Name: La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la neuritis óptica y la inflamación cerebral en ratones con EAE mediante bioluminiscencia e infrarrojo cercano. Esta técnica permite evaluar la progresión de la esclerosis múltiple y la eficacia terapéutica en tiempo real.

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Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) y el programa de financiación de la investigación &quot;Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) del Estado de Hessen, Centro de Investigación de Medicina Traslacional y Farmacología TMP y el Else Fundación Kröner-Fresenius (EKFS), Grupo de Investigación de Formación de Investigación traslacional Innovación - Pharma (TRIP).

1. EAE inducción en SJL / J Mice <ol><li> Ratones <ol><li> Utilice SJL ratones hembra de 11 semanas de edad / J y permitir que se habitúan a la sala de experimentación durante unos 7 días. Use n = 10 ratones por grupo. </li><li> Para la evaluación de los efectos de la medicación, para administrar el fármaco y el placebo para el grupo control de forma continua a través del agua de bebida o a través de gránulos de comida a partir de 3 o 5 días después de la inmunización (n = 10 por grupo). Durante el pico de la enfermedad, administrar medicamentos o placebo con leche o 3% de copos de maíz remojadas en agua de azúcar. </li></ol></li><li> material de la inmunización <ol><li> Utilice un kit de la inducción de EAE que consiste en antígeno (péptido de la proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsión) en una emulsión con adyuvante completo de Freund (CFA, muertos por calor-Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) y 2 viales (5 mg cada uno) de la toxina pertussis liofilizado (PTX). </li><li> Disolver la PTX (2 mg / ml) en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS; es decir, &lt;/ Em&gt; añadir 1,5 ml de PBS a cada tubo PTX, mezclar bien, retirar con la misma punta de la pipeta, y añadir a 1 ml de PBS en un tubo de 50 ml); mezclar bien. </li></ol></li><li> Inmunización <ol><li> Inyectar PLP / CFA subcutáneamente en 2 porciones, cada 100 l, tanto en la base de la cola. No se inyecte en la parte posterior del cuello, porque las reacciones inmunes en la piel en la parte superior trasera del cuello o perturbarán la imagen de la cabeza y la médula espinal. </li><li> Inyectar 100 l de PTX por vía intraperitoneal (ip), dos veces por ratón, la primera 1-2 h después de la inmunización y la segunda en 24 h. </li><li> A los ratones de control, inyección de CFA sin PLP (2 porciones de 100 l), además de PTX sin PLP. </li></ol></li><li> Ratón manipulación después de la inmunización <ol><li> Pesar los ratones cada dos días hasta el día 7, y luego pesarlos todos los días. NOTA: Los ratones pierden aproximadamente 1 - 2 g de peso corporal durante EAE. El descenso marca el inicio de la EAE. </li><li> Evaluar los síntomas clínicos diariamente desde el día 7 de acuerdoing de los sistemas de puntuación estándar (es decir, Puntuación 0: no hay cambios evidentes en las funciones motoras; puntuación de 0,5: parálisis distal de la cola; puntuación 1: parálisis completa de la cola; puntuación de 1,5: paresia leve de una o ambas patas traseras; puntuación 2: paresia grave de las patas traseras; puntuación de 2,5: parálisis completa de una pata trasera; puntuación 3: parálisis completa de ambas patas traseras; anotar. 