 1 millón de células por cada 100 l (basada en el recuento de células realizado en el paso 2,13). </li><li> Transferir al menos 10 millones de células a un tubo de centrífuga de plástico con la etiqueta &quot;BMPR-IB.&quot; Por otra parte, la transferencia de un millón de células en 100 l de tampón FACS a un tubo de centrífuga de plástico por separado con la etiqueta &quot;no teñida.&quot; Añadir 1 ml de tampón FACS para el tubo &quot;no teñida&quot;. Mantenga el resto de las células en tampón de FACS en hielo mientras que los FACS clasificación de parte de la experse está haciendo iment. Etiquetar estas células &quot;no clasificados&quot;. Utilizarlos como controles más adelante en el experimento. </li><li> Añadir una cantidad apropiada de un anticuerpo BMPR-IB anti-humana fluorescente al tubo &quot;BMPR-IB&quot; de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetear la mezcla arriba y hacia abajo suavemente para distribuir el anticuerpo. NOTA: Utilizamos un humano BMPR-IB / ALK-6 Anticuerpo APC conjugado a una dilución 1:10 (véase la lista de reactivos para más detalles). Sin embargo, los anticuerpos de diferentes fabricantes tienen diferentes concentraciones recomendadas. </li><li> Cubrir el cubo de hielo de una manera que evita la entrada de luz. Dejar que la mezcla de célula / anticuerpo para sentarse durante 30 min (o de acuerdo a las instrucciones del fabricante anticuerpo). NOTA: Si el anticuerpo anti-BMPR-IB viene como un anticuerpo no conjugado primaria que requiere un anticuerpo secundario, realizar una etapa de tinción separado en hielo con el anticuerpo secundario según las instrucciones del fabricante. </li><li> Centrifugar los tubos a ambos300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no aspirar el pellet. Resuspender las células sedimentadas en 1 ml de tampón FACS. Una vez más, centrifugar los tubos a 300 xg durante 5 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células en tampón de FACS hasta una concentración de 1 millón de células por 1 ml. </li><li> Se filtra la células no clasificadas &quot;&quot; BMPR-IB &quot;,&quot; no teñida &quot;y&quot; a través de 40 micras coladores de células en nuevos tubos de vidrio etiquetados FACS. Lavar los filtros con 500 l de tampón FACS para asegurar que las células no se quedan atrás en el filtro. También añadir 2 ml de medio estándar para dos tubos de centrífuga de plástico separadas etiquetadas &quot;BMPR-IB-positivo&quot; y &quot;BMPR-IB-negativo&quot;. Utilice estos dos para recoger las células clasificadas en la máquina de FACS. </li><li> En la máquina de FACS, usar las células no teñidas para definir una puerta negativa para el marcador fluorescente. </li><li> El uso de una boquilla de 100 micras, ordenar BMPR-IB células positivas y negativas en los respectivos tubos de estafadoresque contiene un medio estándar. Mantener estos tubos refrigerados a 4 ° C durante la ordenación si la máquina FACS tiene esta capacidad. NOTA: Por favor, consulte el artículo JOVE 13 por Sharon et al. para un protocolo excelente para la clasificación FACS. </li><li> El uso de un hemocitómetro, contar las células en cada tubo. Centrifugar los tubos &quot;Sin Clasificar&quot; BMPR-IB-positivo &quot;,&quot; BMPR-IB-negativo &quot;y&quot; a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. A continuación, volver a suspender las células en medio estándar a una concentración de 1 millón de células por 250 mL. </li><li> Obtener andamios recubiertos con hidroxiapatita pre-corte 4 mm PLGA (poli [ácido láctico-co-glicólico]). Coloque cada andamio en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Cubrir cada andamio con 50 l de suspensión de células de uno de los tres grupos (i .e, 200.000 células.): Inclasificado, BMPR-IB-positivo, y BMPR-IB-negativo (Figura 3). NOTA: Por favorconsulte el artículo JOVE 14 por Lo et al. para más detalles sobre la construcción de andamios de PLGA. </li><li> Llene parcialmente los pocillos vacíos que rodean con un medio estándar (para evitar la desecación de los andamios), cubrir la placa con su tapa, y se incuban en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante 30 minutos. </li></ol> 4. Creación de defectos de calota y la aplicación de ACS que contiene Andamios NOTA: Asegúrese de que las aprobaciones institucionales adecuados están en su lugar para la creación de defectos de calota en ratones vivos. Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. <ol><li> Anestesiar a un CD-1 de ratón desnudo usando ya sea el gas isoflurano inhalado o inyectado un cóctel de acción prolongada anestésico. <ol><li> Para utilizar gas solo, colocar el ratón en una cámara de anestesia y comenzar el flujo de oxígeno a 2 - 3 L / min con una concentración de 2% de isoflurano. Una vez que el ratón es fully inconsciente, colocarlo propensos a una cálida manta de recirculación de agua con una almohadilla absorbente y colocar su hocico en un cono de la nariz la anestesia con la misma concentración de oxígeno e isoflurano. monitorizar cuidadosamente la frecuencia respiratoria y ajustar la concentración de isoflurano según sea necesario. </li><li> Para usar un cóctel anestésico de acción prolongada inyectado, anestesiar el ratón en una cámara de anestesia como se describe anteriormente y luego inyectar el cóctel anestésico. Retire el ratón de la cámara de anestesia y observar su comportamiento. NOTA: El ratón puede emerger brevemente de la anestesia pero dentro de varios minutos debe ser de nuevo completamente anestesiado bajo el efecto del anestésico inyectado. Transferir el ratón a una cálida manta de recirculación de agua cubierto con una almohadilla absorbente. NOTA: Para un cóctel anestésico, se recomienda una mezcla que contenía ketamina 10 mg / ml y xilazina 1 mg / ml en solución salina normal, entregado por vía intraperitoneal. La dosis estándar de esta mezcla es300 l para un ratón de 30 g, lo que equivale a la ketamina 100 mg / kg y xilazina 10 mg / kg. Vea la sección de discusión para más detalles sobre el anestésico inyectable. </li><li> Utilice una maniobra del dedo del pie de presión para determinar la profundidad de la anestesia. Un ratón anestesiado adecuadamente no se retrae la pata cuando está ligeramente pellizcado por el cirujano. </li><li> Aplicar ungüento para los ojos para evitar la desecación de la córnea. </li><li> Administrar 1 mg / kg por vía subcutánea buprenorfina SR. NOTA: proporcionar analgesia antes de los resultados de la cirugía en el alivio del dolor superior. </li><li> Durante todo el procedimiento, controlar el ritmo respiratorio del ratón. NOTA: Un ratón anestesiado adecuadamente bajo isoflurano debe tener una frecuencia respiratoria de 50 - 100 respiraciones / min. Un aumento de la frecuencia respiratoria indica que la anestesia es demasiado clara, mientras que una disminución de la frecuencia respiratoria puede indicar que la anestesia es demasiado profunda. </li></ol></li><li> Preparar la piel de la cara dorsal del cráneo con povidona-IODsolución ine seguido por 70% de etanol tres veces. Cubrir con paños estériles, dejando expuesta la zona quirúrgica. NOTA: Use guantes quirúrgicos estériles y mantener una técnica estéril durante el procedimiento. solo se puede tocar las superficies y objetos estériles, tales como el campo estéril, los instrumentos esterilizados en autoclave. Haga que un asistente ajustar la iluminación, los paquetes de sutura abiertas, etc. </li><li> El uso de un bisturí 15-cuchilla, hacer una incisión en la línea media sagital que se extiende sobre la mayor parte del cráneo dorsal. El uso de un pinzas finas dentadas, retraer la piel en el lado derecho de la incisión para exponer el hueso parietal derecha. </li><li> Usando un taladro con una broca de trépano con recubrimiento de diamante de 4 mm en autoclave, perforar un defecto a través del hueso parietal. No se extienden más allá del defecto óseo en la capa de la duramadre. (Figura 4) </li><li> Colocar un andamio en el defecto, y luego cerrar la incisión de la piel con sutura continua de nylon. </li><li> Monitorear el ratón y proporcionar un cuidado postoperatorio estándare acuerdo con las directrices institucionales. <ol><li> Mantenga el ratón sobre una toalla de papel limpia dentro de una jaula limpia mientras se recupera. Una mitad de la jaula debe ser colocado sobre una manta caliente de recirculación de agua y el ratón inicialmente debe ser colocado en este medio. </li><li> No deje un ratón sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para caminar. No devuelva un ratón que se ha sometido a una cirugía para una jaula con otros ratones hasta que esté totalmente recuperado. </li></ol></li><li> Repetir los pasos anteriores con un nuevo ratón para cada andamio que se va a probar. Esterilizar instrumentos quirúrgicos en entre cirugías usando un esterilizador de cuentas caliente u otro método adecuado. </li><li> Poco después del procedimiento, y después a las 2, 4, 6, y 8 semanas, el uso de exploración micro CT para analizar la velocidad de cierre de defectos de calota. NOTA: Véase el artículo de Levi et al. 6 para una descripción de tomografía computarizada micro defectos de la bóveda craneal. </li><li> Cuando el experimento es complete, la eutanasia a los ratones mediante la colocación de ellos en una cámara de eutanasia limpio y comenzar un flujo de gas de dióxido de carbono a la cámara a una velocidad de 2 L / min. Después de respiración han cesado por completo (después de aproximadamente 10 min) realizar la dislocación cervical para confirmar la eutanasia. </li><li> Opcionalmente, después del experimento es completa, el uso de seccionamiento y tinción histológica para evaluar la formación de hueso dentro del defecto. NOTA: Véase el artículo de McArdle et al. 12 para los detalles de la preparación ósea Las muestras para histología. Para una revisión de las técnicas histológicas y de tinción, consulte un manual histológico como el Manual de Patología Quirúrgica 15. </li></ol>

