Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX
27 de junio de 2017
Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX.
El objetivo general de este procedimiento es construir óperones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible para expresar múltiples proteínas simultáneamente. Este método puede ayudar a los investigadores en biología sintética y bioquímica, permitiéndoles construir vías de múltiples proteínas o estudiar complejos proteicos que dependen de la coexpresión mediante múltiples enfoques. La principal ventaja de esta técnica es que permite que múltiples genes sean expresados simultáneamente en Escherichia coli a partir de un único plásmido.
El procedimiento será demostrado por Mohamed Hassan, estudiante de doctorado, y Angela Thompson, estudiante de cooperación. Después de obtener y amplificar los genes de interés según el protocolo descrito, prepare las reacciones de digestión para el primer gen de interés y el factor pMGX. Utilice una reacción de 40 microlitros que contenga de 0,5 a 1,5 microgramos de ADN con la enzima indel.
Incube las reacciones a 37 grados Celsius durante una hora. Luego agregue EcoRI y permita que la digestión continúe durante una hora adicional. Se agrega NdeI antes de EcoRI para asegurar que digiera eficazmente.
NdeI es sensible a la longitud de ADN bicatenario en ambos lados del sitio de restricción. Añadirlo primero asegura que corte el plásmido circular completo. Cargue las reacciones de digestión en un gel de agarosa al 0,7 % y electroforese las muestras a 100 voltios durante 55 minutos.
Luego, con un escalpelo limpio o una cuchilla de afeitar, excise las bandas del inserto y del vector y coloque los segmentos de gel excisados en tubos de 1,5 mililitros. Utilice un kit de extracción de gel según el protocolo indicado para purificar el ADN. Prepare una reacción de ligación de 20 microlitros que contenga entre 0,15 y 0,5 microgramos de ADN del vector, la cantidad adecuada de inserto según el tamaño del gen y un microlitro de ligasa T4 de ADN.
Bajo condiciones asépticas, descongele en hielo alícuotas de 100 microlitros de células de E. coli XL1-Blue químicamente competentes durante cinco minutos. Luego, agregue cinco microlitros de las reacciones de ligación que contienen un gen de interés a las células. Incube las transformaciones en hielo durante 30 minutos.
A continuación, someta las células a un choque térmico durante 45 segundos en un baño de agua a 42 grados Celsius. Luego, coloque las transformaciones en hielo y añada 200 microlitros de medio LB frío. Deje que las células se incuben durante dos minutos.
Incube las células a 37 grados Celsius a 220 rotaciones por minuto durante una hora y siembre 100 microlitros en placas de agar LB que contengan un marcador selectivo adecuado. Para tamizar colonias en busca de posibles transformantes, compare el número de colonias en la placa de control negativo frente a las placas de ligación. Se desea una relación de recuento de colonias de uno a dos.
Seleccione cuatro a ocho colonias individuales de cada reacción de ligación para inocular 4 mililitros de LB con el antibiótico adecuado. Incube los cultivos a 37 grados Celsius y 220 rotaciones por minuto durante la noche. Con el kit de aislamiento de ADN plasmídico, purifique el ADN plasmídico según el protocolo descrito y prepare reacciones de digestión de 20 microlitros con 150 a 500 nanogramos de ADN utilizando un microlitro de cada uno de NdeI y EcoRI.
Incubar las reacciones de digestión a 37 grados Celsius durante dos horas. Para insertar el gen dos en el vector pMGX que contiene el gen uno, preparar una reacción de digestión de 40 microlitros que contenga de 0,5 a 1,5 microgramos de ADN vectorial que porta el primer gen de interés y un microlitro de AVR2. Incubar la reacción a 37 grados Celsius durante 1,5 horas antes de añadir 1,5 microlitros de fosfatasa de intestino de ternero.
Incubar durante 30 minutos adicionales. A continuación, preparar una reacción de digestión de 40 microlitros que contenga de 0,5 a 1,5 microgramos del vector pMGX que porta el segundo gen de interés. Utilizar un microlitro de AVR2 y xpol.
Incube la reacción a 37 grados Celsius durante dos horas. Someta los digestivos de restricción a electroforesis en un gel de agarosa al 0,7 %. Utilice una goma de borrar limpia para excavar las bandas del inserto y del vector como se demostró anteriormente.
