Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll

El objetivo general de este procedimiento de cribado es identificar nuevas nanopartículas bioactivas que puedan inhibir la señalización de receptores tipo Toll. Este método puede ayudarle a identificar físicamente nuevos nanoinhibidores dirigidos a la señalización de receptores tipo Toll en las células inmunitarias innatas. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, robusta y fácil de realizar utilizando sistemas de células reporteras.

Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de muchas enfermedades inflamatorias, ya que se ha descubierto que la señalización de los receptores tipo Toll está implicada en la patogénesis de estas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar un alto cribado y nanopartículas de oro, también se puede aplicar a otros sistemas de nanopartículas, así como a pequeñas moléculas terapéuticas y biologías. Para comenzar este procedimiento, prepare los medios de cultivo como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, agregue 100 mililitros de agua ultrapura libre de endotoxinas a un matraz de vidrio limpio de 125 mililitros. Agregue una bolsa de polvo de sustrato de fosfatasa alcalina embrionaria secretada y agite la solución suavemente hasta que se disuelva por completo. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora para asegurar la disolución completa de los sustratos.

Con una membrana de 0,2 micrómetros, filtre la solución. Almacene a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar. A continuación, agregue una bolsa de polvo de sustrato de luciferasa a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de agua ultrapura libre de endotoxinas.

Una vez que el polvo se haya disuelto por completo, guárdelo a cuatro grados centígrados hasta por una semana hasta que esté listo para usar. A continuación, prepare las soluciones madre de todos los demás reactivos como se indica en el protocolo de texto. Después de cultivar y preparar las células, transfiéralas del matraz de cultivo a un tubo de centrífuga.

Gire las celdas a 300 veces G durante cinco minutos. Luego, vuelva a suspenderlos en el medio R-10 a una concentración de 1 X 10 a las 6 células por mililitro. Agregue alícuotas de la solución de PMA a la suspensión celular de modo que la concentración final sea de 50 nanogramos por mililitro.

Vierta la suspensión celular en un depósito de reactivo estéril. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo de fondo plano de 96 pocillos. Incubar en una incubadora de cultivos celulares durante 24 horas a 37 grados centígrados.

Después de esto, use un aspirador de vacío para eliminar con cuidado el medio de cultivo. Con un microscopio invertido, revise las células para asegurarse de que los macrófagos derivados estén adheridos en el fondo del pocillo. Lave suavemente las celdas dos veces usando 100 microlitros de PBS por pocillo para cada lavado.

Luego, agregue 100 microlitros de medio R-10 fresco a cada pocillo. Deje que las células descansen durante dos días en una incubadora a 37 grados centígrados antes de realizar el ensayo reportero. En primer lugar, determine la dosis óptima de LPS como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, agregue 180 microlitros de solución Quanti-Blue precalentada a cada pocillo de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. Luego, transfiera 20 microlitros de sobrenadante de cada muestra a la placa. Incube a 37 grados centígrados durante una o dos horas para permitir que el color se desarrolle de rosa a azul oscuro.

Después de que la densidad óptica esté por encima de uno, use un lector de placas para determinar la absorción a 655 nanómetros. Para comenzar el análisis de la activación de IRF, transfiera 10 microlitros de sobrenadante fresco de cada muestra a una placa blanca fresca de fondo plano transparente de 96 pocillos. Usando la autoinyección, agregue 50 microlitros de la solución de luciferasa a cada pocillo.

A continuación, recoja inmediatamente la luminiscencia pocillo por pocillo para producir una curva de dosis-respuesta para determinar la concentración óptima de LPS para el cribado de nanopartículas. A continuación, centrifugar 20 volúmenes de la solución híbrida péptido-GMP en tubos Eppendorf de 1,5 mililitros a 18.000 veces G durante 30 minutos. Deseche con cuidado los sobrenadantes.

Transfiera los híbridos a un solo tubo fresco y lávelos dos veces con un mililitro de PBS. Después de esto, vuelva a suspender los híbridos lavados en un volumen de medio R-10. Mezcle volúmenes iguales de los híbridos concentrados y el medio LPS que contiene R-10 de manera que la concentración final de los híbridos y LPS sea de 100 nanomolares y 10 nanogramos por mililitro, respectivamente.

A continuación, retire el medio de cultivo de la placa de cultivo de macrófagos. Agregue 100 microlitros de la mezcla híbrida de LPS en cada pocillo, con tres réplicas para cada condición. Incluye un control negativo y un control LPS.

Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Luego, transfiera el medio de cada pocillo a un tubo de centrífuga separado. Centrifugar los tubos a 18.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Transfiera los sobrenadantes a una placa inferior redonda fresca de 96 pocillos. Para comenzar el ensayo reportero en estas muestras, agregue 180 microlitros de solución Quanti-Blue precalentada a cada pocillo de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. Luego, transfiera 20 microlitros de los sobrenadantes de cada muestra a esta placa.

Incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas hasta que el color azul oscuro se desarrolle a una densidad óptica superior a uno. Después de esto, use un lector de placas para registrar la absorción a 655 nanómetros. A continuación, transfiera 10 microlitros de sobrenadante fresco de cada muestra a una placa blanca de fondo plano transparente de 96 pocillos.

Usando un inyector automático, agregue 50 microlitros de la solución de luciferasa a cada pocillo e inmediatamente registre la luminiscencia pocillo por pocillo. A continuación, valide el efecto inhibidor de los posibles candidatos y evalúe la especificidad de TLR como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la activación de NF-Kappa B AP1 se detecta mediante el ensayo colorimétrico SEAP, en el que la activación de TLR-4 por LPS da como resultado la activación de NF-Kappa B AP1 y la producción de SEAP.

El SEAP liberado convierte el sustrato, lo que conduce a un cambio de color que es proporcional a la cantidad de SEAP liberado tras la estimulación. Esto se cuantifica midiendo la absorbancia a 655 nanómetros. A continuación, la activación de IRF mediada por LPS condujo a la expresión de luciferasa, catalizando el sustrato para producir luminiscencia.

Se determina una concentración óptima de LPS de 10 nanogramos por mililitro a partir de estas respuestas a la dosis para analizar una biblioteca previamente establecida de híbridos de péptidos-GMP. A partir de esto, se identifica un grupo de híbridos por su potente capacidad para inhibir la activación desencadenada por LPS tanto para NF-Kappa B AP1 como para IRF. La validación de esta actividad inhibitoria muestra que a medida que aumenta la concentración de LPS, los efectos inhibidores del híbrido se reducen, como se esperaba.

A continuación, se lleva a cabo una inmunotransferencia para confirmar la actividad de inhibición. Se observa que el híbrido principal reduce la fosforilación de p65, inhibe la degradación alfa de I-Kappa B y retrasa la fosforilación de IRF3, lo que confirma que el híbrido principal, P12, es capaz de inhibir la señalización de TLR-4 mediadora de LPS. Investigaciones adicionales revelan que P12 también reduce la señalización de TLR-2 y NF-Kappa B AP1 mediada por TLR-5, así como la activación de IRF mediada por TLR-3, lo que sugiere que P12 tiene una potente actividad inhibitoria en múltiples vías de TLR.

Después de este procedimiento, se deben realizar otras medidas como la inmunotransferencia y el ensayo de citotoxicidad para validar los resultados del cribado y evitar el descubrimiento de falsos positivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que otros investigadores en el campo de la nanomedicina exploraran nanoinhibidores en la señalización de receptores tipo Toll como terapias informativas y de próxima generación.