Name: Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a cuantificar la formación de cadenas VWF-plaquetas en respuesta a secretagogos usando un sistema de cámara de flujo in vitro. Este método permite estudiar la fisiopatología de von Willebrand y evaluar mutaciones que afectan la función plaquetaria.

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Alison Michels es un recipiente de Frederick Banting y Charles Best Canadá becas postgrado de los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Laura L. Swystun es el recipiente de una beca CIHR. David Lillicrap es el receptor de una Cátedra de investigación de Canadá en Molecular de la hemostasia. Este estudio fue financiado en parte por un subvención (MOP-97849) de funcionamiento el CIHR.

Estos estudios fueron aprobados por la Universidad de Canadá de la investigación ética Junta de Reina.
1. endotelial celular estimulación
<ol><li>
Capa de colágeno una placa de cultivo de tejidos bien 6.
	<ol>
<li>24 horas por adelantado, una placa de cultivo de tejidos bien 6 a 37 ° C con 1 mL de colágeno de capa del almacenador intermediario (50 μg/mL rata cola colágeno tipo 1 con 0.02 M de ácido acético glacial).</li>
		<li>Lavar los pozos dos veces con 2 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS). Nota: Las placas pueden ser envuelto en papel de aluminio y almacenadas en una bolsa hermética de plástico a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semilla de las células endoteliales con una densidad de 1 x 106 células por pocillo en 2 mL de crecimiento medio con 10% suero bovino fetal (FBS). Incube las células durante 24 h a 37 ° C (5% CO2). Nota: Aquí, se utilizaron sangre consecuencia las células endoteliales (BOECs) entre 5 y 15 pasos. BOECs fueron aisladas de voluntarios sanos con una secuencia VWF wildtype usando un método de referencia en Starke et al. 22 de una manera similar a la descrita por Zeus23.</li>
	<li>Retire el medio después de 24 h y lavan las células con HBSS.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio sin suero (medio de cultivo esencial mínimo sin SFB) con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; 100 nM), histonas no fraccionada (UH) y Hong Kong o HR (todos en 25 μg/mL) a las células por 2 h a 37 ° C (5% CO2). Nota: Esta concentración de la histona se basó en anteriores informes en vitro la citotoxicidad por Xu et al. 24 y Abrams et al. 25 que 50 μg/mL.</li>
	<li>Recoger el medio después de 2 h y almacenar a-20 ° C hasta su análisis.</li>
</ol>2. VWF cuantificación de enzima-ligó análisis del inmunosorbente (ELISA)
<ol><li>Capa de una microplaca con 100 μl de la capa buffer (10 mM dibásico fosfato de sodio y 145 mM cloruro de sodio, pH 7,2) que contiene 10 μg/mL policlonal anticuerpo anti-VWF durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lave la placa tres veces con 250 μl de tampón de lavado (fosfato dibásico de sodio 10 mM, 500 mM cloruro sódico y 0,1% Tween 20, pH 7,2).</li>
	<li>Diluir las muestras medianas 1:2 y 1:4 con solución de lavado y utilizar el plasma normal de referencia para una curva estándar, empezando en un 1:10 dilución.</li>
	<li>Placa de 100 μl de muestras diluidas y normas durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lave la placa tres veces con 250 μl de tampón de lavado.</li>
	<li>Añadir 100 μl de anti-VWF diluido, anticuerpo de detección conjugado con HRP (1,1 μg/μl de tampón de lavado) en la placa e incubar 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la placa e incubar durante 10 minutos con el reactivo de O-fenilendiamina dihidrocloruro (OPD), según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Detener la reacción con 100 μl de 1 M H2hasta4 y leer la placa a 492 nm.</li>
</ol>3. fase sólida histona-VWF obligatorio análisis
<ol><li>Capa de una microplaca con histonas, diluidas en 0,5% sodio desoxicolato 50 mM carbonato tampón (pH 9.6 a 10 μg/mL durante la noche a 4 ° C.)</li>
	<li>Lave la placa tres veces con 250 μl de PBS suplementado con 0,1% Tween 20, incubando durante 10 min entre lavados.</li>
	<li>Bloque de la placa con 200 μL de PBS suplementado con 0,1% Tween 20 y 1% albúmina de suero bovino (BSA) por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el paso 3.2.</li>
	<li>Diluir en serie derivados de plasma VWF/factor humano VIII complejo de 200 mU/mL a 25 mU/mL en tampón salino (cloruro de sodio de 500 mM de 10 mM fosfato sódico dibásico, y 0,1% Tween 20, pH 7,2). Adicionar 100 μl a la placa por 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el paso 3.2.</li>
