Name: La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprende a disecar tejido gonadal de larvas de Danio rerio a partir de los 17 días post-fertilización. Este protocolo permite analizar propiedades moleculares para estudiar la diferenciación sexual en pez cebra.

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Agradecemos a C Zhang para el cuidado de los peces. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31171074, 31371099 y 31571067 a GP) y por el Proyecto Talento Pujiang (09PJ1401900 a GP).

experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan. El pez cebra se plantearon y criado de acuerdo con procedimientos estándar de 20. 1. Preparativos <ol><li> Cultivar 17 dpf y 25 dpf larvas de pez cebra <ol><li> Transfer 2 hombres y 2 mujeres adultos de pez cebra (sana, de 3 a 6 meses de edad, de laboratorio AB strain) a un tanque de cruce en la tarde antes del día de travesía. Separar los machos y las hembras con una barrera. A la mañana siguiente, refrescar el agua del tanque y eliminar la barrera para que puedan aparearse. Recoger los huevos en 100 mm placas de Petri de 1 a 2 horas después de la fertilización. </li><li> Mantener aproximadamente 40 embriones en una placa de 100 mm con 40 ml de medio de embrión (EM) a 28,5 ° C durante el período de desarrollo de la primera (4 días) y actualizar la EM dos veces al día. Transferencia de las larvas a 1 tanques de L (40 larvas a 300 ml de agua del sistema) y alimentar con rotíferos vivos (suministro completo, dos veces al día) después de 5 dpf.Alimentar artemia viva en lugar de la dieta de rotíferos después de 10 dpf. Transferir el pescado en recirculante sistema de agua a 14 dpf 21. </li><li> Elevar larvas de pez cebra en el sistema de recirculación de agua hasta 17 dpf o 25 dpf. Asegúrese de que el ciclo de luz / oscuridad es 14/10 h y pH valor de agua del sistema es de aproximadamente 7,2. Medir la longitud corporal de 17 dpf (5.5 hasta 6.8 mm) y 25 dpf (8 a 11 mm) larvas 22. </li></ol></li><li> Preparar 2% placas de agar para la disección. <ol><li> Añadir 4 g de agar a 200 ml de agua estéril. Calentar la mezcla en un horno microondas hasta que se vuelve transparente. </li><li> Se enfría la solución de agar durante aproximadamente 15 min, luego se vierte en 60 mm de diámetro placas de Petri (aproximadamente 1/3 de volumen de la placa). Almacenar las placas de agar solidificado a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo 1: diseccionar el tejido gonadal de 17 y 25 dpf larvas <ol><li> Añadir hielo picado en el tanque para anestesiar a 17 larvas dpf. la transferencia de lalarvas anestesiado a un 100 mm refrigerados placa de Petri con una solución de 30 ml de Ringer frío. Mantener el pescado se incubaron en la solución de Ringer enfriada durante al menos 15 min para anestesiar completamente las larvas. </li><li> Transferir las larvas a una placa de agar previamente enfriada con una pequeña cuchara de plástico. Sumergir todo el cuerpo de los peces en 10 ml refrigerados solución de Ringer y suavemente ponerla en su lado. </li><li> Realizar las siguientes operaciones bajo el campo de visión del microscopio estereoscópico 25X. Sujetar el cuerpo del pez con pinzas para la estabilización. Rip el abdomen longitudinalmente desde el ano hasta el corazón con otro par de pinzas. eliminar suavemente la piel y los músculos de un lado del cuerpo para exponer los órganos internos. </li><li> Retire la masa de órganos ventrales a la vejiga