Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

El objetivo general de este procedimiento es mapear el programa de sincronización de la replicación a nivel del genoma completo en una célula de elección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la replicación, como, por ejemplo, cómo cambia el programa genómico de replicación en condiciones de salud y enfermedad.

La principal ventaja de esta técnica es que constituye una forma rápida y sencilla de mapear el momento de replicación en diversas células y condiciones. La persona que redactó el procedimiento de fax sería Dan Lehmann, un experto en fax de la Facultad de Medicina. Este procedimiento generalmente comienza con al menos una o dos veces diez a la sexta células asincrónicas de crecimiento rápido.

Para células adherentes, aspire y lave cada placa con tres mililitros de PBS sin calcio ni magnesio. Deseche el PBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA comercial a cada placa. Incube las células durante cinco minutos a 37 grados Celsius hasta que se desprendan.

Añada tres mililitros de medio de cultivo para neutralizar la tripsina y recoja las células en un tubo cónico de 15 mililitros o en un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Mantenga las células en hielo. Para comenzar este procedimiento, centrifugue las células a 300 x G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Aspire y lave las células con un mililitro de PBS frío. Luego, centrifugue las células. Después del segundo lavado, retire el PBS y resuspenda las células en 250 microlitros de PBS frío.

Mientras se agita suavemente el tubo en vórtex, añada gota a gota 800 microlitros de etanol al 100 por ciento de alta pureza a menos 20 grados Celsius. Esto lleva a una concentración final de etanol del 70 al 80 por ciento. Incube las células en hielo durante 30 minutos.

Comience este procedimiento centrifugando las células fijadas a 500 x G durante diez minutos a 4 grados Celsius. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y lave las células dos veces con un mililitro de PBS frío. Centrifugue después de cada lavado.

Después del segundo lavado, aspire el sobrenadante y re suspenda cada célula con la siguiente mezcla de yoduro de propidio. Un mililitro de PBS que contiene cinco microlitros de RNAasa a diez miligramos por mililitro y 50 microlitros de yoduro de propidio a un miligramo por mililitro. Filtre la muestra a través de una malla de 35 micrómetros hacia un tubo de poliestireno de 5 mililitros.

Cierre el tubo con parafilm. Incube a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Mantenga las muestras en la oscuridad, ya que el yoduro de propidio es sensible a la luz.

Las células se clasificarán utilizando una máquina de clasificación. Utilice el láser de 561 nanómetros para diferenciar las células según su intensidad de yoduro de propidio. Para obtener resultados óptimos, use la boquilla más pequeña recomendada para el tamaño específico de la célula.

Para la mayoría de las células, es de 85 micrómetros. Utilice un flujo constante y lento. Habitualmente, hasta 300 a 500 eventos por segundo.

Mediante el uso de la selección de puertas, discrimine las células muertas y los restos subcelulares mediante la representación de FCS frente a SSC. A partir de las células viables, discrimine los dobletes representando el ancho de SSC frente a la altura de SSC, seguido de un gráfico de ancho de FFC frente a altura de FFC, y un gráfico de ancho de yoduro de propidio frente a altura de yoduro de propidio. Para las células con señal viable, dibuje un histograma de la intensidad del área de yoduro de propidio, que representa el contenido de ADN de las células.

Ordene las células en condiciones frías en las fases G1 y S. La selección para S debe ser amplia e invadir las fases G1 y G2. Mientras que la selección para G1 debe ser estrecha y estar lo más alejada posible de S.

Para algunos tipos de células, puede ser difícil obtener una distribución adecuada del ciclo celular. Es fundamental tomar la fase G1 sin células en fase S. Retire los tubos con células ordenadas de la máquina de fax.

Mantenga los tubos en hielo tras la clasificación. Tras la clasificación celular, el ADN de cada muestra se purifica utilizando un kit comercial de purificación de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, fragmente el ADN con un ultrasonicador enfocado hasta alcanzar un tamaño promedio del pico objetivo de 250 pares de bases.

Verifique el tamaño del ADN fragmentado mediante electroforesis. La distribución de tamaños recomendada es de 200 a 700 pares de bases, con un pico alrededor de las 250 pares de bases. Posteriormente, la biblioteca se prepara, secuencia y analiza según se describe en el protocolo del texto.

Se muestra un mapa de tiempo de replicación para todo el cromosoma uno de fibroblastos embrionarios de ratón. Con un enfoque más detallado en una región de aproximadamente 50 megabases. Los puntos representan la relación S/G1 normalizada para ventanas individuales, y la línea continua representa los resultados de la interpolación cúbica suavizada.

Los valores altos de S a G1 corresponden a una replicación temprana, mientras que los valores bajos corresponden a una replicación tardía. Las flechas rojas indican ejemplos de regiones con un tiempo constante de replicación, y las flechas verdes señalan regiones de transición temporal. Esta figura muestra la reproducibilidad de los mapas de tiempo de replicación entre réplicas triples de fibroblastos embrionarios de ratón, en comparación con réplicas triples de células pre-B de ratón en la misma región de 18 megabases del cromosoma uno del ratón.

Las flechas naranjas indican ejemplos de regiones diferenciales entre las líneas celulares. Un mapa de calor de las correlaciones de Spearman entre las seis muestras confirma aún más los resultados. Una vez dominada, esta técnica, desde la recolección de células hasta la generación de mapas, puede completarse en una semana si se realiza adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar mapas genómicos del tiempo de replicación para células en crecimiento.