	<li>Detectar el atascamiento del VWF a las histonas inmovilizados con 100 μl de una solución que contiene PBS-0.1% Tween 20 y 1:1,000 conejo policlonales anti-VWF anticuerpo conjugado con HRP por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el paso 3.2.</li>
	<li>Incubar la placa por 30 min con 100 μl de reactivo OPD y detener así la reacción con 100 μl de 1 M H24. Medir la densidad óptica a 492 nm.</li>
</ol>4. siembra de células endoteliales en cámaras de flujo
<ol><li>Coloque 0,5 mL de tampón de recubrimiento de colágeno (descrito en el paso 2.1) en una jeringa de 1 mL Luer-lock.</li>
	<li>Gire el extremo de la jeringa de Luer-lock en el depósito de una diapositiva de la cámara de flujo.</li>
	<li>Presione el émbolo lentamente hasta que está cubierto el carril entero y cada depósito está lleno. Repita para cada carril e incubar la cámara a 37 ° C durante 24 h.</li>
	<li>Aspire el búfer de la capa de colágeno con una pipeta de 200 μL. Carga otra jeringa con 1 mL HBSS y presionar el émbolo lentamente para lavar cada carril de la cámara de flujo. Aspire el lavado con pipeta 200 μL en el extremo opuesto de la cámara de flujo. Repetir dos veces.</li>
	<li>Pipeta aproximadamente 100 μl de una solución de células endoteliales (BOEC) 3 x 106 células/mL en un medio con 10% FBS en el carril de una cámara de flujo. Nota: La densidad de siembra de células endoteliales excede la capacidad de la cámara. Esto es para asegurar una cobertura máxima del canal; las células no adherentes se retiran en la etapa de lavado posterior.</li>
	<li>Incubar la cámara a 37 ° C durante 24 h. cambio el medio cada 8-12 h utilizando jeringas Luer-lock (como en el paso 4.4). Asegúrese de que hay no hay burbujas visibles en los carriles.</li>
</ol>5. aislando las plaquetas de sangre humana
<ol><li>En un gabinete con una aguja de 30 G de seguridad biológica, añadir 300 μL de tampón de ácido citrato dextrosa (citrato trisódico 85 mM, 111 mM D-glucosa y ácido cítrico de 71 mM, pH 4.5) a un vacutainer de colección de sangre sin aditivos 3 mL.</li>
	<li>Recoger sangre de voluntarios sanos (libres de medicamentos antiplaquetarios y no esteroideos durante siete días) por venopunción (tres tubos de 3 mL cada uno), siguiendo un protocolo similar a la publicada por Bernardo et al26.</li>
	<li>Deseche el primer tubo, ya que el daño del tejido inicial asociado a la venopunción puede causar activación plaquetaria espontánea.</li>
	<li>Invertir suavemente los vacutainers tres veces para mezclar la sangre con anticoagulante.</li>
	<li>Centrifugue los vacutainers a 150 x g durante 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).</li>
	<li>Lentamente retire el plasma rico en plaquetas (sobrenadante) con una pipeta en un gabinete de seguridad biológica y cuidadosamente transferirlo a un tubo cónico de 15 mL. Transferir el volumen rico en plaquetas de cada vacutainer a un tubo cónico único para evitar la potencial activación de Cruz. Nota: Aislamiento de plaquetas debe realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación bacteriana, potencial artificial plaquetas y activación endotelial de seguridad biológica.</li>
	<li>Centrifugar los tubos cónicos a 900 x g por 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente) para que sedimenten las plaquetas.</li>
	<li>Pipeta y descarte el sobrenadante pobre en plaquetas.</li>
	<li>Lavar el pellet con 1 mL de tampón de citrato glucosa de sodio (CGS) (citrato de sodio 13 mM, 30 mM D-glucosa y cloruro de sodio de 120 mM, pH 7.0). Nota: Las plaquetas aparecen en formaciones semejantes a wisp cuando se añade el buffer CGS y el pellet se resuspendió suavemente. En muestras contaminadas por activación de las plaquetas, las plaquetas no se suspender fácilmente y aparecerán clumpy.</li>
	<li>Una vez completamente suspendidas, centrifugar las muestras a 900 x g por 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente).</li>
	<li>Extraiga el tampón de lavado CGS y resuspender el precipitado en 3 mL de solución de Tyrode (cloruro de sodio de 138 mM, 5.5 mM D-glucosa, bicarbonato de sodio de 12 mM, cloruro de potasio de 2,9 mM y 0,36 mM fosfato de sodio dibásico, pH 7.4). Asegurar la completa resuspensión de las plaquetas y, si se observan agregaciones, deseche la muestra.</li>