<ol><li>Silber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+site+morbidity+after+anterior+iliac+crest+bone+harvest+for+single-level+anterior+cervical+discectomy+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: an update.</a> Injury. 36, S20-S27 (2005).</li>
<li>Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+graft+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Bone graft substitutes.</a> Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in bone tissue engineering.</a> Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).</li>
<li>Chapekar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: challenges and opportunities.</a> J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects.</a> PLoS One. 5 (6), e11177(2010).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29-positive+selection+enhances+osteogenic+capacity+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).</li>
<li>Wozney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+bone+formation%3A+molecular+clones+and+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.</a> Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).</li>
<li>Wan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+adipose-derived+adult+stromal+cells+requires+retinoic+acid+and+bone+morphogenetic+protein+receptor+type+IB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).</li>
<li>McArdle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+for+bone+morphogenetic+protein+receptor+type-IB+promotes+differentiation+and+specification+of+human+adipose-derived+stromal+cells+toward+an+osteogenic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage.</a> Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (71), e4425(2013).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Lester, S. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLester%2C+SC+%22Manual+of+surgical+pathology%22">Manual of surgical pathology</a>. , Saunders/Elsevier. (2010).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen divulgaciones que hacer.

Los pasos críticos dentro del Protocolo Durante la cosecha de ASC, el paso crítico es la digestión adecuada de grasa con colagenasa. Digestión inadecuada dará lugar a un bajo rendimiento de ASC. Durante FACS clasificación de células BMPR-IB +, es importante definir cuidadosamente la puerta para la positividad. Definición de puertas demasiado flojo puede dar lugar a poblaciones clasificadas que no son puros. Durante la creación del defecto de la bóveda craneal, es fundamental para perforar el de...

Los principales defectos óseos que resultan de una lesión, infección o cáncer invasivo tienen un impacto significativo en la recuperación y la calidad de vida de un paciente. Existen técnicas para llenar estos defectos con hueso sano de en el propio cuerpo del paciente en otro lugar, pero esta transferencia lleva su propia morbilidad y riesgo de complicaciones 1, 2, 3. Además, algunos defectos son tan grandes o complejas que suficiente hueso de donante no está disponible para llenar el defecto. Los dispositivos protésicos son una opción potencial para el relleno de defectos óseos, pero estos están asociados con varias desventajas, incluyendo el riesgo de infección, un fallo de hardware, y la reacción de cuerpo extraño 4. Por estas razones, hay un gran interés en la posibilidad de la ingeniería de sustitutos óseos biológicos usando las propias células del paciente 5. Las células del estroma derivadas de tejido adiposo (ASC)tienen potencial para esta aplicación, ya que son abundantemente disponible en el propio tejido graso del paciente y que han demostrado la capacidad de curar defectos óseos mediante la generación de nuevo tejido óseo 6, 7. ASCs son una población diversa de células y varios estudios han demostrado que la selección de marcadores de superficie celular específicos puede producir poblaciones de células con actividad osteogénica mejorada 8, 9. Selección de ASC con el mayor potencial osteogénico aumentaría la probabilidad de que un andamio sembrada con estas células podría regenerar un defecto óseo grande. Proteína morfogenética de señalización ósea (BMP) es fundamental para la regulación de la diferenciación y formación de hueso 10 y el tipo de BMP Receptor IB (BMPR-IB) se sabe que es importante para la osteogénesis en ASC 11. Recientemente, hemos demostrado que la expresión de BMPR-IB puede be utiliza para seleccionar de ASC con una mayor actividad osteogénica 12. Aquí se demuestra un protocolo para el aislamiento de las ASC derivadas de la grasa humana, seguido de un ensayo de su actividad osteogénica mediante un vivo calota modelo de defecto en BMPR-IB-expresión.

