Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

El objetivo de este procedimiento es preparar andamios celulares tridimensionales biodegradables similares a la espuma basados en elastómeros de cristal líquido de cadena lateral biocompatibles. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del cristal líquido y la biomedicina, como los efectos de las propiedades del elastómero de cristal líquido en la proliferación y alineación celular. La principal ventaja de este método de andamios de células bidimensionales es que permite el estudio de las interacciones espaciales célula-célula, lo que rara vez es posible en macroentornos 2D.

Por lo general, los nuevos en este método tendrán dificultades con las pruebas de compresión táctil. Primero tuvimos la idea de este método después de tener que cambiar los medios en cientos de placas de Petri. Nos preguntábamos si los elastómeros de cristal líquido podrían soportar las células musculares en una red 3D, para eliminar el uso de tantas placas de Petri.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que algunos pasos requieren una manipulación cuidadosa de los productos químicos. Además, dar forma a la plantilla de espuma metálica puede ser un desafío. Primero, llene una ampolla de 20 mililitros con una solución de 2% en volumen de PFOTES en tolueno.

Revuelva la solución en la ampolla durante 24 horas para silanizar el interior de la ampolla. Enjuague la ampolla silanizada con alcohol isopropílico y séquela a 140 grados centígrados durante 30 minutos. Coloque 3,64 gramos de épsilon-caprolactona destilada, 0,5 gramos de alfa-cloro-épsilon-caprolactona y 0,25 mililitros de glicerol en la ampolla seca.

Agita la mezcla durante un minuto. A continuación, añada 4,90 gramos de DL-lactida a la mezcla y purgue la atmósfera de la ampolla con gas nitrógeno durante un minuto. Cubra la abertura de la ampolla con papel de aluminio y caliente la mezcla a 120 grados centígrados durante unas dos horas para derretir la DL-lactida.

Agite la mezcla para interrumpir los sólidos no derretidos y, a continuación, añada 66 microlitros de 10-2-etilhexanoato a la ampolla y vuelva a hacer vórtice. Cierre la ampolla con papel de aluminio y caliente la mezcla a 120 grados centígrados durante 10 minutos para volver a derretir la DL-lactida. Una vez que la DL-lactida se haya derretido de nuevo, vórtice vigorosamente la mezcla y purgue la atmósfera de la ampolla con gas nitrógeno.

Selle la ampolla con un tabique de goma. Inserte una aguja conectada a una línea de vacío a través del tabique y encienda la aspiradora. Selle con llama el cuello de la ampolla, teniendo cuidado de no derretir el tapón de goma.

Una vez que el cuello esté sellado, caliente la mezcla de reacción a 140 grados centígrados durante 48 horas. Luego, deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente. Abra la ampolla y disuelva la mezcla viscosa de reacción en 10 mililitros de diclorometano.

Transfiera la mezcla a un embudo separador. Coloque un matraz que contenga 100 mililitros de metanol en un baño de hielo seco y acetona para enfriar el metanol a aproximadamente menos 78 grados centígrados. Una vez que el metanol se haya enfriado, asegure el embudo separador sobre el matraz.

Agregue la mezcla de reacción al metanol frío a razón de dos gotas por segundo. Recoja el precipitado blanco resultante en papel de filtro. Seque el precipitado en un horno de vacío entre 50 y 60 grados centígrados para obtener el producto SBC de alfa-cloro de tres brazos.

Para preparar el SBC de tres brazos de alfa colesterol, el átomo de cloro colgante se reemplaza por una azida. Una reacción de clic con el 5-hexinoato de colesterol da como resultado un colesterilo colgante como fracción de cristal líquido. Para comenzar a preparar el andamio de elastómero de cristal líquido, combine 0,75 gramos de SBC de tres brazos de alfa-colesterilo con 0,25 mililitros de HDI y 0,24 mililitros de épsilon-caprolactona destilada.

Agregue a esto 60 microlitros de 10-2-etilhexanoato y vórtice la mezcla. Luego, corta un trozo de espuma metálica de níquel de un centímetro por cuatro centímetros. Enrolle la espuma de níquel en un cilindro de un centímetro de diámetro y un centímetro de alto para formar una plantilla para el andamio de espuma de elastómero de cristal líquido.

Coloque la plantilla en un frasco de vidrio o en una carcasa de papel de aluminio y vierta la mezcla de elastómero de cristal líquido sobre la plantilla hasta que esté completamente cubierta. Deje que la plantilla se asiente en la mezcla de elastómero de cristal líquido durante dos minutos y, a continuación, retire el exceso con una pipeta. Caliente la mezcla y la plantilla a 80 grados centígrados durante la noche.

Luego, retire el papel de aluminio o rompa el vidrio. Use una hoja de afeitar para eliminar el exceso de elastómero de cristal líquido para exponer la plantilla de metal de níquel. Coloque la espuma en un matraz y agregue 70 mililitros de una solución acuosa saturada de cloruro de hierro tres.

Revuelva la espuma en la solución durante tres días a temperatura ambiente para disolver la plantilla de níquel. Cada 24 horas, revuelva la espuma en agua desionizada durante 30 minutos y luego vuelva a revolver en una solución fresca de tres cloruros de hierro. Después del segundo día de agitación, realice una prueba de compresión táctil en la espuma de elastómero de cristal líquido.