natatoria con cuidado. Evitar daños en la gónada unido a la vejiga natatoria. </li><li> Cortar la conexión entre la vejiga natatoria y la parte anterior del cuerpo. Tire de toda la vejiga natatoria y el tejido gonadal suavemente. NOTA: En la mayoría de casoss, el tejido gonadal en 17 dpf contiene tejido circundante epitelial y protonephridium. Ellos no se separan fácilmente unos de otros, pero a 25 dpf que se pueden separar fácilmente. La gónada también está conectado con el ano. Una unión con las gónadas izquierda y derecha conectadas entre sí en el ano será claramente visible. </li><li> Use pinzas para separar cuidadosamente el tejido gonadal de la vejiga natatoria y limpiar los tejidos adiposos de los alrededores. </li><li> Transferir inmediatamente el tejido gonadal aislado a un tubo de centrífuga preenfriado 1,5 ml que contenía la solución de 200 l Ringer. Mantenga el tubo en hielo hasta que todos los tejidos gonadales se separan de las larvas. </li><li> Diseccionar las gónadas de 25 dpf larvas como se describe en los pasos 2.1 - 2.7. </li></ol> 3. Protocolo 2: analizar la expresión génica de los tejidos gonadales aislados <ol><li> Extraer el ARN total de los tejidos gonadales larvales. <ol><li> La transferencia de los tejidos gonadales aislados a un nuevo libre de RNasa 1.5 ml tubo y remover la solución de Ringer. Añadir 100 l solución de lisis. Vortex hasta que los tejidos están completamente lisadas. </li><li> Realice el procedimiento de extracción de RNA total de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Añadir 1/10 volumen de 10x DNasa I buffer y 1 l de DNasa I a la solución de ARN y mezclar suavemente. Incubar durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Añadir reactivo DNasa inactivación 1/10 de volumen a la solución de ARN. Incubar durante 10 min a 70 ° C. Medir la concentración del ARN total usando un espectrofotómetro. Almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Realizar la síntesis de ADNc de primera cadena <ol><li> Utilice un oligo (dT) primer enlazador para llevar a cabo la síntesis de primera cadena de ADNc siguiendo el protocolo del fabricante. Añadir 1 a 2 g de ARN hasta un volumen total de reacción de 20! L. </li><li> Incubar la solución de reacción durante 90 min a 45 ° C. Terminar la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Añadir 1 l de RNasa H a la cDNA tanlución para eliminar el ARN residual. Mezclar suavemente y centrifugar durante 10 s a ~ 13.000 x g. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Añadir 20 l de agua libre de nucleasa. Almacenar a -70 ° C. </li></ol></li><li> Realizar PCR cuantitativa fluorescente <ol><li> Realizar qPCR en un sistema ciclador con un colorante fluorescente. Use las siguientes condiciones de ciclado de PCR: 35 ciclos a 95 ° C durante 15 s, Tm-5 ° C durante 15 s, 68 ° C durante 30 s. Utilice secuencias de los cebadores de la siguiente manera: AMH (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) y β-actina (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El pez cebra se ha convertido en un modelo de gran alcance y se utiliza ampliamente en el desarrollo y la investigación relacionada con la enfermedad. Los métodos para el aislamiento de los órganos en el pez cebra adultos, tales como cerebro, corazón, gónadas, y el riñón, se han documentado bien 23, 24, 25. Debido al pequeño tamaño y remodelación dinámica de los tejidos gonadales en el larvas de pez cebra, el aislamiento de tej...