	<li>Añadir 1,5 μl de una solución madre DiOC6 (disolver 57,25 mg en 5 mL de metanol) de 20 mM a cada tubo cónico de 3 mL de plaquetas lavadas para una concentración final de 1 μm. Nota: DIOC6 es un tinte mitocondrial fluorescente verde utilizado en este experimento a las plaquetas de la etiqueta.</li>
	<li>Alícuota 1 mL de la solución de lavado de plaquetas a los tres tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Nota: El volumen de plaquetas para este experimento se calcula basándose en el tamaño de la cámara de flujo, la tensión de esquileo deseada y la longitud del experimento (paso 6.5). Este protocolo puede ajustarse cuando cambian las condiciones para asegurar que haya suficiente volumen de flujo de fluidos.</li>
	<li>Utilizar las plaquetas lavadas dentro de 2 h de aislamiento.</li>
</ol>6. flujo aparato Asamblea
<ol><li>Coloque una pieza de 70 cm de silicona estéril de la tubería (diámetro interior de 1,6 mm) a un conector de Luer macho codo en un extremo y un adaptador de cerradura de Luer hembra en el otro.</li>
	<li>Conecte el adaptador de cerradura de Luer hembra conectado a la tubería a una jeringa de 20 mL.</li>
	<li>Repita los pasos del 6.1 y 6.2 dos veces para generar tres idénticas conexiones de tubo de la jeringa.</li>
	<li>
Utilizar una bomba de jeringa para generar flujo de fluidos. De entrada los siguientes ajustes a la bomba de jeringa: diámetro interior de la tasa de flujo y jeringa. Nota: Una jeringa de 20 mL tiene un diámetro interior de 19,55 mm. El caudal se calcula basándose en la deseada tasa/corte y las dimensiones de la cámara de flujo. La cámara de flujo utilizada en el estudio actual, para lograr 1 dyn/cm2 (venosa baja observada en corte), se requiere un caudal de 9,37 μl/min. Debido a pruebas que vinculen a las histonas a la trombosis venosa, se selecciona un esquileo venoso moderado de 4.45 dyn/cm2 . Esto también se basa en el supuesto de que el buffer tiene una viscosidad similar al agua. El caudal es entonces igual a 41,7 ecuaciones μl/min permite calcular que el caudal para varias dimensiones de cámara de flujo se puede encontrar en:<ol>
<li>Ajustar la bomba para retirar el líquido utilizando la opción de botón de la bomba de jeringa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carga las tres jeringas conexión a la tubería de la bomba de jeringa y sujete firmemente los soportes alrededor de las jeringas y émbolos.</li>
	<li>Conecte un codo macho Luer a ambos extremos de una segunda pieza de 20 cm de tubo de silicona estéril.</li>
	<li>Conecte un codo de Luer a una aguja de calibre 18 blunted.</li>
	<li>Repetir dos veces, creando tres sistemas de consumo idéntico para los tres carriles de la cámara de flujo. Nota: El tubo de silicona y Luer se puede lavar con lejía 10% seguido de agua destilada antes de reutilizarlos. No se recomienda reutilizar las cámaras de flujo.</li>
</ol>7. microscopio ajustes
<ol><li>Usar un microscopio de disco giratorio equipado con una etapa totalmente automatizada. Realizar la iluminación con un lanzamiento de láser que ofrece 405 458, 491, 543 y líneas de láser de 633 nm. Captura todas las imágenes con el objetivo 20 X. Ajustar todos los parámetros con el software de análisis (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).</li>
	<li>Seleccione los ajustes del canal (filtro de emisión: 520/35), con excitación a 491 nm, para la adquisición. Fijar el electrón multiplicando el dispositivo de carga acoplada a una ganancia de electrones multiplicando de 150, con un tiempo de exposición de 200 ms, para obtener el rango de datos dinámico completo. Nota: Las plaquetas están etiquetadas con un colorante fluorescente verde, DiOC6, con máximos de longitud de onda (excitación, 482 nm, emisión, 504 nm).</li>
	<li>Ajustar la potencia del láser nm 491 al 20%.</li>
	<li>El centro de todos los tres carriles y seleccione 1 μm para la gama z y 0.5 μm de tamaño de paso. Seleccione el número de puntos de tiempo (es decir, duración) y el tiempo entre imágenes (es decir, intervalo) para capturar una imagen cada 10 s; Seleccione "60 puntos de tiempo" por diapositiva. Ajuste del microscopio para capturar imágenes de los tres carriles y guardarlos en una carpeta designada experimento. Nota: Debido a que la cámara de flujo tiene tres carriles, el microscopio necesitará alternar entre tres posiciones para capturar las imágenes.</li>
</ol>8. VWF-plaqueta cadena formación
<ol><li>Retire el medio de cultivo de la cámara de flujo (del paso 4) utilizando la misma técnica como en el paso 4.4.</li>
