Inmunohistoquímica en secciones de parafina de la epidermis del ratón Utilizando anticuerpos fluorescentes

En la epidermis. La inmunohistoquímica es un medio eficiente para localizar proteínas específicas en su compartimento de expresión. En este vídeo, demostramos un método fiable para la inmunolocalización de proteínas en la epidermis, que utilizamos de forma rutinaria en nuestro laboratorio.

Hola, soy Tammy del Laboratorio del Dr. Turin aquí en el edificio bajo del Instituto de Investigación de Salud de Ottawa en el programa de enfermedades crónicas. Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos fluorescentes en secciones de tejido incluidas en parafina de la epidermis de ratón. En nuestro laboratorio, hemos optimizado los protocolos para la inmunolocalización de marcadores de diferenciación epidérmica utilizando tejido fijo de BO'S.

Como parte de la optimización, mantenemos la piel plana colocándola sobre una toalla de papel antes de fijarla. Este procedimiento implica la disección de la epidermis, la fijación, la deshidratación, la inclusión de parafina y el corte de la sección, el encerado, la rehidratación, el desenmascaramiento de antígenos, el marcaje de anticuerpos y, finalmente, el montaje y la visualización con epifluorescencia. Así que comencemos.

Cuando se utilizan ratones neonatos, no es necesario afeitar la piel de la espalda. Sin embargo, cuando tienes ratones mayores que tienen pelaje, debes afeitar la piel de la espalda para que no se interponga en el camino de cortar las secciones. Cuando hagas la disección, debes tener mucho cuidado de no colocar las pinzas en las áreas de la piel que quieras usar para el ensayo.

Entonces, lo que hacemos es simplemente colocar las pinzas alrededor del borde de donde vamos a cortar, y luego levantas con mucho cuidado, cortas la epidermis, recordando no tocar el área que quieres usar para tu experimento. Cuando estamos arreglando la piel, no queremos que la piel se enrolle y quede en el tubo. Queremos que sea bonito y plano.

Entonces, lo que hacemos para ayudar a eso es colocar la piel sobre una toalla de papel para que permanezca plana mientras se fija. Así que ahora que tenemos la piel bonita y plana sobre la toalla de papel, lo que hacemos es cortar los bordes o recortarlos para eliminar las partes que podamos haber dañado con las pinzas. Y luego cortas la piel en pedazos muy pequeños, de unos dos milímetros por dos milímetros.

Ahora se va a arreglar el tejido. Después de cortar la piel en trozos manejables, la sumerges en la solución de boína. Tape los tubos, envuélvalos con perfil y colóquelos en un balancín.

Para una incubación nocturna, es importante incubar en la solución de boin solo de 16 a 18 horas. Los períodos de fijación más cortos o más largos dañarán el tejido. La incubación ha terminado.

Se enjuaga el pañuelo con PBS y luego se realiza una serie de lavados con etanol con 30%, 50% y 70% de alcohol. Puedes ver que el BO es de color amarillo y que a medida que haces los lavados, a medida que las bendiciones se diluyen, el color del lavado se vuelve cada vez menos amarillo. Se lava dos veces y 30 minutos cada vez.

Después del último lavado en etanol, las muestras se colocan en un etanol fresco al 70% y pueden almacenarse a cuatro grados centígrados hasta que se procesan algunos respiraderos de parafina. Incrustación. El uso excesivo de tejidos congelados hace que la integridad del tejido sea superior y las muestras se puedan almacenar durante largos períodos de tiempo. En general, las instalaciones centrales generan resultados más reproducibles.

Sin embargo, si tiene las instalaciones y un operador dedicado que tenga la experiencia, las secciones se pueden cortar internamente. Aprender a cortar buenas secciones es más bien una forma de arte. Por lo tanto, utilizamos una instalación central.

Después de recibir las diapositivas de la instalación central, puede ver que la parafina está presente en las diapositivas. Como una película delgada, los portaobjetos se colocan en una rejilla envuelta con papel de aluminio, como una papa horneada y se incuban durante cinco minutos a 55 grados. Una vez finalizada la incubación, desenvuelva rápidamente los portaobjetos y colóquelos en tolueno durante tres lavados de cinco minutos.

