Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

El objetivo general de este procedimiento es observar y cuantificar el factor de von Willebrand o la formación de hilos plaquetarios VWF en respuesta a secretagogos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología factorial de Von Willebrand y la fisiopatología corporal wavo-paliativa. También nos ayuda a responder preguntas sobre las mutaciones que afectan la liberación del factor de von Willebrand y la función de unión de las plaquetas.

La principal ventaja de esta técnica es que recapitula las interacciones in vivo entre el colágeno subendotelial, las células endoetoliales, el FVW y las plaquetas en un sistema in vitro visual y cuantificable. Creo que la demostración visual de este método es vital. Los pasos de microscopía necesarios para capturar la formación de cadenas de plaquetas VWF en múltiples condiciones simultáneas en tiempo real pueden ser difíciles de dominar solo con texto.

Comience cargando 0,5 mililitros de tampón de recubrimiento de colágeno en una jeringa Luer Lock de 1 mililitro. Gire el extremo de la jeringa en el depósito de un portaobjetos de la cámara de flujo y presione el émbolo lentamente hasta que todo el carril esté cubierto y cada depósito esté lleno. Rellene los depósitos para asegurarse de que cada uno esté lleno.

Cuando se hayan cargado todos los carriles, incube la cámara a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, utilice una pipeta de 200 microlitros para eliminar el tampón de recubrimiento de colágeno. A continuación, enjuague cada carril con HBSS, aspirando la solución salina con una pipeta de 200 microlitros.

Después de descartar la tercera ronda de HBSS, agregue aproximadamente tres veces 10 a la 6ª Célula Endotelial de Crecimiento Sanguíneo por mililitro en 100 microlitros de medio de crecimiento, suplementado con 10% de FBS en cada carril de la cámara de flujo. Luego regrese la cámara a la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas, cambiando el medio cada ocho a 12 horas. Para ensamblar el aparato de flujo, primero conecte un conector luer de codo macho a un extremo de cada una de las tres piezas de 70 centímetros de tubo de silicona estéril.

Y conecte un adaptador de bloqueo luer hembra al otro extremo de cada tubo. Conecte los adaptadores de bloqueo luer hembra a jeringas individuales de 20 mililitros y programe la bomba de jeringa. Cargue las jeringas en la bomba y asegure firmemente los soportes alrededor de las jeringas y los émbolos.

A continuación, conecte los luers de codo macho individuales a ambos extremos de tres piezas diferentes de 20 centímetros de tubo de silicona estéril y conecte una aguja roma de calibre 18 a uno de cada uno de los tres luers de codo. A continuación, en un microscopio de disco giratorio equipado con una platina totalmente automatizada, seleccione el objetivo 20x y establezca los ajustes de canal adecuados. Para obtener el rango de datos dinámicos completo, configure el dispositivo acoplado a la carga multiplicadora de electrones a una ganancia de multiplicación de electrones de 150 con un tiempo de exposición de 200 milisegundos.

Ajuste la potencia del láser de 491 nanómetros al 20% y utilice el software del microscopio para marcar el centro de los tres carriles. Establezca el rango Z en 1,0 micrómetros y el tamaño del paso en 0,5 micrómetros. Por último, seleccione la duración y el intervalo para capturar una imagen cada 10 segundos a 60 puntos de tiempo por diapositiva.

Para inducir la formación de cadenas de plaquetas VWF, reemplace el medio de cultivo de tres carriles de la cámara de flujo, con medio libre de suero solo como control, luego el estimulante de interés diluido en 100 microlitros de medio libre de suero a los carriles adicionales. A continuación, incubar la cámara durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final del período de estimulación, lave los tres carriles con 100 a 200 microlitros de PBS y use clips vasculares para mapear la cámara de flujo en un soporte de portaobjetos.

Conecte un conector luer macho desde el extremo de un trozo de tubo de 70 centímetros a cada depósito de la cámara de flujo. Y encienda la bomba de jeringa para eliminar el lavado de PBS. Pipetee PBS adicional en el depósito de la cámara de flujo opuesta para asegurarse de que los carriles no se sequen.

Una vez que se confirme el flujo equivalente, detenga la bomba de jeringa. Conecte una jeringa de 5 mililitros con un acoplador de bloqueo Luer hembra al primer conector Luer macho libre. Y sumerja la aguja desafilada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga una solución de plaquetas lavadas etiquetada con fluorescencia.

Lentamente, extraiga la solución de plaquetas a través del tubo para asegurarse de que no haya burbujas de aire dentro del sistema. Conecte el luer macho al depósito abierto de la cámara de flujo y cargue los otros dos carriles con solución de plaquetas, como se acaba de demostrar. Verifique la configuración del sistema de flujo para asegurarse de que todas las conexiones sean seguras.

Reinicie la bomba de jeringa e imagine el flujo de plaquetas durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, desconecte el luer del tubo de admisión en el depósito de la cámara de flujo. Y llene el depósito con PBS para mantener un flujo salino suave sobre la monocapa de células endoteliales.

Para cuantificar la formación de cadenas de plaquetas VWF, capture 10 imágenes por diapositiva de cada carril sin superposición desde el centro de la diapositiva. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, abra el software de procesamiento de imágenes y haga clic en imagen, ajustar y contraste de brillo. Para ajustar el brillo de la primera imagen, arrastre la barra de desplazamiento hasta que las plaquetas adheridas se puedan ver lo suficientemente bien como para la cuantificación.

A continuación, registre una cadena de plaquetas VWF cuando se observen tres o más plaquetas alineadas y cuente todas las cadenas de la imagen. Tras el inicio de las condiciones de flujo, las células no tratadas muestran muy pocas cadenas de plaquetas VWF en comparación con las células tratadas con histamina o PMA. Los cuales exhiben un promedio de dos a tres cadenas por campo de visión.

Además, las histonas, que activan las plaquetas así como las células endoteliales, inducen la producción de más cadenas de plaquetas VWF que los controles estimulados por HRAW, histamina o PMA sin tratar. Al intentar este procedimiento, mantenga las plaquetas inactivas hasta el experimento de flujo desechando el primer tubo de recolección de extracción de sangre, manteniendo todos los reactivos a temperatura ambiente y utilizando una técnica de pipeta suave. Se pueden realizar modificaciones a este procedimiento para evaluar la formación de cadenas de plaquetas VWF en presencia de leucocitos, agentes activadores de plaquetas o la disolución de cadenas por el átomo de la enzima de escisión TS13.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la formación de hilos de plaquetas VWF inducida por secretogogo y el modelo de cámara de flujo in vitro.