El Modelo Invertido del Corazón para la Colección de Transudado Intersticial del Corazón de la Rata Aislada
20 de junio de 2017
Este protocolo describe un método para recoger fluido intersticial cardíaco del corazón de rata perfundido aislado. Para separar físicamente el transudato intersticial del perfusado de efluente venoso coronario, se invierte el corazón perfundido de Langendorff y se recoge el transudato (líquido intersticial) formado en la superficie cardiaca usando un tapón de látex blando.
El objetivo general de este modelo de corazón invertido es recolectar trasudados intersticiales cardíacos de un corazón de rata aislado. Dentro del corazón que late, el sentido individual del corazón libera factores paracrinos y los libera en el espacio de líquido intersticial circundante. Esto es importante, porque el espacio del líquido intersticial transporta información para la comunicación entre las células cardíacas.
Y eso es particularmente importante en condiciones de inflamación y regeneración del miocardio infartado. En este video, mis colaboradores, el Dr. Ding y Tan, les mostrarán las técnicas mediante las cuales nosotros, aquí, en este uh-love, recolectamos líquido intersticial de la superficie de un corazón de rata perfundido aislado. Para hacer la cubierta del corazón de látex, o tapa, tenga un molde de aluminio que coincida con el tamaño promedio del corazón de una rata y que haya sido pulido con papel de lija superfino.
Fije verticalmente el cuello del molde a la fresadora y comience a girar lentamente el molde. Luego, vierta 20 mililitros de látex líquido en un vaso de precipitados de vidrio de 50 mililitros y baje el molde giratorio en el látex hasta que se sumerja. Luego, levántalo lentamente y sigue girando el molde durante 15 minutos más hasta que el látex se haya solidificado.
La rotación es vital para hacer esta mousse y distribuir uniformemente la capa del látex líquido en la superficie del molde. Por lo tanto, asegúrese de que el molde esté girando a medida que se levanta del látex. Una vez que el látex esté seco, cúbrelo con polvos de talco para evitar daños al látex.
Detenga la rotación y, a continuación, separe suavemente el molde de la máquina. Retira con cuidado el látex del molde. Ahora, conecte un tubo de silicona de 25 centímetros de longitud a la salida de la tapa de látex.
Este tubo se utiliza para recoger el trasudado cardíaco intersticial o TC. A continuación, fije firmemente el balón ventricular del tamaño de una rata a una cánula metálica en forma de L, conectada a una jeringa llena de agua de un mililitro. Y llene el globo ventricular del tamaño de una rata con agua. Asegúrese de que el globo sea hermético inflándolo y desinflándolo varias veces con la jeringa.
A continuación, conecte la cánula a un transductor de presión, a través de un tope de tres vías. Por último, haga una marca en la jeringa donde el balón llenará la cavidad ventricular para medir la presión intraventricular. Antes de proceder con la preparación del corazón, prepare el sistema de perfusión de Langendorff de acuerdo con el protocolo de texto.
Ahora, después de anestesiar completamente una rata Wistar macho de 300 a 350 gramos, transfiérala a una mesa de operaciones a temperatura ambiente. Con la experiencia, los siguientes pasos que conducen a la canulación del corazón solo deberían tomar unos tres minutos. Levanta la piel y el músculo justo debajo del esternón, con pinzas, y corta alrededor del margen inferior de las costillas con unas tijeras gruesas.
A continuación, con unas tijeras finas, haz un pequeño corte en el diafragma en el margen de la costilla. A continuación, corta la costilla caudalmente para hacer un colgajo de toda la pared torácica ventral. Ahora, agarra suavemente el corazón y dale vida lentamente hasta que los vasos cardíacos comiencen a estirarse.
Luego, extirpe el corazón hasta que la aorta esté completamente expuesta y transfiera el corazón a un vaso de precipitados de 100 mililitros que contenga 50 mililitros de KHB helado. Ahora, lleve inmediatamente el corazón al aparato de profusión y monte la aorta en una cánula que gotee. Asegúrelo firmemente con una sutura 4-0, para que no puedan entrar burbujas de aire en el corazón.