3.5: parálisis completa de las patas traseras y la parálisis de una pierna delante eutanasia a los ratones con una puntuación de 3,5 o superior para &gt; 12 h. </li></ol></li><li> Curso y el tiempo de formación de imágenes EAE <ol><li> Realizar la primera formación de imágenes en el inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcanzan las puntuaciones&gt; 1, lo que ocurrirá alrededor días 10 a 12 después de la inmunización. </li><li> Realización de la segunda imagen en el pico, que se alcanzará 1 o 2 días después de los síntomas iniciales se desarrollan y tendrá una duración de 1 - 3 días. NOTA: Posteriormente, los ratones se recuperará por completo dentro de los 7 a 10 días. Imaging durante los intervalos todavía puede mostrar fugas vasculares,pero los indicadores de inflamación debe ser negativo. </li></ol></li></ol> 2. bioluminiscente y imágenes de infrarrojo cercano de la neuritis óptica y la inflamación cerebral <ol><li> Configuración del sistema de imagen <ol><li> Realizar imágenes in vivo con cualquier equipo que permite el análisis de bioluminiscencia y señales de infrarrojo cercano. </li><li> Mantenga ratones bajo 2 - anestesia con isoflurano al 2,5% durante todos los procedimientos de formación de imágenes. </li><li> La posición de uno o dos ratones uno junto al otro en el aparato utilizando los suministros de gas medias. Coloque la columna vertebral superior en el centro. </li><li> Utilice dos ratones simultáneamente, una por grupo, para la evaluación de los efectos de la medicación para comparar pares. Esto es importante para bioluminiscente de imágenes. </li><li> Proteger el sitio de la inmunización con un paño negro y tomar una imagen de la fotografía y la línea de base para evaluar el correcto posicionamiento del ratón / ratones. Utilice los botones B-foco con una distancia de 6,5 cm a la cámara para todas las imágenes. </li></ol></li><li> Inyección y de formación de imágenes de la sonda de la inflamación bioluminiscente <ol><li> Utilice la configuración del sistema en vivo de imágenes: Epi-BLI, Em filtro abierta, Ex bloque de filtro, fstop 1, se va a agrupar 8, se centran B = 6,5 cm, anuncio de exposición 120 s; tomar una imagen de referencia. </li><li> Inyectar 100 ip l del reactivo quimioluminiscente listo para su uso (40 mg / ml). Mezclar bien antes de llenar la jeringa. </li><li> Capturar imágenes de bioluminiscencia 5, 10 y 15 min después de la inyección. El curso temporal del pico bioluminiscente se diferencia entre los animales. NOTA: El pico se producirá de 5 - 10 min después de la inyección; una disminución en 15 min indica que no se necesitan más imágenes. Utilizar pares de ratones de los grupos control y de tratamiento para eliminar sesgos menores debido a diferentes cursos de tiempo. </li><li> Rellene descripciones relevantes para el experimento. Observar un cuadro de diálogo pop-up de forma automática; que incluye información, tal como la cepa de ratón, el sexo, punto de tiempo, momento de la inyección de la sonda, grupo, etc. Guarde los archivos o en todocarpeta ne; tendrán etiquetas de tiempo y todas las descripciones. </li></ol></li><li> Inyección y obtención de imágenes de nanopartículas fluorescentes en el infrarrojo cercano para la acreditación integridad <ol><li> Utilizar imagen de epifluorescencia infrarrojo cercano en el B-enfoque (distancia: 6,5 cm). Los máximos de excitación / emisión de las nanopartículas fluorescentes pegilados son 675/690 nm. Capturar dos imágenes en diferentes longitudes de onda, en Ex640 / Em700 y Ex675 / Em720; utilizar un 2-s de la exposición, se va a agrupar 8, y fstop 2. Tomar una imagen de línea de base. </li><li> Inyectar 70 l de nanopartículas fluorescentes infrarrojos pegilado iv a través de la vena de la cola e imaginar los ratones 3 hy 24 h después de la inyección utilizando la configuración anterior. Mezclar la solución bien antes de llenar la jeringa. </li><li> Se inyecta cloruro de sodio al 0,9% en los ratones de control, que serán necesarios para evaluar la especificidad de la