	<li>Añada 100 μl de cada histamina (25 μm), PMA (100 nM), UH, Hong Kong o HR (todos en 25 μg/mL) diluido en medio libre de suero (como en el paso 1.4) para estimular la monocapa BOEC durante 15 min a temperatura ambiente y ambiente O2/CO2. Nota: Aunque no es necesario para la liberación de FvW, realizar esta estimulación a 37 ° C mejorará la VWF exocitosis27.</li>
	<li>Asegúrese de que uno de los tres carriles separados de la cámara de flujo siguen siendo no tratados como control experimental.</li>
	<li>Retire el medio utilizando una jeringa de 1 mL y reemplazarlo con 100-200 μL de PBS para lavar los secretagogos de la monocapa endotelial.</li>
	<li>Monte la cámara de flujo en un stand portaobjetos usando clips vasculares para asegurar la cámara en el lugar.</li>
	<li>Fije el disponible conector Luer macho en el extremo de la tubería de 70 cm (conectado a la jeringa) para el depósito de la cámara de flujo. Repita para los dos otros flujo cámara carriles.</li>
	<li>Arrancar la bomba de jeringa para eliminar el lavado de PBS. Pipeta PBS adicionales al depósito de cámara de flujo opuesto para asegurar que los carriles no funcione en secos.</li>
	<li>Observar el sistema de flujo para el flujo equivalente a través de todos los tres carriles y luego detener la bomba de jeringa.</li>
	<li>Seleccione un área para capturar las imágenes en la mitad de cada carril, en áspero la misma área entre experimentos. Nota: La persona que utilice el microscopio puede ser ciego a las condiciones experimentales. Este paso asegura que el microscopio está enfocado antes de flujo plaquetas (consulte el paso 7).</li>
	<li>Conectar un acoplador de hembra luer<a> </a>a una jeringa de 5 mL y luego al conector luer macho libre (paso 6.8) y sumergir la aguja blunted en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene la solución de plaquetas lavadas (paso 5.13). Sacar lentamente la solución de plaquetas a través de la tubería para no asegurar burbujas de aire dentro del sistema.</li>
	<li>Retire la jeringa de 5 mL y conectar el Luer masculino al depósito abierto de la cámara de flujo. Repita para los tres carriles.</li>
	<li>Reiniciar la bomba de la jeringuilla y capturar imágenes durante el flujo de plaquetas utilizando la configuración de microscopio y protocolo del paso 7 para 10 min en la oscuridad.</li>
	<li>Después de 10 minutos, desconectar el Luer del tubo de aspiración en el depósito de la cámara de flujo y llene el depósito con PBS para mantener el flujo sobre la monocapa endotelial.</li>
</ol>9. VWF-plaqueta cadena cuantificación
Nota: El flujo continuo de PBS es necesaria para mantener la elongación de la cadena de VWF-plaqueta para análisis de imagen. Cese de flujo resultará en el VWF ser globulares y afectará cuantificación de cadena de VWF-plaqueta. Es esencial para recargar en cada depósito con PBS durante la captura de la imagen. HBSS puede reemplazar PBS si se observa contracción de la célula o desprendimiento durante este paso.
<ol><li>Empezando por el primer carril, captura 10 imágenes por diapositiva sin superposición con un objetivo X 20 alrededor de mitad de la diapositiva. Repita esto para cada carril. Nota: Las áreas que rodean los embalses deben evitarse debido a la turbulenta.</li>
	<li>Utilizando software de procesamiento de imagen, ajustar el brillo haciendo clic en "Imagen", "Ajuste" y "Luminosidad." Arrastre la barra de desplazamiento hasta que las plaquetas adheridas se pueden ver lo suficientemente bien como para la cuantificación.</li>
	<li>Grabar una cadena de FvW plaquetario cuando tres o más alineadas plaquetas se observan en la imagen. Contar todas las cadenas de VWF-plaqueta en una imagen. Repita para todas las 10 imágenes y media para el experimento. Nota: La persona que realiza la cuantificación puede ser ciego a las condiciones experimentales. No es necesario Co mancha para VWF, como esto ha sido confirmado por estudios independientes8,28,29.</li>
	<li>Repetir el experimento un mínimo de tres veces para evaluar cada secretagogo.</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Mientras que la relevancia fisiológica de VWF-plaqueta cadenas sigue siendo polémico debido a su rápida disolución en presencia de la proteasa hiende VWF ADAMTS13, sirven como un modelo cuantificable en vitro de reclutamiento de plaquetas por VWF a un sitio en que puede formar un trombo en la presencia de localizada aumento de histona niveles5. Por otra parte, en patologías falta ADAMTS13 actividad, tales como púrpura thrombocytopenic trombótica (TTP) - o en microambientes inflamatorios -...