<table><tbody><tr><td>Colador de celdas de 100 micras</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí de 15 hojas</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td> Corning <td>3524</td><td></td><td>Colador de</td></tr><tr><td>celdas de 40 micras</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>tubos centrífugos cónicos de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon sutura de nylon, aguja P-3 de 18", &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-BMPR-IB</td><td>R& D systems</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>guantes quirúrgicos BioGel PI</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo destornillador de agujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 ratón desnudo</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II polvo</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Taladro: Cuchillo circular de 4,0 mm</td><td>Xemax Surgical</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Taladro: Z500 Micromotor sin escobillas</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes Fisherbrand, 20" x 24"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Almohadilla de gasa de algodón estéril, 4" x 4"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS medio</td><td>GE&nbsp; Ciencias de la Vida</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia isoflurano</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td></td><td></td>050033</tr><tr><td>Micro Pinzas con dientes</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pinzas con dientes</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Película de parafina (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Andamios PLGA</td><td>Formulación patentada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxámero 188, 10%</td><td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Campo estéril poliforrado, 18" x 24"</td> <td>Busse Hospital Desechables</td><td>696</td><td>Corte un agujero rectangular del tamaño apropiado</td></tr><tr><td>Solución de polisacarosa: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Solución de Preparación de Yodo</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento oftálmico Puralube vaselina, tubo de 1/8 onzas</td> Tampón de lisis RBC de <td>Dechra Veterinary Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma 11814389001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Webcol hisopos de preparación para alcohol</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento rápido de bmpr-ib + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un defecto la curación modelo de calota

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Los cánceres invasivos, las lesiones graves y las infecciones pueden causar defectos óseos que son demasiado grandes para ser reconstruidos con hueso preexistente del propio cuerpo del paciente. La capacidad de cultivar hueso de novo utilizando las propias células de un paciente permitiría que los defectos óseos se llenaran con tejido adecuado sin la morbilidad de recolectar hueso nativo. Existe interés en el uso de células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) como fuente para la ingeniería de tejidos, ya que se obtienen de una fuente abundante: el propio tejido adiposo del paciente. Sin embargo, las ASC son una población heterogénea y algunas subpoblaciones pueden ser más efectivas en esta aplicación que otras. El aislamiento de la población más osteogénica de ASC podría mejorar la eficiencia y la eficacia de un proceso de ingeniería ósea. En este protocolo, las ASC se obtienen a partir de tejido graso subcutáneo de un donante humano. La subpoblación de ASCs que expresan el marcador BMPR-IB se aísla mediante FACS. A continuación, estas células se aplican a un ensayo de curación de defectos de la calvaria in vivo y se descubre que tienen un potencial regenerativo osteogénico mejorado en comparación con las células no clasificadas.

Micro CT scan hace en el día de la cirugía mostrará claramente el defecto craneal. En este momento no habrá crecimiento interno en el defecto de 4 mm. exploraciones posteriores se obtienen con el tiempo para cuantificar el tamaño del defecto en el tiempo en comparación con la línea base. Defectos sembrada con células BMPR-IB + deben demostrar más rápido cierre del defecto en comparación con BMPR-IB- y células no clasificadas (Figura 5). Además, la parte del cráneo que co...

Las células estromales derivadas del tejido adiposo pueden ser útiles para diseñar nuevo tejido a partir de las propias células de un paciente. Presentamos un protocolo para el aislamiento de una subpoblación de células estromales derivadas del tejido adiposo humano (ASCs) con mayor potencial osteogénico, seguido de la aplicación de las células en un ensayo de curación calvarial in vivo.