señal. </li></ol></li><li> Inyección y obtención de imágenes de la sonda fluorescente del infrarrojo cercano para la actividad de MMP <ol><li> Afeitarse o depilarse la cabeza yuregión de la columna vertebral pper con cautela un día antes de tomar la imagen de referencia. La piel no debe ser herido. </li><li> Utilizar imagen de epifluorescencia infrarrojo cercano en el B-enfoque (distancia: 6,5 cm). Los máximos de excitación / emisión de la sonda activable MMP son 680/700 nm. Capturar dos imágenes en diferentes longitudes de onda, en Ex640 / Em700 y Ex675 / Em720; utilizar un 1-s de la exposición, se va a agrupar 8, y fstop 2. Tomar una imagen de línea de base. </li><li> Añadir 200 l de 1x PBS al tubo 1,5 ml de la solución lista para usar (20 nmol / 1,5 ml en 1 x PBS) de manera que será suficiente para 10 ratones; mezclar bien antes de llenar la jeringa. NOTA: El volumen suministrado no se tiene en cuenta que un poco de volumen se pierde durante el llenado de la jeringa y la inyección. </li><li> Inyectar 150 l de la sonda a través iv la vena de la cola 24 h antes de formación de imágenes. Inyectar PBS sólo en los animales de control para evaluar la especificidad de la señal. </li><li> A las 24 h después de la inyección, tomar Epi-FL imágenes por lo menos en dos longitudes de onda, Ex640 / Em700 y Ex 675 / Em720, con la configuración explicada anteriormente (1-s exposición, el enfoque B, se va a agrupar 8, y fstop 2). NOTA: El uso de dos longitudes de onda permite la desmezcla espectral restando la señal inespecífica. </li></ol></li></ol> 3. Los análisis de imagen <ol><li> Análisis de bioluminiscencia (BLI) <ol><li> Haga doble clic en el software para abrirlo. </li><li> En la barra de menú superior, haga clic en el icono del explorador de archivos, vaya al directorio de la carpeta del experimento, y seleccionarlo; esto abrirá todos los archivos en la carpeta en una tabla. </li><li> Configurar las columnas que muestran las descripciones pertinentes al experimento. </li><li> Para el control de calidad, haga doble clic en un archivo de un ratón no respondedor sin síntomas de EAE y / o un ratón ingenuo para comprobar la especificidad de las señales de EAE. NOTA: No debe haber ninguna señal en los ratones no tratados previamente y mínima de la señal en los ratones que no respondieron. <ol><li> Compruebe la imagen de la línea de base antes de la inyección de la proser para cada ratón como un control adicional de la especificidad de la señal; que debe ser negativo. </li></ol></li><li> Para seleccionar una imagen, haga doble clic en el primer archivo del primer ratón de EAE y comprobar la intensidad bioluminiscente (LUT gama de barras) y la localización. Compruebe todas las imágenes una por una. Cierre el archivo con la intensidad más baja para cada ratón (es decir, mantener 2 de cada 3 imágenes por cada ratón). </li><li> Ajuste de la imagen y la exportación <ol><li> Haga doble clic en el primer archivo de ser cuantificados. Observar una nueva ventana emergente. En &quot;Opciones&quot; (menú superior), personalizar las etiquetas que se mostrarán en cada imagen. </li><li> En la paleta de herramientas a la derecha, vaya a &quot;Ajuste de imagen&quot;. Por defecto, las intensidades mínimas y máximas se establecen en &quot;auto&quot; y se muestran en pseudocolor arco iris. Seleccione &quot;manual&quot; para cambiar la configuración si es necesario. NOTA: Por ejemplo, todas las imágenes exportadas pueden tener barras idénticas LUT (mínimos y máximos) idénticos que sean fácilmente comparables.El ajuste de los mínimos y máximos no tiene impacto en los resultados cuantitativos. </li><li> Haga clic en la exportación de imágenes, seleccione png, el directorio y un nombre de imagen </li></ol></li><li> La cuantificación de regiones de interés (ROI) <ol><li> Ir a la función &quot;retorno de la inversión&quot; en la paleta de herramientas. Seleccione el método de retorno de la inversión (círculo, rectangular, auto o manos libres) y el número de regiones de interés. Observe la ventana pop-up retorno de la inversión en la ventana de imagen. </li><li> Con el ratón, ajustar el tamaño y la posición. Utilizar umbrales de ROI idénticos para todas las imágenes si se utiliza la herramienta de auto-retorno de la inversión. Utilice áreas idénticas para todas las imágenes si los tamaños y posiciones de ROI se definen de forma manual (por ejemplo, los ROI circulares). </li><li> Haga clic en &quot;medir RO.I. Observar una nueva ventana emergente. Personalizar las columnas (por ejemplo, nombre de archivo, el número de animales, grupo, experimento, área, los recuentos totales, recuentos promedio, los recuentos SD, mínimo y máximo que cuenta, área, tiempo punto, el tiempo de inyección de sonda, etc.). Guardar los ajustes personalizados. Cuando ready, seleccionar todo (Ctrl + A), y copiar y pegar la tabla en una hoja de cálculo. </li><li> Exportar la imagen como un png con las regiones de interés en su lugar. Guarde y cierre el archivo de imagen. </li></ol></li><li> Repetir el procedimiento (pasos 3.1.6 - 3.1.7) para todos los archivos de imágenes que necesitan ser cuantificados. Copiar todas las cuantificaciones de ROI en la hoja de cálculo. NOTA: En este caso, los resultados se pueden ordenar por grupo, punto en el tiempo, etc. y se analizaron estadísticamente. Utilice el recuento total de señales de bioluminiscencia en el rendimiento de la inversión para los análisis estadísticos. </li></ol></li><li> El análisis de infrarrojo cercano (NIR) de nanopartículas fluorescentes <ol><li> Uso de los controles en el software, ajustar el umbral de la imagen. NOTA: Esto no tiene ningún impacto en el resultado cuantitativo. </li><li> comparar visualmente las imágenes captadas a Ex / Em 675/720 y Ex / Em 640/700 para evaluar la especificidad de la señal. </li><li> Utilizar las imágenes captadas a Ex / Em 675/720 para el análisis cuantitativo (máximo de excitación: 680 nm). Definir regiones de interés, para lo cual se puede utilizar la herramienta de auto-retorno de la inversión. Ajuste del umbral de auto-retorno de la inversión y utilizarlo para todas las imágenes. Cuantificar la eficiencia total radiante en regiones de interés (véase el paso 3.1). </li></ol></li><li> El análisis de infrarrojo cercano (NIR) de la sonda sensible a la proteasa <ol><li> El uso de controles de software, ajustar el umbral de la imagen. NOTA: Esto no tiene ningún impacto en el resultado cuantitativo. Realizar desmezcla espectral de la autofluorescencia. La herramienta de desmezcla se implementa en imagen viva. La auto-desmezcla utiliza el Ex / Em 640/700 como el específico y 675/720 como la imagen de auto-fluorescente. </li><li> Seleccione la imagen sin mezclar y definir las regiones de interés, como se describió anteriormente. Utilice la eficiencia total radiante en regiones de interés para los análisis cuantitativos y estadísticos. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La presente video muestra técnicas para la bioluminiscencia y fluorescencia en el infrarrojo cercano de imágenes in vivo de la EAE en ratones SJL / J. Se demuestra que la formación de imágenes de bioluminiscencia utilizando una sonda inflamación sensible muestra principalmente neuritis óptica, y la cuantificación de acuerdo con la evaluación clínica de la gravedad de EAE y los efectos de la medicación. Sin embargo, el método de formación de imágenes de bioluminiscencia no fue capaz de detectar la infla...