El principal determinante del sexo femenino en salvaje cromosoma pez cebra 4 se pierde o se modifica en el pez cebra domesticado (es decir, las cepas de laboratorio comunes) 1. En cambio, tienen un sistema de determinación del sexo poligénica acompañado por factores ambientales como la temperatura, la hipoxia, la disponibilidad de alimentos y la densidad de población. Los mecanismos detallados del desarrollo sexual del pez cebra no se entienden completamente. Las preguntas fundamentales tales como cuando se produce la determinación del sexo de pez cebra, lo que es la señal de la determinación del sexo primario (s) / son, y que los genes regulan la primera etapa de transformación gónada siguen sin respuesta 2, 3. En el proceso del desarrollo sexual de pez cebra, varias etapas importantes han sido reconocidos. En la etapa temprana de desarrollo, a partir de 4 hpf (horas después de la fecundación) germinales células primordiales (PGCs) someterse especificación, la migración a cresta genital yproliferación. Números PGC y las interacciones recíprocas entre las células germinales y las células somáticas son importantes para la diferenciación de las gónadas 4. A los 13 dpf (días después de la fertilización), las gónadas están en la etapa indiferenciada. Por 17 dpf, las gónadas se desarrollan en los ovarios bi-potenciales en las hembras y los machos futuras. La transición apoptosis dependiente de ovario al testículo comienzan a las 21 a 25 dpf y puede continuar durante varias semanas. Por 35 dpf, el sexo de la gónada se ha determinado y la producción de gametos específico del sexo está en marcha en ambos ovarios y testículos 5, 6, 7. Hasta la fecha, se han propuesto diversos genes y mecanismos de determinación del sexo candidatos. Proteómica y análisis transcriptomic han aislado muchos genes con expresión dimorfismo sexual y estos genes se han utilizado para estudiar la diferenciación sexual en el pez cebra 8, </sup&gt; 9, 10. Por ejemplo, en larvas de pez cebra, el gen cyp19a1a se expresa específicamente en el ovario pero no en el testículo 11, 12. Además, el gen AMH se expresa débilmente en las células del folículo de la granulosa de ovarios, pero fuertemente en los testículos células de Sertoli 13. En contraste, el gen vasa se expresa continuamente en las células germinales de ambos pez cebra hembra y macho, por lo que es un marcador gónada adecuado 14, 15. Investigando gonadales niveles de expresión génica es fundamental para comprender el mecanismo molecular de la determinación del sexo y diferenciación especialmente en la etapa de ovario bi-potencial 3, 9. Sin embargo, el pequeño tamaño de larvas de pez cebra y correspondientemente pequeñas gónadas complicar el aislamiento de gónadal de tejido para análisis molecular más. Estudios previos utilizados diseccionaron región del tronco entero entre los opérculos y poro anal 16. Esta preparación, aunque gónadas contienen, consiste en múltiples tejidos y órganos. Alternativamente, los animales transgénicos con la expresión de GFP-gónada específica tales como vasa: EGFP se utilizaron para el aislamiento de tejido gonadal a través de células activadas por fluorescencia (FACS) y captura por láser micro-disección 17, 18. Sin embargo, su aplicación generalizada es limitado. A continuación, describimos un procedimiento simple para aislar el tejido gonadal de larvas de pez cebra a las 17 dpf y 25 dpf. Se demuestra la posición de las gónadas con respecto a otros órganos y aislar las gónadas morfológicamente intactas de los tejidos circundantes. Además, muestran los genes-gónadas específicos tales como vasa y cyp19a1a son altamente expresado en las gónadas aisladas en comparación con el tejido del tronco a través de PCR cuantitativa (qPCR) análisis. El presente protocolo permite la identificación, aislamiento, purificación de ARN y amplificación de genes específicos gonadales de larvas de pez cebra, permitiendo de este modo posterior análisis molecular de tejido gonadal 19.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo celular 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para la incubación de embriones</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Para 1 L necesario: añadir 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl y 2,9 g de CaCl&#183; 2H2O; luego agregue 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anhidro y 4,9 g de MgSO4&#183; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Diluido 20x EM en agua destilada</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>Para la preparación de las placas de agar al 2%</td></tr><tr><td>Trizol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Para el aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Medidor de vidrio</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Para preparar las placas de agar al 2%</td></tr><tr><td>Horno microondas</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>Para calentar el AGAR</td></tr><tr><td>Pinza DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>Para disección</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Para disección</td></tr><tr><td>Equipo de agua pura</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' </td><td></td><td></td><td>Para necesitar 1 L: Añadir 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 y 1,19 g de Hepes; luego llenar hasta 1 L; Ajuste el pH a 7.2. Esterilizar por filtración y guardar en un recipiente de policarbonato transparente esterilizado en autoclave.</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Baño metálico</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Modelo GL-150</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>Para centrífuga de fotomicrografía</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN a microescala</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Para el aislamiento de ARN de tejidos gonadales</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Para la digestión de ADN en la solución de ARN</td></tr><tr><td>RevertAid Kit de síntesis de ADNc de primera hebra</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Para la síntesis de ADNc de primera cadena</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Para digerir el ARN residual en la solución de ADNc.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Este producto es una mezcla maestra 2x basada en ADN polimerasa Taq para PCR en tiempo real y aplicable para ensayos de intercalación con SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Medición de la concentración del ARN total</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>Perfil de expresión génica</td></tr></tbody></table>

la disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Aunque el pez cebra salvaje poseen un sistema de determinación del sexo / ZW ZZ, pez cebra domesticado han perdido el cromosoma sexual. Ellos utilizan un sistema de determinación del sexo poligénica, donde varios genes distribuidos en todo el genoma determinar colectivamente las identidades sexuales de peces individuales. Actualmente, los genes implicados en la regulación del desarrollo de las gónadas y cómo funcionan siendo difícil de alcanzar. Normalmente, el aislamiento de tejido gonadal es el primer paso para examinar los procesos de desarrollo de sexo. A continuación, presentamos un procedimiento para aislar el tejido gonadal de 17 dpf (días después de la fertilización) y 25 dpf larvas de pez cebra. El tejido gonadal aislado puede ser examinada posteriormente por la morfología y la expresión de genes de perfiles.

Las disecciones de las gónadas se realizaron en AB strain larvas de pez cebra. La figura 1 muestra de tejido gonadal típico de larvas de pez cebra a las 17 dpf y 25 dpf. En primer lugar, la piel y los músculos de un lado del abdomen se corta para exponer los órganos internos. Después de retirar la masa de los órganos internos, la vejiga natatoria, junto con la gónada permanecen en el maletero. La gónada estaba unido a la parte ventral de vejiga natatoria (fl...

Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de tejido gonadal de larvas de pez cebra, que facilitará las investigaciones de la diferenciación sexual de pez cebra y el mantenimiento.