El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

El objetivo general de este protocolo es aislar poblaciones celulares específicas de células estromales derivadas del tejido adiposo y evaluar su actividad osteogénica mediante un ensayo in vivo. El método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la biología regenerativa craneofacial, como por ejemplo cómo pueden emplearse las células madre derivadas del tejido adiposo para crear tejido óseo completamente funcional en defectos óseos dañados. La principal ventaja de esta técnica es que las células se aíslan rápidamente a partir de tejido humano fresco, evitando así que pasen tiempo en cultivo celular, lo cual se sabe que altera la expresión de genes y de marcadores celulares.Las implicaciones de esta técnica se extienden a pacientes que presentan defectos óseos grandes, causados por cáncer, traumatismos o infecciones. En el futuro, podría ser posible aislar poblaciones celulares de ASC y utilizarlas con fines regenerativos. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que la creación del defecto calvarial es difícil de aprender, principalmente porque el defecto se realiza en un cráneo abovedado y porque está muy cerca de la duramadre.Para este protocolo, obtenga grasa subcutánea abdominal, de flanco o de muslo recolectada de un donante humano sano y almacenada en un frasco de succión de plástico. A la grasa, añada un volumen igual de PBS estéril y mezcle con agitación suave durante 30 segundos. Deje que la capa acuosa se sedimente y luego retírela utilizando una pipeta de plástico de 10 mililitros.Luego, vierta la grasa en un recipiente plástico grande y agregue un volumen igual de la mezcla de digestión. Limpie el recipiente sellado de grasa con etanol al 70 %, y séllelo con parafina. A continuación, agite el recipiente a 180 rotaciones por minuto, en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos.A continuación, neutralice la digestión duplicando el volumen de la reacción con medio estándar. Centrifugue las células, retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 5 mililitros de medio estándar. Luego, pase todas las suspensiones a través de un filtro de 100 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar el filtrado a cuatro grados Celsius durante 15 minutos a 300 G. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente. Una vez en suspensión, dejar actuar durante cinco minutos para la lisis a temperatura ambiente. Luego, centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos y completar los pasos de separación según el protocolo descrito en el texto.La clasificación celular adecuada es fundamental para este protocolo. Primero, resuspenda las células en tampón FACS a un millón de células por 100 microlitros y manténgalas en hielo. Luego, transfiera al menos 10 millones de células a un tubo de centrífuga de plástico sobre hielo etiquetado como BMPR-1B.Transfiera un millón de células a un tubo con hielo etiquetado como no teñido y añádales un mililitro de tampón FACS. Etiquete las células restantes como no clasificadas. A continuación, añada el anticuerpo al tubo de BMPR-1B y mezcle mediante pipeteo suave para homogeneizar.Deje que esta mezcla incube durante el tiempo indicado por el fabricante. Luego, centrifugue las células para la clasificación por FACS y resuspenda cuidadosamente en un mililitro de tampón FACS. A continuación, repita el proceso y resuspenda las células a un millón de células por mililitro.Ahora, pase las tres poblaciones celulares a través de filtros celulares de 40 micrones hacia tubos de vidrio para FACS. Utilice 500 microlitros de tampón FACS para enjuagar las últimas células de los filtros. A continuación, prepare dos viales de recolección, para las poblaciones positivas y negativas al anticuerpo.Cargue cada uno con dos mililitros de medio estándar de cultivo celular, en la máquina de FACS, primero ejecute las células no marcadas y utilice los resultados para definir una compuerta negativa para el marcador fluorescente. Luego, utilizando una boquilla de 100 micrones, separe las células marcadas en sus respectivos tubos que contienen medio estándar. Si es posible, mantenga estos tubos enfriados a cuatro grados Celsius durante la separación.Continúe cargando las células en el andamio según se describe en el protocolo escrito. Después de anestesiar al animal, corte cualquier pelo en el sitio quirúrgico y limpie la piel expuesta con solución de povidona yodada seguida de etanol al 70 %, tres veces. Luego, coloque un campo quirúrgico alrededor del animal, dejando expuesto el sitio quirúrgico.Ahora, utilizando un escalpelo con hoja de 15, realice una incisión sagital en la línea media que se extienda sobre la mayor parte del cráneo dorsal. Luego, con pinzas de dientes finos, retire la piel del lado derecho de la incisión para exponer el hueso parietal derecho. Prepare el taladro con una broca de trepanación esterilizada de cuatro milímetros recubierta de diamante.A continuación, realice un defecto a través del hueso parietal, pero no extienda el defecto más allá del hueso; deje intacta la capa de duramadre. Ahora, coloque un andamio que contenga células o solución control dentro del defecto y cierre la incisión cutánea con sutura de nylon continua. Luego, continúe con los protocolos de cuidado postoperatorio del ratón según se indica en el protocolo descrito en el texto.Los escaneos de micro-TC del defecto craneal realizados el día de la cirugía muestran claramente el nuevo defecto. Los escaneos repetidos en puntos temporales posteriores muestran que los defectos sembrados con células positivas para BMPR-1B se cierran más rápidamente que aquellos con células negativas para BMPR-1B o células no clasificadas. Cuando la cicatrización se cuantifica como un porcentaje de cierre completo de la herida, la diferencia se aprecia fácilmente.A continuación, porciones de los cráneos que contenían los defectos fueron descalcificadas y teñidas para identificar el nuevo hueso regenerado y el control del hueso mediante la pentacromía de Movat, que distingue el cartílago del hueso, así como todas las etapas de maduración intermedias. En comparación con las células no clasificadas, las células positivas para BMPR-1B tuvieron un fuerte impacto en el proceso regenerativo, más notablemente a lo largo de los bordes del defecto. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del potencial clínico que tiene este experimento, al aislar ASCs específicas del paciente y utilizarlas para sanar defectos óseos.Se pueden derivar muchos experimentos posteriores a partir de este para responder aún más preguntas sobre la cicatrización ósea, como el uso de FACS para el aislamiento de ASCs con diferentes compromisos de linaje, micro-TC para analizar cómo diferentes tipos celulares y tejidos sanan con el tiempo, y el modelo de defecto craneal en este experimento para generar ideas para más experimentos de cicatrización ósea. No olvide que trabajar con tejido humano puede ser extremadamente peligroso. Asegúrese de tomar las precauciones adecuadas, incluyendo el uso de guantes, protección ocular y la eliminación adecuada de todos los desechos peligrosos.