A continuación, aplique una presión de profusión constante o un flujo de profusión. Para establecer la configuración del corazón invertido, primero gire suavemente la cánula aórtica hasta que la pared posterior del corazón esté enfrentada. Luego, corta el tejido conectivo para exponer la abertura a la aurícula izquierda.
A continuación, agarra suavemente el corazón y gíralo boca abajo. Monta el corazón en el balón ventricular preparado, con el balón desinflado, e introdúcelo en el ventrículo izquierdo. El corazón ahora se estabiliza mecánicamente en una posición vertical, utilizando el conjunto de catéter con balón como soporte.
Infle el globo hasta que llene toda la cavidad ventricular, avanzando el émbolo hasta la marca de llenado. Asegure el corazón para que haya una tensión mínima en la raíz aórtica. Esta parte del procedimiento requiere práctica.
Ahora, observe el manómetro del globo y ajuste la presión diastólica a tres a cinco milímetros de mercurio. Se formarán pequeñas gotas en el epicardio si la presión se establece correctamente. A continuación, tire suavemente de la tapa de látex sobre el corazón.
Incluso la superficie más ventricular debe estar cubierta. Antes de continuar, verifique si hay burbujas de aire dentro de la tapa. Para eliminar las burbujas de aire, utilice una succión suave de la jeringa.
Ahora, coloque el extremo del tubo de dejación a 10 centímetros por debajo del corazón. Recoja la TC que gotea en un tubo de 1,5 mililitros y mantenga el tubo por debajo de los cuatro grados centígrados incrustándolo en una mezcla 1:1 de hielo y cloruro de sodio. Recoja entre 0,15 y 1,5 mililitros de CT, luego pese la muestra y congélela en nitrógeno líquido.
Guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que pueda ser procesado. Al retrofundir el modelo de corazón invertido a una presión constante de 100 centímetros de agua, se pudo recoger entre 1/10 y 1% del efluente venoso coronario. El contenido de proteínas del TC se midió con el ensayo BCA y promedió 1,1 miligramos por mililitro.
La electroforesis simple en gel reveló un amplio espectro de proteínas. Las muestras normales se compararon con muestras de corazones sometidos a 50 minutos de reperfusión por isquemia utilizando 2D DIGE. Se encontró que varias proteínas estaban reguladas al alza en la TC de los corazones isquémicos.
Se realizó un análisis proteómico de las proteínas reguladas al alza. Las purinas también eran de gran interés. Las purinas son moléculas de señalización fundamentales que regulan la respuesta inmunitaria cardíaca, el tono vasomotor y la función cardíaca, especialmente después de una lesión isquémica.
El análisis de HPLC de la tomografía computarizada mostró concentraciones elevadas de muchas purinas en los corazones lesionados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que una trans-in-date cardíaca que se forma en un corazón aislado, no imitará completamente la verdadera composición de las condiciones in-vee-vuh.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para recolectar líquido intersticial cardíaco de un corazón de rata aislado y perfundido. La técnica consiste en invertir el corazón perfundido mediante Langendorff para separar el trasudado intersticial del perfusado efluente venoso coronario.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología cardíaca
- Dinámica de fluidos
- Señalización paracrina
Antecedentes
- El corazón libera factores paracrinos hacia el líquido intersticial circundante.
- Este líquido es crucial para la comunicación entre las células cardíacas.
- Comprender la dinámica del líquido intersticial es importante en la inflamación y la regeneración miocárdica.
- El estudio utiliza un modelo de corazón invertido para la recolección de líquido.
Objetivo del estudio
- Recoger el trasudado intersticial cardíaco de un corazón de rata aislado.
- Investigar el papel del líquido intersticial en la comunicación entre células cardíacas.
- Desarrollar técnicas para estudiar la fisiología cardíaca bajo condiciones específicas.
Métodos Utilizados
- Aislamiento del corazón de rata mediante perfusión Langendorff.