La trombosis es la principal causa de mortalidad en todo el mundo1 y puede convertirse en respuesta todysregulated plaqueta activación trombina generación y en ambas arterias veinsand. Niveles del plasma del VWF están un regulador clave de la coagulación sanguínea, por el que baja los niveles (< 50%) como resultado del desorden de la sangría conocido como von Willebrand (VWD) la enfermedad2 y altos niveles (> 150%) están asociados con un mayor riesgo de venosa3 y trombosis arterial4 .
FvW es una glicoproteína multimérica sintetizada por células endoteliales y megacariocitos y almacenado en α-gránulos de la plaqueta y WPBs, respectivamente. Sobre desafío hemostático, VWF puede liberarse de WPBs endoteliales para atar las plaquetas circulantes a las células endoteliales activadas5 o colágeno expuesto en la pared de vaso6. Anclaje del VWF a las células endoteliales se ha demostrado para ser mediado por P-selectin7 y la integrina αvβ38. El lanzamiento subsecuente de tiendas de α-gránulos de plaquetas puede aumentar concentraciones localizadas de VWF para estabilizar la interacción de plaquetas-plaquetas para la formación de tapón de plaquetas, el andamio necesario para la propagación de fibrina y la cascada de coagulación deposición. La actividad de unión a plaquetas de VWF está regulada por su estructura multimérica, con Multímeros de peso molecular alto que poseen mayor actividad hemostática9,10. En circulación, VWF también actúa como un portador para el factor VIII de coagulación.
Líquido tensión de esquileo es un regulador esencial de la fisiología VWF. En la ausencia de tensión de esquileo, VWF existe en una forma globular, encubrimiento de dominios de unión de la glicoproteína plaquetaria Ib adhesión11. Cuando existe tensión de esquileo, el sitio de la hendidura para una metaloproteinasa, una conclusión y metalloprotease con motivo del thrombospondin (ADAMTS13), se expone. ADAMTS13 hiende desnudas y plaquetas decoradas VWF cadenas de regular tamaño de multimer, reduciendo su actividad hemostática12.
VWF es una proteína de fase aguda, y numerosos estímulos, incluyendo hipoxia13, infección14y citoquinas proinflamatorias, se ha demostrado para mediar la liberación de FvW de las células endoteliales. Similar a otros agentes inflamatorios, las histonas extracelulares también han demostrado para inducir la liberación de FvW sistémica en ratones15,16 y la activación de las plaquetas en vitro17,18, 19. esto fue demostrado para ser dependiente sobre el subtipo de histonas, como diferencias en lisina y contenido de arginina puede influir en la función15. Nuestro estudio pretende establecer una cámara de flujo modelo para investigar la influencia de los ricos en lisina (HK) y captura de ricos en arginina (HR) los subtipos histona y secretagogos en la liberación de FvW endotelial y plaquetaria en tiempo real, posibles acontecimientos tempranos en trombosis inducida por inflamación.
Esta metodología de la cámara de flujo recapitula en vivo las interacciones entre el colágeno subendotelial, células endoteliales, FvW y plaquetas en un sistema en vitro que es cuantificables, reproducibles y visual. Permite la evaluación en tiempo real de todos los aspectos de la vía que regula la interacción VWF-plaqueta, incluyendo secreción de WPB, activación plaquetaria y proteólisis VWF. Estudios de VWF bajo condiciones de estrés de cizallamiento controlados se han utilizado para evaluar mutaciones de VWD que afectar la liberación de FvW y Unión a plaquetas función20, WPB fisiología21y escote VWF por ADAMTS135. Utilizamos esta metodología para cuantificar la formación de cadena de FvW plaquetas como consecuencia de un estímulo inflamatorio: las histonas extracelulares.

