El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota

El objetivo general de este protocolo es aislar poblaciones celulares específicas de células estromales derivadas del tejido adiposo y evaluar su actividad osteogénica mediante un ensayo in vivo. El método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la biología regenerativa craneofacial, como por ejemplo cómo pueden emplearse las células madre derivadas del tejido adiposo para crear tejido óseo completamente funcional en defectos óseos dañados. La principal ventaja de esta técnica es que las células se aíslan rápidamente a partir de tejido humano fresco, evitando así que pasen tiempo en cultivo celular, lo cual se sabe que altera la expresión de genes y de marcadores celulares.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a pacientes que presentan defectos óseos grandes, causados por cáncer, traumatismos o infecciones. En el futuro, podría ser posible aislar poblaciones celulares de ASC y utilizarlas con fines regenerativos. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que la creación del defecto calvarial es difícil de aprender, principalmente porque el defecto se realiza en un cráneo abovedado y porque está muy cerca de la duramadre.

Para este protocolo, obtenga grasa subcutánea abdominal, de flanco o de muslo recolectada de un donante humano sano y almacenada en un frasco de succión de plástico. A la grasa, añada un volumen igual de PBS estéril y mezcle con agitación suave durante 30 segundos. Deje que la capa acuosa se sedimente y luego retírela utilizando una pipeta de plástico de 10 mililitros.

Luego, vierta la grasa en un recipiente plástico grande y agregue un volumen igual de la mezcla de digestión. Limpie el recipiente sellado de grasa con etanol al 70 %, y séllelo con parafina. A continuación, agite el recipiente a 180 rotaciones por minuto, en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

A continuación, neutralice la digestión duplicando el volumen de la reacción con medio estándar. Centrifugue las células, retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 5 mililitros de medio estándar. Luego, pase todas las suspensiones a través de un filtro de 100 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros.

Centrifugar el filtrado a cuatro grados Celsius durante 15 minutos a 300 G. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente. Una vez en suspensión, dejar actuar durante cinco minutos para la lisis a temperatura ambiente. Luego, centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos y completar los pasos de separación según el protocolo descrito en el texto.

La clasificación celular adecuada es fundamental para este protocolo. Primero, resuspenda las células en tampón FACS a un millón de células por 100 microlitros y manténgalas en hielo. Luego, transfiera al menos 10 millones de células a un tubo de centrífuga de plástico sobre hielo etiquetado como BMPR-1B.

Transfiera un millón de células a un tubo con hielo etiquetado como no teñido y añádales un mililitro de tampón FACS. Etiquete las células restantes como no clasificadas. A continuación, añada el anticuerpo al tubo de BMPR-1B y mezcle mediante pipeteo suave para homogeneizar.

Deje que esta mezcla incube durante el tiempo indicado por el fabricante. Luego, centrifugue las células para la clasificación por FACS y resuspenda cuidadosamente en un mililitro de tampón FACS. A continuación, repita el proceso y resuspenda las células a un millón de células por mililitro.

Ahora, pase las tres poblaciones celulares a través de filtros celulares de 40 micrones hacia tubos de vidrio para FACS. Utilice 500 microlitros de tampón FACS para enjuagar las últimas células de los filtros. A continuación, prepare dos viales de recolección, para las poblaciones positivas y negativas al anticuerpo.

Cargue cada uno con dos mililitros de medio estándar de cultivo celular, en la máquina de FACS, primero ejecute las células no marcadas y utilice los resultados para definir una compuerta negativa para el marcador fluorescente. Luego, utilizando una boquilla de 100 micrones, separe las células marcadas en sus respectivos tubos que contienen medio estándar. Si es posible, mantenga estos tubos enfriados a cuatro grados Celsius durante la separación.

Continúe cargando las células en el andamio según se describe en el protocolo escrito. Después de anestesiar al animal, corte cualquier pelo en el sitio quirúrgico y limpie la piel expuesta con solución de povidona yodada seguida de etanol al 70 %, tres veces. Luego, coloque un campo quirúrgico alrededor del animal, dejando expuesto el sitio quirúrgico.

Ahora, utilizando un escalpelo con hoja de 15, realice una incisión sagital en la línea media que se extienda sobre la mayor parte del cráneo dorsal. Luego, con pinzas de dientes finos, retire la piel del lado derecho de la incisión para exponer el hueso parietal derecho. Prepare el taladro con una broca de trepanación esterilizada de cuatro milímetros recubierta de diamante.

A continuación, realice un defecto a través del hueso parietal, pero no extienda el defecto más allá del hueso; deje intacta la capa de duramadre. Ahora, coloque un andamio que contenga células o solución control dentro del defecto y cierre la incisión cutánea con sutura de nylon continua. Luego, continúe con los protocolos de cuidado postoperatorio del ratón según se indica en el protocolo descrito en el texto.

Los escaneos de micro-TC del defecto craneal realizados el día de la cirugía muestran claramente el nuevo defecto. Los escaneos repetidos en puntos temporales posteriores muestran que los defectos sembrados con células positivas para BMPR-1B se cierran más rápidamente que aquellos con células negativas para BMPR-1B o células no clasificadas. Cuando la cicatrización se cuantifica como un porcentaje de cierre completo de la herida, la diferencia se aprecia fácilmente.

A continuación, porciones de los cráneos que contenían los defectos fueron descalcificadas y teñidas para identificar el nuevo hueso regenerado y el control del hueso mediante la pentacromía de Movat, que distingue el cartílago del hueso, así como todas las etapas de maduración intermedias. En comparación con las células no clasificadas, las células positivas para BMPR-1B tuvieron un fuerte impacto en el proceso regenerativo, más notablemente a lo largo de los bordes del defecto. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del potencial clínico que tiene este experimento, al aislar ASCs específicas del paciente y utilizarlas para sanar defectos óseos.

Se pueden derivar muchos experimentos posteriores a partir de este para responder aún más preguntas sobre la cicatrización ósea, como el uso de FACS para el aislamiento de ASCs con diferentes compromisos de linaje, micro-TC para analizar cómo diferentes tipos celulares y tejidos sanan con el tiempo, y el modelo de defecto craneal en este experimento para generar ideas para más experimentos de cicatrización ósea. No olvide que trabajar con tejido humano puede ser extremadamente peligroso. Asegúrese de tomar las precauciones adecuadas, incluyendo el uso de guantes, protección ocular y la eliminación adecuada de todos los desechos peligrosos.