Después de extraer el ADN plasmídico y cuantificar la muestra según el protocolo descrito, prepare una reacción de ligación utilizando una proporción de 3:1 de inserto respecto al vector del gen 2 y pMGX-yfg1. Incluya un control negativo utilizando solo pMGX-yfg1. Transforme cinco microlitros de cada reacción en células XL1-Blue como se demostró anteriormente.
Luego, compare el recuento de colonias en las placas de control negativo y de ligación. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, revise el tratamiento con CIP. Seleccione cuatro a ocho colonias individuales de la reacción de ligación y utilice cada colonia para inocular cuatro microlitros de LB más el antibiótico adecuado.
Crecer a 37 grados Celsius y 220 rotaciones por minuto durante la noche. Después de aislar y cuantificar el ADN plasmídico como antes, seleccione los clones con inserción eficaz del segundo gen mediante una reacción de digestión que contenga entre 150 y 500 nanogramos de ADN y un microlitro de EcoRI. Incube las reacciones a 37 grados Celsius durante dos horas.
Se recomienda EcoRI para fines de cribado, pero en algunos casos, EcoRI puede generar dos o más insertos de tamaño similar que son difíciles de distinguir en un gel. Para asegurar el éxito, se debe utilizar una enzima de digestión por restricción alternativa, como NdeI. Separe las reacciones de digestión en un gel de agarosa, buscando una banda que corresponda al tamaño del gen insertado 2.
Clone genes adicionales en el plásmido según el protocolo descrito. Para generar el plásmido policistrónico, los cinco genes se clonaron primero en un plásmido adecuado, pMGX A. Esta figura muestra pCR-Blunt-yfg1 y pCR-Blunt-yfg2 en el plásmido pMGX A, así como pMGX A digerido con indel y EcoRI. Para clonar los dos primeros genes en pMGX A, el plásmido se digirió con indel y EcoRI.
Después de la clonación, los vectores pMGX-yfg1 y pMGX-yfg2 fueron digeridos con AVR2 y xpol para confirmar que se obtuvieron clones exitosos. Esta figura muestra el vector pMGXyfg1 digerido con AVR2 y el vector pMGX-yfg2 digerido con AVR2 y xpol para aislar el gen de interés dos. El fragmento resultante fue clonado en pMGX-yfg1 para crear el vector pMGX-yfg1 dos.
Como se observa aquí, la digestión de pMGX-yfg1 número dos con EcoRI confirmó el clonado exitoso del gen de interés número dos en pMGX-yfg1. Esta imagen de gel demuestra la diferencia entre plásmidos digeridos que tenían el inserto en la orientación correcta o en orientación inversa. Un inserto en orientación inversa tendría dos sitios EcoRI en proximidad cercana, haciendo que los fragmentos resultantes de 50 pares de bases fueran indetectables en el gel y que el fragmento principal fuera más grande.
Finalmente, tras generar un vector de expresión policistrónico de cinco genes, un inmunotransferencia western de las proteínas expresadas confirma que las cinco proteínas fueron expresadas a partir de un único vector. Tenga en cuenta que la proteína producida por yfg5 tiene el mismo tamaño que yfg1 y no se separa en el gel. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en tres o cuatro días por cada gen insertado en el andamio pMGX si se realiza correctamente.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar tratar y linealizar el vector con una fosfatasa como la fosfatasa de intestino de ternero para desfosforilar los extremos cinco del vector. Tras este procedimiento, se pueden llevar a cabo experimentos adicionales, como la expresión multigénica in vivo, con el fin de caracterizar y aprovechar vías biosintéticas para la producción de productos naturales o para estudiar complejos proteína-proteína. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología sintética produjeran carbohidratos complejos y E. coli genéticamente modificadas.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar el sistema de expresión multigénica en E.coli.
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Descripción general
Este estudio describe métodos para la coexpresión mediada por T7 de múltiples genes a partir de un único plásmido en Escherichia coli utilizando el sistema de plásmidos pMGX. La técnica permite a los investigadores construir operones sintéticos multigénicos para la expresión simultánea de proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Sintética
- Bioquímica
- Ingeniería Genética
Antecedentes
- El sistema de ARN polimerasa T7 se utiliza ampliamente para la expresión génica.