<table><tbody><tr><td>Histonas no fraccionadas de ternero-timo (UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>Reconstituido en medio reducido en suero (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Histonas ricas en lisina de médula y timo (HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>Reconstituidas en medio reducido en suero (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Histonas ricas en arginina de ternero-timo (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Reconstituidas en medio reducido en suero (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>reconstituido en DMSO (20 mM)</td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Reconstituido en agua (50 mg/mL)</td></tr><tr><td>3,3' Dihexiloxacarbocianina Yoduro (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>Reconstituido en metanol (20 mM)</td></tr><tr><td>Conejo Anti-VWF Recubrimiento Anticuerpo</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>para VWF ELISA</td></tr><tr><td>Anticuerpo de detección anti-VWF de conejo, HRP conjugado</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>Para VWF ELISA y ensayo de unión a histonas-VWF</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp de fondo plano de 96 pocillos</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td> Para ensayo de <td>unión a histonas-VWF</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Microtitulación de fondo plano Placas de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>para VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>Complejo de factor von Willebrand/factor VIII humano derivado del plasma derivado del plasma</td></tr><tr><td>Referencia normal</td><td>BioLogic</td><td>CCNRP-05</td> para el reactivo de diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD) de la <td>curva estándar ELISA de VWF</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>Producto equivalente disponible a través de ThermoFisher Scientific (Número de catálogo: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Para cultivo e inicialización siembra de BOEC</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata tipo 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Medios de suero reducidos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>para la estimulación de células endoteliales</td></tr><tr><td>METAMORPH Microscopía Software de automatización y análisis de imágenes</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Tubos de Extracción de Sangre, Sin Aditivos</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide III 0.1 (cámaras de flujo)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>Este producto ha sido descatalogado. Sugerimos utilizar &micro;-Slide VI 0.1 (#80661) o 0.4 (# 80601) y recalcular el caudal y el volumen de plaquetas necesarios para mantener un esfuerzo cortante de 4.45 dyn/cm2 Tubo de</td></tr><tr><td>silicona de 1,6 mm ID: 5 m, esterilizado</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Conector Hembra: Polipropileno natural, esterilizado</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Codo Luer Conector macho: polipropileno blanco, esterilizado</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Aguja desafilada de 18G</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 20 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- Microscopio de disco giratorio 4X1</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