La resistencia a la compresión táctil indica que la plantilla de níquel todavía está presente en la espuma. Después del tercer día, se ha eliminado toda la plantilla de níquel y la espuma resultante parece muy suave y fácil de comprimir por completo. La plantilla de níquel debe eliminarse por completo.

Es importante enjuagar bien la espuma de elastómero de cristal líquido en cloruro de hierro hasta que esté suave al tacto cuando se realice una prueba de compresión táctil. El andamio de espuma de elastómero de cristal líquido ya está listo para ser caracterizado y utilizado. Una vez que la espuma de elastómero de cristal líquido esté blanda, enjuáguela con etanol al 70% para esterilizarla.

Para comenzar el procedimiento de siembra, lave nuevamente los andamios de espuma de elastómero de cristal líquido dos veces en un mililitro de etanol al 70% para esterilizar las superficies de elastómero. Luego, irradie los andamios con luz ultravioleta durante 10 minutos. Lave los andamios con otra porción de un mililitro de etanol al 70%.

Enjuague los andamios con un mililitro de agua estéril y solución salina tamponada con fosfato. Cargue los andamios de elastómero de cristal líquido esterilizados en placas de cultivo de 24 pocillos. Prepare y cuente una suspensión de las células de interés en el medio de crecimiento celular apropiado con penicilina y estreptomicina.

Diluir la suspensión celular a 1,5 veces 10 por la quinta célula por cada 100 microlitros utilizando un medio de crecimiento. Deposite una gota de suspensión celular diluida en la parte superior de cada andamio de elastómero de cristal líquido. Incubar los andamios de elastómero de cristal líquido sembrados a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de CO2 durante dos horas.

Agregue otros 0,5 mililitros de medio de crecimiento a cada andamio y continúe con la incubación. Cada 48 horas, lave los andamios sembrados con un mililitro de PBS y agregue medio de crecimiento fresco. Continúe incubando los andamios hasta que las células estén listas para la microscopía.

Estas LC esméticas permiten el estudio de construcciones de tejidos complejos al tiempo que promueven el crecimiento y la proliferación celular. Con el fin de mantener la viabilidad celular, las espumas deben esterilizarse y la limpieza de los cultivos debe mantenerse en todo momento. Para prepararse para la microscopía, fije las células en los andamios con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos.

Remoje las muestras tres veces en tres mililitros de PBS durante cinco minutos. Coloque una muestra de andamio en un tubo Eppendorf. Teñir la muestra con una solución de 0,1%DAPI en 500 microlitros de PBS durante 10 minutos.

Remoje la muestra dos veces en un mililitro de PBS durante cinco minutos. Y luego, inmediatamente tome una imagen de la muestra con microscopía confocal. Adquiera pilas de imágenes que abarquen la muestra y analice los datos en un programa de procesamiento de imágenes.

Un SBC de tres brazos con partes de cristal líquido se fundió sobre una plantilla de espuma de níquel con HDI como reticulante. La plantilla de níquel se eliminó mediante grabado para obtener la espuma de elastómero de cristal líquido. Periódicamente se realizaron pruebas de deformación por compresión para monitorear el proceso de grabado.

Una vez que el níquel se había disuelto por completo, las pruebas de deformación por compresión mostraron una reducción del 70% en el tamaño cuando se comprimió. Al liberar la compresión, la espuma de elastómero de cristal líquido recuperó constantemente su tamaño y forma originales. Este comportamiento se atribuye a las fracciones de cristal líquido, ya que espumas de elastómero similares que carecen de la fracción de colesterol épsilon-caprolactona no se recuperaron de la compresión.

El SCM de la morfología interna de la espuma mostró una red interconectada de puntales de espuma hueca. La morfología regular se atribuyó a la estructura de la espuma de níquel, lo que indica que el tamaño de los poros y la forma general se pueden controlar mediante la selección de una plantilla metálica adecuada. La espuma se sembró con células de neuroblastoma, que se adhirieron a las paredes de la red en dos días.

30 días después de la siembra, la microscopía confocal reveló que las células se extendían sobre la red de elastómeros de cristal líquido y habían formado múltiples capas dispersas por toda la espuma de elastómero. Se observó la elongación de los núcleos celulares y se correlacionó con la alineación celular. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro semanas si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseñar y preparar andamios de celdas de elastómero de cristal líquido con tamaños de poro y morfologías específicos. Al intentar este procedimiento, es importante caracterizar completamente cada producto y monitorear la viabilidad y expansión de la célula. Además, es importante una técnica de tinción adecuada para adquirir fácilmente imágenes de microscopía confocal.

Siguiendo este procedimiento, los elastómeros de cristal líquido también pueden exponerse a estímulos externos, como el estrés, o campos magnéticos y eléctricos, para responder preguntas adicionales sobre cómo el ordenamiento molecular anisotrópico de los elastómeros de cristal líquido afecta la respuesta celular. Las implicaciones de esta técnica se aplican al estudio de los procesos de la enfermedad, ya que proporciona una plataforma para estudiar dinámicamente los efectos de los agentes externos sobre la actividad de la enfermedad simulada y los procesos de reparación posteriores. Aunque esta espuma de elastómero de cristal líquido esméctico puede proporcionar información sobre las interacciones entre células, también se puede utilizar con otros materiales, como nanoestructuras semiconductoras o metálicas.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores de los campos biomédicos diseñaran plataformas experimentales a largo plazo que reflejaran sistemas vivos.