Es muy importante recordar que estas lavadoras de cinco minutos deben estar bien sincronizadas, incubar demasiado tiempo y el tolueno no será bueno para sus muestras. Después de los tres lavados y el tolueno, haga un enjuague rápido con etanol al cien por cien. Dado que el etanol y el tolueno forman un precipitado que interferirá con su experimento, este es un paso muy importante para recordar.

A continuación, las muestras se rehidratan incubando portaobjetos, cinco minutos en etanol al 95%, cinco minutos en etanol al 70% y luego dos veces cinco minutos en agua. En este punto, los tejidos se pueden procesar para teñirlos con h y e. También utilizamos la instalación central para este propósito.

Para el desenmascaramiento de antígenos, 500 milésimas de pulgada de tampón de citrato de un solo uso en un vaso de plástico de un litro y sumerja sus portaobjetos. Recuerde quitar el mango de metal y poner su vaso de precipitados en el microondas. Cocine en el microondas a alta potencia durante dos veces cinco minutos.

Recuerde abrir la puerta para enfriar el microondas entre sus dos incubaciones. Una vez que hayas terminado de calentar en el microondas, retira los portaobjetos del tampón de citrato hirviendo y colócalos en un plato para tinturas que contenga agua tibia. Solo usamos agua tibia del grifo y el propósito de esto es enfriar lentamente sus portaobjetos desde que hiervan hasta la temperatura ambiente.

Ahora puede lavar los portaobjetos tres veces y cinco minutos en PBS y estamos listos para comenzar con la inmunohistoquímica. Lo primero que debemos hacer para comenzar la inmunotinción es secar el área alrededor de nuestros especímenes con un trozo de papel de seda. Para evitar la contaminación cruzada de anticuerpos, demarcamos el área alrededor de nuestras muestras con un bloqueador líquido.

Prepare una cámara humidificada colocando un papel de filtro en una placa de Petri. Remójalo con agua, retira el exceso de agua e inserta tus portaobjetos. La razón por la que utilizamos una cámara humidificada es para asegurarnos de que durante nuestros períodos de incubación nuestros portaobjetos no se sequen.

Es muy importante que las diapositivas no se sequen porque el dibujo aumentará tu fondo. Los portaobjetos se bloquean en este momento con un tampón de incubación durante 30 minutos. Después de bloquear, transfiera sus portaobjetos nuevamente a la rejilla de portaobjetos e incube en el tampón de lavado.

Retire el exceso de búfer tal como lo hizo antes. Vuelva a colocar el portaobjetos en la cámara humidificada e incube con el anticuerpo primario durante una hora. A temperatura ambiente.

Cuando termine la incubación de una hora, vuelva a colocar los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y lávelos con tampón de lavado durante tres veces y 10 minutos. Después de los lavados, retira el exceso de tampón de lavado alrededor de la muestra con un pañuelo de papel. Vuelva a colocar los portaobjetos en la cámara humidificada e incube durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario después de incubar con anticuerpo secundario, lavar en tres cambios de tampón de lavado de 15 minutos cada uno.

A continuación, lavamos tres veces cinco minutos. En PBS, elimine cualquier exceso de líquidos que rodee la muestra y limpie el PBS de la parte posterior del portaobjetos para montar los deslizamientos de cubierta en el portaobjetos. Usamos móvil con 2.5%DAB co.

Para reducir el desvanecimiento, agregue 80 microlitros de gota a gota a los portaobjetos. Teniendo cuidado de no introducir ninguna burbuja. A continuación, baje muy lentamente sobre un cubreobjetos.

Teniendo cuidado de no dejar burbujas. Las burbujas son malas porque a menudo aterrizan justo en tu espécimen, justo donde quieres tomar tus fotos después de que tu móvil esté seco. Ahora estás listo para empezar Mira tus diapositivas.

Aquí hay un vistazo a una tinción exitosa con un filtro FITC. En un objetivo de 20x, vemos a Clain seis asociado a todas las capas superbasales de la epidermis. Nuestro laboratorio está muy interesado en la expresión y localización de claudinas en la epidermis.

Con respecto a las uniones estrechas y la formación de la barrera de permeabilidad epidérmica, acabamos de mostrarle cómo realizar la inmunohistoquímica en la piel del ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que desea que las secciones de tejido sean planas y que debe asegurarse de que los portaobjetos no se sequen entre incubaciones. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.