En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal.

El objetivo general de este procedimiento es preparar la aorta y la arteria carótida del ratón para la inmunotinción facial después de la ligadura de la arteria carótida izquierda. Este método nos permite estudiar la organización, la expresión de cada proteína y el posible estado de las células antrales y otras células vasculares en métodos de inmunotinción. Las preparaciones faciales permiten el análisis de grandes áreas a través de los vasos sanguíneos para la evaluación de la diferencia regional en la expresión de varios parámetros celulares normales y posibles.

La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Quaico, un microcirujano de nuestro grupo. Comience colocando el ratón anestesiado sobre una tabla quirúrgica en posición supina. Después de confirmar una falta de respuesta al pellizco de los pies, pegue las patas delanteras a la tabla en la posición estirada hacia afuera y ambas patas traseras al lado derecho del ratón para exponerlas al lado izquierdo del cuello.

Retire el vello alrededor de la zona cervical y desinfecte la piel expuesta. Cubra el ratón con un paño quirúrgico esterilizado con un orificio sobre la región quirúrgica y aplique ungüento en los ojos del animal. Mueva el ratón bajo el microscopio de disección y haga una incisión en la línea media ventral alrededor del área cervical.

Vuelva a colocar las glándulas salivales que cubren los vasos sanguíneos hacia el lado izquierdo del animal para exponer la arteria carótida común izquierda, que se bifurca en la arteria carótida interna izquierda y la arteria carótida externa izquierda. Retire suavemente el tejido conectivo alrededor y por debajo de la arteria carótida interna izquierda y use una pinza para pasar una sutura de seda de seis O precortada de 2,5 centímetros de longitud debajo de la arteria, usando una segunda pinza para tirar de la sutura aproximadamente un tercio de su longitud hacia el otro lado del vaso. Ligar la arteria carótida interna izquierda.

A continuación, extirpe el tejido conectivo que rodea la arteria carótida externa izquierda, como se acaba de demostrar, y haga una ligadura proximal a la arteria tiroidea superior izquierda. Cuando se hayan ligado todas las arterias, excepto la arteria occipital, regrese las glándulas salivales a sus posiciones originales e hidrate el campo quirúrgico con dos o tres gotas de solución salina. A continuación, utilice seis suturas de vicryl recubiertas de O para cerrar la piel y coloque al ratón en la jaula precalentada con supervisión hasta que esté completamente revuelto.

Al final del experimento, asegure al ratón en posición supina sobre una tabla de disección y use tijeras de iris para exponer la cavidad abdominal con una incisión en la línea media. Corta las costillas lateralmente al esternón para exponer la cavidad torácica. A continuación, corte la arteria femoral e inserte una aguja de calibre 26 conectada a una profusión de gravedad colocada en el vértice del ventrículo izquierdo para profusar el sistema circulatorio con solución salina suplementada con heparina.

Continúe la profusión hasta que la solución salina que fluye del corte se vuelva clara. A continuación, cambie el sistema de profusión de solución salina a 4% de paraformaldehído en PBS. Después de cinco minutos, mueva el ratón bajo el microscopio de disección y use tijeras y fórceps de punta roma para extraer la aorta y las arterias carótidas izquierda y derecha.

A continuación, transfiera los tejidos a una placa de Petri de PBS y extraiga con cuidado la grasa y los tejidos conectivos, seguido de la separación y la división longitudinal de la aorta y las arterias carótidas para exponer el endotelio. Lo más importante que hay que recordar al hacer preparaciones de vasos sanguíneos en la cara es que las células endoteliales se dañan fácilmente con un manejo brusco. No estire los recipientes en ningún momento, especialmente durante las etapas de recolección y limpieza.

A continuación, transfiera cada recipiente a pocillos individuales de una placa de 12 pocillos que contiene 0,5 mililitros de solución permeable por pocillo. Permeabilizar los vasos sanguíneos durante 10 minutos meciéndolos a temperatura ambiente, seguidos de un breve lavado en PBS. Bloquear cualquier unión inespecífica con una incubación de 30 minutos en suero normal al 10% de la misma especie que los anticuerpos secundarios planificados en TTBS, con balanceo a temperatura ambiente.

A continuación, etiquete las muestras con los anticuerpos primarios de interés diluidos en TTBS con un 10% de suero normal durante la noche con balanceo a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, enjuague los vasos sanguíneos con tres lavados de 10 minutos en TTBS con balanceo a temperatura ambiente, seguidos de incubación en los anticuerpos secundarios apropiados diluidos en TTBS y 10% de suero normal y dappy. Regrese las muestras al balancín y cúbralas para protegerlas de la luz.

Después de una hora a temperatura ambiente con balanceo, lave las muestras tres veces en TTBS fresco como se demuestra, seguido de un breve enjuague en PBS, y coloque una gota de reactivo antidecoloración por recipiente en cubreobjetos individuales de 22 por 50 milímetros. Bajo un microscopio, coloque un recipiente en cada gota de reactivo con el endotelio hacia abajo y cubra los recipientes con un vaso portaobjetos de 22 por 75 milímetros por muestra. Coloque los portaobjetos sobre una toallita de laboratorio limpia y cúbralos con dos piezas de toallita de laboratorio y 3,5 kilogramos de peso para aplanar los recipientes.

Después de un máximo de cinco minutos, retire el peso y limpie el exceso de solución alrededor de los cubreobjetos. A continuación, aplique esmalte de uñas en las cuatro esquinas de los cubreobjetos y coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos, con el tapabono hacia arriba. A la mañana siguiente, use más esmalte de uñas para sellar completamente los cubreobjetos y tome imágenes de los vasos tan pronto como el esmalte de uñas esté seco.

Aquí se muestra una imagen típica de inmunoflorescencia facial de doble tinción endotelial con anticuerpos anti cadherina VE y molécula de adhesión celular antivascular one e ilustra una sola sección óptica de una aorta de ratón tomada cerca de la abertura de una arteria intercostal. Obsérvese la tinción de contorno lineal verde en la unión de adherencia de las células endoteliales y la fuerte molécula de adhesión de células antivasculares que se tiñe en la abertura de la arteria intercostal, donde se sabe que se produce el flujo sanguíneo alterado. En estas imágenes se puede observar la tinción facial de una carótida izquierda parcialmente ligada y una arteria derecha de control no ligada un día después de la cirugía, con una molécula de adhesión celular antivascular aumentada y una tinción aparente en el vaso ligado.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo hacer una ligadura parcial de la arteria carótida izquierda y hacer preparaciones faciales en vasos sanguíneos de ratón. Lleve esto con su óptica a otros animales pequeños. El uso de preparaciones faciales se limita ahora a la tinción inmunofluorescente, pero también se puede utilizar con otros métodos, como para el estudio de esas regiones enteras después de la tinción de oropéndolas, o para experimentos de contraposición ex vivo.