La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar el tejido gonadal de larvas de pez cebra y analizar las propiedades moleculares del tejido aislado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo sexual del pez cebra, como la conservación de genes en la regulación del desarrollo gonadal y los fundamentos moleculares del desarrollo sexual del pez cebra. La principal ventaja de esta técnica es que los tejidos gonadales de larvas de pez cebra tan tempranas como 17 días tras la fertilización pueden ser diseccionados para evaluar su estado celular y biológico molecular.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al pequeño tamaño y a la remodelación dinámica de los tejidos gonadales en el pez cebra larvario. Para prepararse para la disección gonadal, transfiera dos peces cebra adultos macho y dos hembras a cada lado de un tanque de apareamiento dividido. A la mañana siguiente, renueve el agua del tanque y retire la barrera para iniciar el apareamiento.Una a dos horas después de la fertilización, recolecte y transfiera aproximadamente cuarenta huevos a una placa de 100 milímetros con 40 mililitros de medio de embrión, o EM. Incube los embriones a 28,5 grados Celsius durante cuatro días, renovando el EM dos veces al día. Tras la incubación, transfiera las larvas a tanques de un litro. A los cinco días posteriores a la fertilización, o DPF, alimente a los peces con rotíferos vivos.Cuando las larvas alcancen los diez días post-fecundación (DPF), alimente a los peces con Artemia salina viva. Luego, a los 14 DPF, transfiera los peces a un sistema de agua de recirculación. Eleve las larvas de pez cebra hasta los 17 o 25 DPF.Luego mida la longitud del cuerpo de las larvas a los 17 y 25 DPF. Prepare placas de agar al dos por ciento para disección agregando cuatro gramos de agar a 200 mililitros de agua estéril. Caliente la mezcla en un microondas hasta que se vuelva transparente.Enfríe el agar durante 15 minutos, luego viértalo en placas de Petri de 60 milímetros de diámetro. Almacene las placas de agar solidificadas a cuatro grados Celsius. A las larvas de 17 DPF anestesiadas, añada hielo picado en el tanque.Transfiera las larvas anestesiadas a una placa de Petri de 100 milímetros enfriada con 30 mililitros de solución fría de Ringer. Incube los peces en la solución de Ringer enfriada durante al menos 15 minutos para anestesiar completamente las larvas. Con una cuchara de plástico, transfiera las larvas a una placa de agar preenfriada.Sumerja todo el cuerpo del pez en diez mililitros de solución de Ringer fría y colóquelo suavemente de lado. Bajo un microscopio estereoscópico, a 25x de aumento, use pinzas para sujetar el tronco del pez y estabilizarlo. Luego, con otro par de pinzas, abra longitudinalmente el abdomen desde el ano hasta el corazón.A continuación, retire suavemente la piel y los músculos de un lado del cuerpo para exponer los órganos internos. Luego, retire con cuidado los órganos masivos situados ventralmente al gas intestinal. Evite dañar la gónada adherida al gas intestinal.Corte la conexión entre la vejiga natatoria y el cuerpo interno. Luego, extraiga cuidadosamente la vejiga natatoria junto con el tejido gonadal. Con pinzas, separe cuidadosamente el tejido gonadal de la vejiga natatoria.Y limpie el tejido adiposo circundante. Transfiera inmediatamente el tejido gonadal aislado a un tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de solución de Ringer. Mantenga el tubo sobre hielo hasta que todos los tejidos gonadales hayan sido separados de las larvas.Para extraer ARN total del tejido gonadal larval, transfiera las gónadas aisladas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros libre de RNasas y elimine la solución de Ringer. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de lisis y vortexee el tubo hasta que el tejido se lice por completo.Después de realizar una extracción de ARN total, según las instrucciones del fabricante, agregue un décimo del volumen de tampón de DNasa I y un microlitro de DNasa I a la solución de ARN, y mezcle suavemente el contenido del tubo. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, agregue un décimo del volumen del reactivo de inactivación de DNasa a la solución de ARN.Incube la muestra a 70 grados Celsius durante diez minutos. Luego, utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de ARN total. Para realizar la síntesis de la primera cadena de ADNc, use un cebador enlazador con oligo-dT y uno a dos microgramos de ARN, siguiendo el protocolo del fabricante.Incube la reacción a 45 grados Celsius durante 90 minutos. Luego, detenga la reacción calentando la muestra a 70 grados Celsius durante cinco minutos. Añada un microlitro de RNasa H a la solución de ADNc para eliminar el ARN residual.Mezcle suavemente el contenido del tubo y centrifugue la muestra a aproximadamente 13.000 ×g durante diez segundos. Incube el tubo a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Luego, agregue 20 microlitros de agua libre de nucleosomas a la muestra.Y almacene el ADNc a 70 grados centígrados bajo cero. Finalmente, utilice un colorante fluorescente para realizar la PCR cuantitativa con los cebadores y condiciones indicados en el protocolo del texto. Esta figura muestra el tejido gonadal típico de pez cebra larval a los 17 DPF.El gonad está unido al lado ventral de la vejiga natatoria, como se observa aquí. A los 17 DPF, las larvas contienen los gonados izquierdo y derecho, que son translúcidos. En la mayoría de los casos, los gonados están rodeados por tejido epitelial y protonefridio.A los 25 DPF, la gónada suele estar rodeada por tejido adiposo, y pueden observarse gónadas grandes o pequeñas. Finalmente, para analizar las propiedades moleculares del tejido gonadal aislado, se examinaron mediante QPCR los niveles de expresión de los marcadores gonadales amh, cyp19a1a, nanos3 y vasa. Los resultados muestran aumentos significativos en los genes marcadores en el tejido gonadal en comparación con el tejido control.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proporcionar condiciones de cría constantes para las larvas de pez cebra, ya que es fundamental para obtener los resultados esperados. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo sexual exploraran los mecanismos de determinación del sexo del pez cebra.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar tejidos gonadales de peces cebra larvales.

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Research

Investigación

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