La esclerosis múltiple es causada por el ataque y la destrucción autoinmune de la vaina de mielina en el cerebro y la médula espinal1. Con una incidencia general de alrededor de 3,6 casos por cada 100.000 personas al año en mujeres y alrededor de 2,0 en hombres, la EM es la segunda causa más común de discapacidad neurológica en adultos jóvenes, después de las lesiones traumáticas2,3. La patología de la enfermedad es atribuida por factores genéticos y ambientales4 pero aún no se comprende completamente. Los linfocitos T autorreactivos entran en el sistema nervioso central y desencadenan una cascada inflamatoria que provoca infiltrados focales en la sustancia blanca del cerebro, la médula espinal y el nervio óptico. En la mayoría de los casos, estos infiltrados son inicialmente reversibles, pero la persistencia aumenta con el número de recaídas. Se han desarrollado varios modelos de roedores para estudiar la patología de la enfermedad. Los modelos más populares son la EAE remitente-recurrente en ratones SJL/J y la EAE primaria-progresiva en ratones C57BL6.
Las puntuaciones clínicas de EAE, que describen el alcance de los déficits de la función motora, y el peso corporal son el estándar de oro para evaluar la gravedad de la EAE. Estos signos clínicos concuerdan con el grado de infiltración de células inmunitarias y destrucción de mielina en la médula espinal y predicen moderadamente la eficacia del tratamiento farmacológico en humanos5. Sin embargo, estos signos reflejan principalmente la destrucción de los tractos de fibras ventrales en la médula espinal. En la actualidad, no existe un método fácil, no invasivo, fiable y reproducible para evaluar la infiltración cerebral in vivo y la neuritis óptica en ratones vivos. 
Las imágenes in vivo concuerdan con los 3 principios "R" de Russel y Burch (1959), que afirman un Replacement, Reducación y Refinement de los experimentos con animales6, porque las imágenes aumentan las lecturas de un animal en varios puntos de tiempo y permiten una reducción de los números totales. En la actualidad, la inflamación o el estado de la mielina se evalúan principalmente ex vivo mediante inmunohistoquímica, análisis FACS o diferentes métodos de biología molecular7, todos ellos requiriendo ratones sacrificados en momentos específicos. 
Se han desarrollado varias sondas de sistemas de imagen in vivo para evaluar la inflamación en la piel, las articulaciones y el sistema vascular. Las técnicas se basan en la activación de sustratos fluorescentes bioluminiscentes o de infrarrojo cercano por peroxidasas tisulares, incluyendo la mieloperoxidasa (MPO), las metaloproteinasas de matriz (MMPs)8, y las catepsinas9 o cyclooxygenase2. Estas sondas se han validado principalmente en modelos de artritis o aterosclerosis9,10. También se ha utilizado una sonda sensible a la catepsina para la obtención de imágenes de tomografía molecular de fluorescencia de EAE11. Las MMPs, particularmente MMP2 y MMP9, contribuyen a la disrupción de la BBB mediada por la proteasa en EAE y están reguladas al alza en los sitios de infiltración de células inmunes12, lo que sugiere que estas sondas pueden ser útiles para la obtención de imágenes de EAE. Lo mismo ocurre con las sondas basadas en peroxidasa o catepsina. Técnicamente, las imágenes de la inflamación en el cerebro o la médula espinal son sustancialmente más desafiantes porque el cráneo o la columna vertebral absorben señales bioluminiscentes e infrarrojas cercanas. 
Además de los indicadores de inflamación, se han descrito sustancias químicas fluorescentes, que se unen específicamente a la mielina y pueden permitir la cuantificación de la mielinización13. Se descubrió que una sonda fluorescente de infrarrojo cercano, yoduro de 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DBT), se unía específicamente a fibras mielinizadas y se validó como herramienta cuantitativa en modelos de ratón de defectos primarios de mielinización y en desmielinización evocada por cuprizona14. En EAE, la señal de DBT estaba bastante aumentada, lo que refleja la inflamación de las fibras de mielina5. 
Un sello distintivo adicional de EAE y MS es la ruptura de la BBB, lo que resulta en un aumento de la permeabilidad vascular y la extravasación de células sanguíneas, líquido extracelular y macromoléculas en el parénquima del SNC. Esto puede provocar edema, inflamación, daño de oligodendrocitos y, finalmente, desmielinización15,16. Por lo tanto, la visualización de la fuga de BHE utilizando sondas fluorescentes, como la albúmina sérica bovina marcada con fluorocromo5, que normalmente se distribuyen muy lentamente de la sangre al tejido, puede ser útil para evaluar la EAE.
En el presente estudio, hemos evaluado la utilidad de diferentes sondas en EAE y mostramos el procedimiento para la técnica bioluminiscente más fiable y robusta. Además, discutimos los pros y los contras de las sondas de infrarrojo cercano para la actividad MMP y la integridad de BBB.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.</td><td>NEV10149</td><td>Sonda de imagen, nanopartículas pegiladas, útil para la obtención de imágenes de la integridad de la barrera hematoencefálica</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.</td><td>NEV10126</td><td>Sonda de imagen, activable por metaloproteinasas de matriz, útil para la obtención de imágenes de la inflamación</td></tr><tr><td>Sonda de inflamación XenoLight RediJect Perkin</td><td>Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.</td><td>760535</td><td>Sonda de imagen, activable por oxidasas, útil para la obtención de imágenes de la inflamación</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA emulsión&nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE kit de inducción</td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE kit de inducción</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU</td><td></td>. <td>Sistema de bioluminiscencia e imágenes infrarrojas</td></tr><tr><td>Software LivingImage 4.5&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.</td><td>CLS136334</td><td>software de análisis IVIS</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott Labs, Illinois, EE. UU.</td><td>26675-46-7</td><td>Anestésico</td></tr></tbody></table>

la bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de eae de esclerosis múltiple en ratones

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones SJL / J es un modelo para la esclerosis múltiple recurrente-remitente (EMRR). puntuaciones de EAE clínicos que describen déficit de la función de motor son lecturas básicas de la inflamación inmune mediada de la médula espinal. Sin embargo, las puntuaciones y el peso corporal no permiten una evaluación in vivo de la inflamación del cerebro y la neuritis óptica. Este último es una manifestación temprana y frecuente en aproximadamente 2/3 de los pacientes con EM. Aquí, se muestra métodos para la bioluminiscencia y de formación de imágenes en vivo en el infrarrojo cercano para evaluar EAE evocado neuritis óptica, inflamación del cerebro, y alteración de la barrera hematoencefálica (BBB) en ratones vivos utilizando un sistema de imagen in vivo. Un sustrato bioluminiscente activado por oxidasas mostró principalmente la neuritis óptica. La señal era específico y permite la visualización de los efectos de la medicación y cursos de tiempo de la enfermedad, que en paralelo las puntuaciones clínicas. nanopartículas fluorescentes pegilada que permanecían dentro del vasculature durante largos períodos de tiempo se utilizaron para evaluar la integridad BBB. Infrarrojo cercano de imágenes revela una fuga de acreditación en el pico de la enfermedad. La señal fue el más fuerte alrededor de los ojos. Un sustrato de infrarrojo cercano para metaloproteinasas de la matriz se utilizó para evaluar la inflamación EAE-evocado. Auto-fluorescencia interfirió con la señal, lo que requiere desmezcla espectral para la cuantificación. En general, imágenes de bioluminiscencia era un método fiable para evaluar la neuritis óptica y la medicación efectos de EAE asociado y fue superior a las técnicas de infrarrojo cercano en términos de especificidad de la señal, robustez, facilidad de cuantificación, y el costo.

