Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

El objetivo general de este procedimiento es evaluar simultáneamente múltiples sitios potenciales de fosforilación e identificar sitios para su posterior validación por mutantes de sitios de fosforilación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la bioquímica y la biología celular sobre el papel de las modificaciones postraduccionales en la señalización celular. Esta técnica permite un cribado preliminar fácil y económico de los sitios de fosforilación y de la proteína de interés.

La implicación de esta técnica se extendió hacia el diagnóstico y la terapia de enfermedades como la inflamación y el cáncer, ya que la fosforilación es un evento bioquímico importante en las vías de señalización de las enfermedades humanas. Ayudando a la demostración estaría Sol-Bi Shin, un estudiante graduado de mi laboratorio que mientras realizaba la mutagénesis dirigida al sitio. En primer lugar, combine 50 nanogramos de la pGEX JST NRF2 de plasma, 125 nanogramos de cebador directo, 125 nanogramos de cebador inverso, un microlitro de mezcla de DNTP, 2,5 unidades de ADN polimerasa PFU y 10x tampón de reacción en hielo.

Agregue agua destilada estéril para llevar el volumen a 50 microlitros. Realice una PCR para incorporar la hebra mutante y luego enfríe la muestra en hielo durante dos minutos. Agregue un microlitro de enzima de restricción DPNI a la muestra enfriada.

Mezcle la muestra con un pipeteo suave y luego centrifugue la muestra durante un minuto a 13, 000 veces G. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante dos horas para digerir el ADN monocatenario parental. A continuación, arroje células de E. coli supercompetentes con mutaciones endA1 y RACA1 en hielo. Agregue 50 microlitros de la mezcla de reacción a las células enfriadas e incube en hielo durante 30 minutos.

Mientras tanto, precaliente un bloque calefactor a 42 grados centígrados. Una vez completada la incubación, caliente la mezcla a 42 grados centígrados durante 90 segundos y luego enfríe la mezcla en hielo durante dos minutos. Agregue caldo de Lysogeny precalentado a las células transformadas.

Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora mientras se agita a 180 RPM. A continuación, extienda las células en placas de agar ampicilina LB e incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Transfiera una sola colonia a cinco mililitros de caldo de Lysogeny con ampicilina.

Incubar las muestras durante la noche a 37 grados centígrados mientras se agitan a 180 RPM. Extraiga la muestra de ADN utilizando un mini kit de preparación estándar para el análisis de secuencias de ADN. Ejecute al menos 200 nanogramos de construcción de HDNA en un analizador de ADN para verificar la secuencia mutante.

Exprime y purifica la proteína NRF2 mutante validada. Determine la cantidad de NRF2 mutada producida antes de proceder al ensayo de quinasa. Para comenzar el ensayo de competencia peptídica, prepare una solución tampón de quinasa 5X con una concentración de monofosfato de adenosina de 500 micromolares.

A continuación, descongele muestras congeladas de AMPK humano de tipo salvaje NRF2 y tres oliogogpéptidos que imitan los sitios de fosforilación de AMPK de NRF2. Para cada péptido, mientras está en hielo, combine 0,43 miligramos del péptido con 0,15 microgramos de AMPK, 0,4 microgramos de NRF2 y seis microlitros de tampón quinasa 5X. Añadir agua destilada estéril para conseguir un volumen final de 30 microlitros.

Luego, en un área protegida, configure un bloque calefactor a 30 grados centígrados. Agregue un microcurie de gamma 32P ATP a cada tubo, mezclando bien cada solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar las mezclas de reacción a 30 grados centígrados durante 15 a 30 minutos.

Durante la incubación, prepare el gel 7.5%STS PAGE. A continuación, añada tres microlitros de tampón de muestra 10X STS a cada tubo y mezcle bien para detener la reacción de la quinasa. Ejecute las muestras en el gel a 70 voltios durante 20 minutos y luego a 140 voltios durante una hora.

Al completar la electroforesis en gel, retire cuidadosamente el gel altamente radiactivo debajo de la línea azul de bromofenol. Transfiera suavemente el gel de la rueda a un tubo de vidrio. Fije el gel en una solución de 50% de metanol, 40% de agua y 10% de ácido acético durante 20 minutos.

A continuación, coloque suavemente el gel sobre papel de filtro y cúbralo con una envoltura transparente. Seque el gel con un secador de gel al vacío durante una hora a 80 grados centígrados. Exponga el gel seco a una pantalla de fósforo o a una película de rayos X durante aproximadamente 16 horas durante dos días respectivamente.

Utilice un Phosphorimager para generar un archivo TIFF o de mapa de bits de alta resolución de la pantalla. Para comenzar el ensayo de actividad de AMPK, descongele muestras de AMPK y de GST NRF2 de tipo mutante y salvaje en hielo. Combine 0,4 microgramos de GST NRF2 mutante con 0,15 microgramos de AMPK y seis microlitros de tampón quinasa 5X.

Agregue agua destilada estéril para llevar el volumen a 30 microlitros. Prepare otra mezcla de reacción de esta manera con 0,4 microgramos de GST NRF2 de tipo salvaje. Añada un microcurio de gamma 32P ATP a cada vial de reacción.

Pipetea las mezclas hacia arriba y hacia abajo varias veces y luego centrifuga brevemente las mezclas. Incubar las mezclas a 30 grados centígrados durante 30 minutos en un área blindada y luego terminar la reacción de quinasa con tres microlitros de tampón de muestra 10X STS. Ejecute STS PAGE, fije el gel y seque el gel utilizando las mismas condiciones que el ensayo de quinasa de la competencia.

Exponga el gel a una pantalla de fósforo durante la noche y escanee la pantalla con el Phosphorimager. Se realizó un ensayo AMPK in vitro en presencia de tres oligopéptidos de 10 residuos que imitan sitios de fosforilación de AMPK en NRF2 humano. El oligopéptido que imita el sitio Serine 558 ofreció la mayor competencia para la fosforilación de AMPK.

A continuación, se sintetizó y evaluó un mutante NRF2 que sustituyó a la serina 558 por alanina en un ensayo de actividad in vitro. Se observó muy poca fosforilación de AMPK del mutante S558 A, lo que indica que AMPK fosforila directamente NRF2 humano en Serine 558. Dado que los péptidos se unen competitivamente a las proteínas, el principio de este método también se puede aplicar para identificar otras modificaciones y posteriores a la traducción, como la acetilización y los residuos de lisina y las interacciones proteína-proteína.

No olvide que trabajar con radioisótopos puede ser extremadamente peligroso. Antes de realizar este procedimiento, ya se debe tomar capacitación en seguridad de radioisótopos.