- La coexpresión de múltiples proteínas es fundamental para estudiar complejos proteicos.
- Escherichia coli sirve como huésped común para la expresión de proteínas.
- El uso de un solo plásmido para múltiples genes simplifica el proceso de clonación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para expresar múltiples genes simultáneamente.
- Facilitar la construcción de vías de múltiples proteínas.
- Mejorar el estudio de interacciones y complejos proteicos.
Métodos Utilizados
- Amplificación de genes de interés.
- Preparación de reacciones de digestión para los genes y el plásmido pMGX.
- Uso de enzimas indel para la manipulación del ADN.
- Demuestración del procedimiento por miembros del laboratorio.
Resultados principales
- Coexpresión exitosa de múltiples genes en E. coli.
- Demuestra la eficiencia del método en la producción de proteínas.
- Aplicaciones potenciales en biología sintética y bioquímica.
- Ilustración del proceso mediante una demostración de laboratorio detallada.
Conclusiones
- El método de coexpresión mediado por T7 es efectivo para la expresión de múltiples genes.
- Esta técnica puede avanzar la investigación en complejos proteicos.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones adicionales en biología sintética.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La coexpresión eficiente de múltiples proteínas es fundamental para la biología sintética, la ingeniería de vías metabólicas y el estudio de complejos proteicos en la investigación farmacéutica y biotecnológica&D. El sistema pMGX mediado por la ARN polimerasa T7 inducible permite la expresión simultánea de varios genes a partir de un único plásmido en E. coli, agilizando el ensamblaje y la validación funcional de módulos biosintéticos complejos. Esta capacidad permite la prototipificación rápida y la reducción de riesgos de sistemas biológicos multicomponentes en puntos clave de descubrimiento y preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis de vías multigénicas e interacciones proteína-proteína en un sistema controlado.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos al permitir la validación funcional de operones sintéticos complejos.
- Apoya la confianza predictiva en estudios de ensamblaje de vías y de interacción con dianas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara sistemas validados de expresión multienzimática para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Mejora la reproducibilidad del ensayo mediante la normalización de la coexpresión a partir de un único vector.
- Posibilita plataformas escalables y reutilizables para evaluar variantes de rutas metabólicas o complejos proteicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con las estrategias de biomarcadores traslacionales al permitir la expresión de módulos multienzimáticos relevantes para la enfermedad.
- Facilita la continuidad desde el diseño de rutas sintéticas hasta la validación preclínica en sistemas microbianos.
- Reduce el riesgo al avanzar rutas modificadas para aplicaciones terapéuticas o productivas.
Integración de la Canalización y del Flujo de Trabajo
El sistema pMGX se integra en el continuo de descubrimiento desde el diseño inicial en biología sintética hasta la identificación de rutas líderes y la validación preclínica en E. coli.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir el ensamblaje y expresión rápidos de constructos multigénicos.
- Selección: Proporciona sistemas multiproteicos reproducibles y listos para ensayos, para estudios funcionales e interacciones.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos de expresión proteica, confirmados mediante blot de western y análisis de restricción, para comparar configuraciones de vías.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad preclínica de módulos biosintéticos diseñados con fines terapéuticos o productivos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma modular y estandarizada, adaptable a diversos proyectos de biología sintética e ingeniería de proteínas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en estudios de vías multigénicas.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de expresión de múltiples proteínas.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas de avance/no avance y un avance eficiente en el uso del capital de sistemas biológicos complejos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y progresión ajustada al riesgo de iniciativas de biología sintética e ingeniería de proteínas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular, digestión con enzimas de restricción y transformación microbiana.
- Necesita acceso a instrumentación estándar de biología molecular y herramientas analíticas como electroforesis en gel y transferencia tipo Western.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de clonación y cribado para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos conjuntos de genes y diseños de vías metabólicas dentro de sistemas de expresión en E. coli.
- Depende de una selección cuidadosa de enzimas y de la preparación del vector para asegurar la orientación y expresión correctas del gen.