Lapso de tiempo de bioluminiscencia de la neuritis óptica La señal de bioluminiscencia de la sonda era el más fuerte inflamación alrededor de los ojos y se produjo exclusivamente en ratones con EAE con neuritis óptica. Una señal se produjo ni en los ratones no EAE ni los ratones no inyectados con la sonda de la inflamación. La señal desapareció cuando los ratones se recuperó. Por lo tanto, la señal es específi...

Mostramos una técnica para la bioluminiscencia in vivo en vivo y en el infrarrojo cercano de formación de imágenes de la neuritis óptica y la encefalitis en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) para la esclerosis múltiple en ratones SJL / J.

La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

El objetivo general de esta técnica de imagen es visualizar y cuantificar la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo EAE de esclerosis múltiple en ratones vivos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como los nuevos mecanismos que afectan la evolución del EAE y de la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que la neuritis óptica y la inflamación cerebral inducidas por el EAE pueden observarse y cuantificarse en ratones vivos a lo largo de la enfermedad.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia porque podemos observar el efecto de medicamentos que no se revelan mediante las puntuaciones de EAE. En este procedimiento, disuelva la PTX a dos microgramos por mililitro en PBS 1x y mezcle bien. Luego, inyecte 100 microlitros de PLP/CFA en los ratones por vía subcutánea dos veces en la base de la cola durante una breve anestesia con isoflurano.No inyecte en la parte posterior del cuello, ya que cualquier reacción inmunitaria en la piel de la espalda superior o del cuello interferirá con la obtención de imágenes de la cabeza y la médula espinal. Una a dos horas después de la inmunización, inyecte 100 microlitros de PTX en los ratones por vía intraperitoneal. Luego, 24 horas después de la inmunización, vuelva a inyectar a los ratones 100 microlitros de PTX.Para los ratones de control, inyecte 100 microlitros de CFA sin PLP dos veces en la base de la cola. A partir del día siete posterior a la inmunización, evalúe los síntomas clínicos diariamente según los sistemas de puntuación estándar. Cuando los ratones alcancen una puntuación mayor que uno, lo cual ocurrirá alrededor del día 10 al 12 después de la inmunización, realice la primera imagenología al inicio de la enfermedad.Luego realice la segunda imagenología en el pico de la enfermedad, que ocurre aproximadamente uno o dos días después del desarrollo de los síntomas iniciales y dura de uno a tres días. Posteriormente, los ratones se recuperarán completamente en un período de siete a diez días. La imagenología durante los intervalos aún puede mostrar fugas vasculares, pero los indicadores de inflamación deben ser negativos.Para realizar la imagenología in vivo, mantenga a los ratones bajo anestesia con isoflurano al 2% al 2,5% durante todos los procedimientos de imagenología. Coloque dos ratones uno al lado del otro en el aparato, y posicione las columnas superiores de los ratones en el centro. A continuación, proteja el sitio de inmunización con un paño negro.Abra el software para la captura de imágenes e inicialice la cámara. Luego, tome una imagen de referencia para evaluar la posición correcta de los ratones. Posteriormente, utilice el enfoque B con una distancia de 6,5 centímetros respecto a la cámara para capturar todas las imágenes.Posteriormente, mezcle el reactivo quimioluminiscente listo para usar a 40 miligramos por mililitro antes de llenar la jeringa. Luego, inyecte 100 microlitros del mismo en los ratones por vía intraperitoneal y capture las imágenes de bioluminiscencia a los cinco, 10 y 15 minutos tras la inyección. En este procedimiento, abra el software de análisis de bioluminiscencia.En la barra de menú superior, haga clic en el icono del explorador de archivos. Vaya al directorio de la carpeta del experimento y abra los archivos, luego configure las columnas para mostrar las descripciones relevantes al experimento. Para el control de calidad, haga clic en un archivo de un ratón no respondedor sin los síntomas de EAE, o de un ratón ingenuo para verificar la especificidad de las señales de EAE.Como control adicional de la especificidad de la señal, revise la imagen de línea base antes de la inyección de la sonda en cada ratón, la cual debe ser negativa. Para seleccionar una imagen, haga clic en el primer archivo del primer ratón con EAE y verifique la intensidad y localización de la bioluminiscencia. Revise todas las imágenes una por una.Para la cuantificación, utilice la imagen con la señal más intensa de cada ratón. Para ajustar y exportar la imagen, haga doble clic en el primer archivo que se va a cuantificar. En una nueva ventana emergente, bajo el botón Opciones, personalice las etiquetas que se mostrarán en cada pantalla.En la paleta de herramientas derecha, vaya a Ajuste de imagen. De forma predeterminada, las intensidades mínima y máxima se establecen en automático y se muestran en pseudocolor arcoíris. Seleccione Manual para cambiar la configuración si es necesario.A continuación, haga clic en Exportación de imagen, seleccione PNG, el directorio y un nombre para la imagen. Para la cuantificación de las regiones de interés, vaya a la herramienta de ROI en la paleta de herramientas. Seleccione el método de ROI y el número de ROI.En la ventana de ROI dentro de la ventana de la imagen, ajuste el tamaño y la posición del ROI. Utilice umbrales de ROI idénticos para todas las imágenes cuando se use la herramienta de ROI automático. Utilice áreas idénticas para todas las imágenes si los tamaños y posiciones del ROI se definen manualmente.A continuación, haga clic en Medir ROI. Personalice las columnas con los detalles experimentales en una nueva ventana emergente y guárdelas. Cuando esté listo, seleccione todo, copie y pegue la tabla en una hoja de cálculo.A continuación, exporte la imagen como un PNG con las ROI en su lugar. Luego, guarde y cierre el archivo de imagen. A continuación se muestran ejemplos de dos ratones SJL/J que fueron imagenados a los días 10 y 14 después de la inducción de EAE.La señal bioluminiscente alrededor de los ojos fue más alta en el día 10 y desapareció cuando los ratones comenzaron a recuperarse. Los gráficos de barras aquí muestran la cuantificación de las señales bioluminiscentes en los días 10 y 14, mientras que aquí se muestran los puntajes clínicos de EAE. En esta figura, las imágenes bioluminiscentes de cinco ratones en cada grupo muestran el efecto del medicamento en el que la neuritis óptica se redujo en los ratones tratados con R-flurbiprofeno.La cuantificación de los recuentos bioluminiscentes totales en las regiones de interés confirmó la eficacia significativa del tratamiento. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas, dependiendo del número de ratones que deban ser imagenados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar ratones blancos y observar cuidadosamente el curso clínico de la EAE.Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de FACS o la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales, como la infiltración de células inmunitarias en la médula espinal. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo EAE de esclerosis múltiple utilizando imágenes bioluminiscentes.