- Inversión del corazón para facilitar la recolección de fluido.
- Uso de una tapa de látex blando para recolectar el fluido intersticial.
- Creación de un molde de aluminio para la tapa de látex que coincida con el tamaño del corazón de rata.
Resultados principales
- Recolección exitosa de líquido intersticial de la superficie cardíaca.
- Demuestra la eficacia de la técnica en un entorno de laboratorio.
- Información sobre el papel del líquido intersticial en la salud y enfermedad cardíacas.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de la inflamación y regeneración miocárdica.
Conclusiones
- El método proporciona una manera confiable de recolectar el líquido intersticial cardíaco.
- Comprender la dinámica del líquido intersticial puede mejorar la investigación cardíaca.
- Este protocolo puede aplicarse a estudios posteriores sobre la comunicación entre células cardíacas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite el muestreo directo del trasudado intersticial cardíaco, proporcionando acceso a moléculas de señalización paracrina que regulan la función cardíaca y la respuesta inmune. Al aislar el líquido intersticial del efluente venoso coronario, los investigadores pueden reducir el riesgo en la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos cardiovasculares mediante una comprensión mecanicista de los entornos de señalización relevantes para la enfermedad. El enfoque favorece la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al capturar biomarcadores endógenos liberados durante la lesión por isquemia-reperfusión y la inflamación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el muestreo de factores paracrinos endógenos liberados al espacio intersticial.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite la validación funcional de dianas bajo condiciones controladas ex vivo.
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la medición directa de metabolitos purinérgicos y biomarcadores proteicos asociados con lesión isquémica.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara muestras biológicas validadas para el desarrollo de ensayos posteriores dirigidos a vías de señalización cardíaca.
- Valor operativo: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados y reproducibles mediante análisis por HPLC y proteómico, listos para la selección de compuestos.
- Valor científico: Facilita la evaluación confiable de los efectos de los compuestos sobre la liberación de biomarcadores endógenos en un microentorno controlado de líquido intersticial.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con el descubrimiento traslacional de biomarcadores al identificar proteínas y purinas sobreexpresadas en el trasudado cardíaco isquémico.
- Valor operativo: Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la relevancia fisiológica del modelo de corazón aislado.
- Valor científico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la composición del líquido intersticial con procesos de inflamación y regeneración miocárdica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo de corazón invertido se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar información mecanicista que orienta la selección de dianas y las decisiones de optimización de compuestos previamente a las campañas de cribado fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el muestreo directo del líquido intersticial que contiene moléculas señalizadoras.
- Selección: Permite la preparación de ensayos al generar muestras estandarizadas de transudado adecuadas para la cuantificación mediante HPLC de metabolitos purinérgicos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de proteínas y metabolitos que permiten el análisis comparativo entre estados de control y enfermedad.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la captura de biomarcadores relevantes para modelos de infarto de miocardio y lesión por reperfusión.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la validación de dianas cardiovasculares en múltiples áreas terapéuticas que implican señalización paracrina.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las redes de señalización paracrina cardíaca.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante la recolección controlada de fluidos en condiciones definidas de perfusión.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar acceso directo a biomarcadores endógenos que reflejan la interacción con el objetivo en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos cardiovasculares basada en la modulación de biomarcadores mecanicistas en el fluido intersticial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en perfusión Langendorff y cirugía cardíaca para el aislamiento del corazón y la canulación retrógrada.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo transductores de presión, catéteres con balón e instrumentos de recogida con temperatura controlada.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de manipulación, procesamiento y análisis de fluidos (por ejemplo, BCA, HPLC, DIGE 2D) para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el modelo a diferentes condiciones cardíacas (por ejemplo, isquemia-reperfusión, inflamación) para mantener la relevancia fisiológica.
- Incluye limitaciones prácticas, como tasas variables de recogida de transudado (17–147 µL/min) y dilución respecto al efluente venoso coronario (0,1–1 %), lo que puede afectar la sensibilidad de detección de analitos.