rapid-isolation-bmpr-ib-adipose-derived-stromal-cells-for-use

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de...

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Este protocolo describe el aislamiento de tejido adiposo derivado de células estromales de lipoaspirado y la creación de un 4 mm de tamaño crítico defecto craneal para evaluar la regeneración esquelética.

La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.

Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

Proponemos un protocolo de expansión de la célula en microcarriers macroporoso y su uso como sistema de envío en un biorreactor de perfusión a una matriz de tejido decellularized de la semilla. También se incluyen diferentes técnicas para determinar la proliferación celular y la viabilidad de las células cultivadas en microcarriers. Además, demostramos la funcionalidad de las células después de culturas del biorreactor.

Recombinante colágeno péptido Microcarriers para la extensión celular y su posible uso como sistema de células en un biorreactor modelo

El número de nuevos biomateriales ingeniería para reparar las lesiones del hueso grande está en continua expansión con el objetivo de acelerar la cicatrización ósea y superar las complicaciones asociadas con el trasplante de hueso. Aquí, presentamos una estrategia multidisciplinaria para las pruebas de biocompatibilidad preclínico de Biomateriales para la reparación de hueso.

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.

Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas

Las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula tienen funciones significativas en la diferenciación diversa, la autorrenovación y la modulación inmunitaria. Se han convertido en un reservorio crucial de células precursoras en terapia génica, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Aquí, presentamos un método único para aislar células madre mesenquimales de médula ósea de la mandíbula en ratas.

Técnica para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de mandíbula de rata

El aislamiento delas MSCsBAMBI altasen MFGE8, uno de los tres subgrupos principales que constituyen las UC-MSCs humanas heterogéneas, es útil para comprender completamente las características y funciones de este subtipo para su futura aplicación para mejorar la eficacia clínica en enfermedades específicas. Aquí, presentamos un método para clasificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical BAMBIhumano con altocontenido de MFGE8

Aprenda a aislar células estromales derivadas de tejido adiposo con potencial osteogénico y evaluar su actividad en un ensayo in vivo de curación de calota. Este método permite estudiar la regeneración ósea en biología craneofacial.

El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota (Video) | JoVE Journal

El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota

Explorar más videos