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Este vídeo muestra un procedimiento para evaluar la alteración de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón EAE. Los tintes fluorescentes de diferentes tamaños se inyectan retroorbitalmente y circulan a través de los vasos sanguíneos del cerebro. El tinte más pequeño se filtra a través de los espacios en el tejido cerebral, mientras que el tinte más grande ingresa solo si la interrupción es grave, lo que se correlaciona con el grado del daño de la barrera.

Determinación de la disrupción de la barrera hematoencefálica mediante colorantes fluorescentes en un modelo de ratón EAE

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Fuente: Breid, S., et. al. Imágenes de bioluminiscencia de neuroinflamación en ratones transgénicos después de la inoculación periférica de fibrillas de alfa-sinucleína. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra la imagen de bioluminiscencia de la neuroinflamación en ratones transgénicos, mostrando las reacciones luciferasa-luciferina en astrocitos activados. El protocolo permite la cuantificación no invasiva de la activación astrocítica, lo que ayuda a los estudios sobre la inflamación del SNC y...

Imágenes de bioluminiscencia de neuroinflamación en un ratón transgénico

Source: Schmitz, K., et al., Bioluminiscencia e imágenes en el infrarrojo cercano de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo EAE de esclerosis múltiple en ratones. J. Vis. Exp. (2017).Este video demuestra el método para visualizar y monitorear la encefalomielitis autoinmune experimental o la inflamación inducida por EAE en el nervio óptico usando Imágenes de bioluminiscencia. Incluye el posicionamiento del ratón, la inyección de reactivos y la captura de imágenes secuenciales...

Imágenes de bioluminiscencia en un modelo de ratón EAE

Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones adultos para estudiar la encefalomielitis autoinmune experimental. Estas ventanas proporcionan acceso óptico crónico a la médula espinal para monitorear la dinámica celular a nivel subcelular en animales vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Implante de ventanas de vidrio de la médula espinal en ratones adultos con encefalomielitis autoinmune experimental

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo o la lengua de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que expresan alfa-sinucleína humana con la mutación A53T familiar y luciferasa de luciérnaga, puede inducir la neuropatología, incluyendo la neuroinflamación , en su sistema nervioso central.

Imágenes de bioluminiscencia de la neuroinflamación en ratones transgénicos Después periférica La inoculación de la alfa-sinucleína fibrillas

Este protocolo describe cómo alta resolución técnicas imagenológicas como una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser puede ser utilizada en pequeños roedores, utilizando un sistema de plataforma imagen oftálmica, para obtener información sobre espesor retiniano y microglía células distribución, respectivamente.

En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal de esclerosis múltiple. En este artículo se describe un enfoque para la puntuación de la inflamación, desmielinización y lesión axonal de la médula espinal en EAE. Además, se presenta un método para cuantificar los niveles de luz de neurofilamentos solubles en el suero de ratones, lo que facilita la evaluación de la lesión axonal en ratones vivos.

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a visualizar y cuantificar la neuritis óptica y la inflamación cerebral en ratones con EAE mediante bioluminiscencia e infrarrojo cercano. Esta técnica permite evaluar la progresión de la esclerosis múltiple y la eficacia terapéutica en tiempo real.

La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones (Video) | JoVE Journal

La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones

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