investigación de von willebrand factor fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von willebrand de la plaqueta factor cadena de formación

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Factor de von Willebrand (VWF) es un factor de coagulación de glicoproteína multimérica que media la adherencia plaquetaria y agregación en los sitios de daño endotelial y que lleva factor VIII en la circulación. FvW es sintetizado por las células endoteliales y constitutivamente o se libera en el plasma o se almacena en organelos especializados, llamados cuerpos de Weibel-Palade (WPBs), para el lanzamiento de la demanda en respuesta al reto hemostático. Estímulos procoagulantes y proinflamatorias rápidamente pueden inducir exocitosis WPB y liberación de FvW. La mayoría de los liberados por las células endoteliales de FvW circula en el plasma; sin embargo, una proporción de VWF está anclada a la superficie de la célula endotelial. Bajo condiciones de corte fisiológico, FvW endotelial anclado puede enlazar a las plaquetas, formando una cadena de FvW plaquetario que puede representar el nido de formación de trombos. Un sistema de cámaras de flujo puede utilizarse para observar visualmente la liberación de FvW de las células endoteliales y las plaquetas subsecuente captura de manera reproducible y relevante en la fisiopatología de la formación del trombo mediada por el VWF. Utilizando esta metodología, las células endoteliales son cultivadas en una cámara de flujo y posteriormente estimuladas con secretagogos para inducir la exocitosis WPB. Plaquetas lavadas son perfundidas entonces sobre el endotelio activado. Las plaquetas se activan y posteriormente se unen a secuencias VWF alargadas en la dirección del flujo de fluidos. Utilizando las histonas extracelulares como un estímulo procoagulantes y proinflamatorias, se observó formación de cadena creciente del VWF-plaqueta en las células endoteliales tratadas con histonas en comparación con las células endoteliales no tratadas. Este protocolo describe una evaluación cuantitativa, visual y en tiempo real de la activación de las interacciones de VWF-plaqueta en modelos de trombosis y hemostasia.

Evaluar directamente el efecto de las histonas en la liberación de FvW de las células endoteliales, que expuestos BOECs confluentes y medio libre de suero que contienen PMA (control positivo), UH, HR, HK por 2 h. Hemos mostrado que HK indujo un aumento de 2 dobleces en proteína VWF (VWF:Ag) en el medio de las células endoteliales tratadas (figura 1). Curiosamente, cuando BOECs fueron estimuladas con UH y HR, hay menos VWF:Ag se detectó en el medio que en la c...

En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

El objetivo general de este procedimiento es observar y cuantificar la formación de cadenas de factor de von Willebrand o VWF-plaquetas en respuesta a secretagogos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del factor de von Willebrand y la fisiopatología del cuerpo wavo-paliativo. También nos ayuda a responder preguntas sobre mutaciones que afectan la liberación del factor de von Willebrand y su función de unión a las plaquetas.La principal ventaja de esta técnica es que recapitula las interacciones in vivo entre el colágeno subendotelial, las células endoteliales, el FvW y las plaquetas en un sistema in vitro visual y cuantificable. Considero que la demostración visual de este método es fundamental. Los pasos necesarios de microscopía para capturar la formación de filamentos de FvW-plaquetas bajo múltiples condiciones simultáneas en tiempo real pueden ser difíciles de dominar únicamente mediante texto.Comience cargando 0,5 mililitros de tampón de recubrimiento de colágeno en una jeringa de 1 mililitro con cierre luer. Gire el extremo de la jeringa hacia el depósito de una portaobjeto con cámara de flujo y presione lentamente el émbolo hasta que todo el canal esté recubierto y cada depósito esté lleno. Complete los depósitos para asegurarse de que cada uno esté lleno.Una vez cargadas todas las carreras, incubar la cámara a 37 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, utilizar una pipeta de 200 microlitros para eliminar el tampón de recubrimiento de colágeno. A continuación, lavar cada carrera con HBSS, aspirando la solución salina con una pipeta de 200 microlitros.Después de desechar la tercera ronda de HBSS, agregue aproximadamente tres veces 10 a la 6ª células endoteliales de crecimiento sanguíneo por mililitro en 100 microlitros de medio de crecimiento, suplementado con 10 %FBS, a cada canal de la cámara de flujo. Luego, devuelva la cámara al incubador a 37 grados Celsius durante 24 horas, cambiando el medio cada ocho a 12 horas. Para armar el aparato de flujo, primero conecte un conector luer macho en ángulo a un extremo de cada una de las tres piezas de tubo de silicona estéril de 70 centímetros.Y conecte un adaptador hembra con cierre luer a cada extremo de los tubos. Conecte los adaptadores hembra con cierre luer a jeringas individuales de 20 mililitros y programe la bomba de jeringa. Coloque las jeringas en la bomba y asegure firmemente los soportes alrededor de las jeringas y los émbolos.A continuación, sujete conectores macho en forma de codo a ambos extremos de tres trozos diferentes de tubo de silicona estéril de 20 centímetros de longitud, y conecte una aguja rompida de calibre 18 a uno de los codos de cada uno de los tres tubos. Luego, en un microscopio de disco giratorio equipado con una platina completamente automatizada, seleccione el objetivo de 20x y configure los ajustes de canal adecuados. Para obtener el rango dinámico completo de los datos, configure el dispositivo acoplado a carga multiplicadora de electrones a una ganancia multiplicadora de electrones de 150 con un tiempo de exposición de 200 milisegundos.Ajuste la potencia del láser de 491 nanómetros al 20 % y utilice el software del microscopio para marcar el centro de las tres carreras. Establezca el rango Z en 1,0 micrómetro y el tamaño de paso en 0,5 micrómetros. Por último, seleccione la duración y el intervalo para capturar una imagen cada 10 segundos durante 60 puntos de tiempo por portaobjetos.Para inducir la formación de cadenas de VWF-plaquetas, sustituya el medio de cultivo de tres canales de la cámara de flujo por medio sin suero como control, y luego agregue el estimulante de interés diluido en 100 microlitros de medio sin suero a los canales adicionales. A continuación, incube la cámara durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final del periodo de estimulación, lave los tres canales con 100 a 200 microlitros de PBS y utilice pinzas vasculares para fijar la cámara de flujo sobre un soporte para portaobjetos.Conecte un conector luer macho del extremo de un trozo de tubo de 70 centímetros a cada depósito de la cámara de flujo. Inicie la bomba de jeringa para eliminar el lavado con PBS. Pipetee PBS adicional al depósito opuesto de la cámara de flujo para asegurar que los canales no se sequen.Una vez confirmado el flujo equivalente, detenga la bomba de jeringa. Conecte una jeringa de 5 mililitros con un acoplador luer lock hembra al primer conector luer macho libre. Y sumerja la aguja roma en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contenga la solución de plaquetas lavadas marcadas con fluorescencia.Extraiga lentamente la solución de plaquetas a través del tubo para asegurarse de que no haya burbujas de aire dentro del sistema. Conecte el conector luer macho al depósito abierto de la cámara de flujo y cargue las otras dos canales con la solución de plaquetas, tal como se acaba de demostrar. Verifique la configuración del sistema de flujo para asegurarse de que todas las conexiones estén firmes.Reinicie la bomba de jeringa e image el flujo de plaquetas durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, desconecte el conector luer del tubo de entrada en el depósito de la cámara de flujo. Llene el depósito con PBS para mantener un flujo suave de solución salina sobre la monocapa de células endoteliales.Para cuantificar la formación de cadenas de VWF-plaquetas, capture 10 imágenes por portaobjetos de cada carril sin traslape, desde el centro del portaobjetos. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, abra el software de procesamiento de imágenes y haga clic en imagen, ajuste y brillo-contraste. Para ajustar el brillo de la primera imagen, deslice la barra de desplazamiento hasta que las plaquetas adheridas puedan verse con suficiente claridad para la cuantificación.Luego, registre una cadena de VWF-plaquetas cuando se observen tres o más plaquetas alineadas y cuente todas las cadenas en la imagen. Tras la iniciación de las condiciones de flujo, las células no tratadas muestran muy pocas cadenas de VWF-plaquetas en comparación con las células tratadas con histamina o con PMA, las cuales exhiben un promedio de dos a tres cadenas por campo de visión.Además, las histonas, que activan las plaquetas así como las células endoteliales, inducen la producción de más cadenas de VWF-plaquetas que los controles no tratados, o estimulados con histamina o PMA. Al intentar este procedimiento, mantenga las plaquetas en estado de quiescencia hasta el experimento de flujo descartando el primer tubo de recogida de sangre, manteniendo todos los reactivos a temperatura ambiente y utilizando una técnica suave de pipeteo. Se pueden realizar modificaciones a este procedimiento para evaluar la formación de cadenas de VWF-plaquetas en presencia de leucocitos, agentes activadores de plaquetas, o la disolución de las cadenas por la enzima de escisión ADAMTS13.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la formación de cadenas de VWF-plaquetas inducida por secretagogos y el modelo in vitro de cámara de flujo.

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La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

La transfusión y hemostasia de plaquetas se modeló utilizando cámaras de reconstitución de sangre y flujo microfluídico para investigar la función de las plaquetas de los bancos de sangre. Los datos demuestran las consecuencias de la lesión por almacenamiento de plaquetas sobre la hemostasia, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

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Análisis de citometría de flujo de la expresión de factores tisulares en plaquetas humanas

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Ensayo de Perfilado de Trombo: Una plataforma basada en microfluídica para caracterizar de forma exhaustiva la trombogénesis biomecánica

Aprende a cuantificar la formación de cadenas VWF-plaquetas en respuesta a secretagogos usando un sistema de cámara de flujo in vitro. Este método permite estudiar la fisiopatología de von Willebrand y evaluar mutaciones que afectan la función plaquetaria.

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación (Video) | JoVE Journal

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

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