Name: Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a identificar nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización de receptores Toll en células THP-1 mediante ensayos reporteros rápidos y robustos. Este método facilita el descubrimiento de nanoinhibidores para aplicaciones terapéuticas en enfermedades inflamatorias.

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Los autores desean reconocer el apoyo del Programa de Profesor de Cita Especial en las Instituciones de Aprendizaje Superior de Shanghai (HY), el fondo inicial del Hospital Popular de Shanghai (HY), el apoyo de la Fundación Gaofeng de Medicina Clínica de Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), y la financiación de la Fundación de Crohn y Colitis de Canadá (CCFC) (SET y HY).

1. Preparación de medio de cultivo celular y reactivos <ol><li> Preparar el medio de cultivo celular completo R10 añadiendo los suplementos de suero bovino fetal al 10% (FBS), L-glutamina 2 mM y piruvato sódico 1 mM en el medio RPMI-1640. <ol><li> Preparar el medio de cultivo de selección R10-Z añadiendo los antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para mantener la expresión de SEAP bajo el control de la activación de NF-κB / AP-1. Para seleccionar las células que expresan ambos genes informadores de SEAP y de luciferasa, a~nadir tanto Zeocin (100 μg / mL) como blasticidina (10 μg / mL) a R10 (como R10-ZB). </li></ol></li><li> Preparar la solución de sustrato de SEAP disolviendo una bolsa del sustrato en polvo (por ejemplo , QUANTI-Blue) en 100 mL de agua ultrapura, sin endotoxina en un matraz de vidrio limpio de 125 mL. <ol><li> Agitar suavemente la solución e incubar a 37 ° C durante 1 h para asegurar la disolución completa de los sustratos. </li> &lt;Li&gt; Filtrar la solución con una membrana de 0,2 μm para asegurar su esterilidad (opcional) y almacenarla a 4 ° C hasta 2 semanas antes de su uso. </li></ol></li><li> Preparar la disolución de sustrato de luciferasa disolviendo una bolsa del sustrato en polvo ( por ejemplo , QUANTI-Luc) en 25 mL de agua ultrapura sin endotoxina en un tubo estéril de centrífuga de 50 mL. <ol><li> Después de disolver completamente el polvo, utilice la solución inmediatamente. Alternativamente, almacene la solución a 4 ° C (hasta una semana) o a -20 ° C (hasta un mes) antes de su uso. PRECAUCIÓN: Las dos soluciones de sustrato son sensibles a la luz y deben evitar la exposición a la luz siempre que sea posible. Los múltiples ciclos de congelación-descongelación de la solución pueden causar inestabilidad del sustrato y acortar su vida útil. </li></ol></li><li> Preparar la solución madre de 13-acetato de forbol 12-miristato (PMA) en dimetilsulfóxido de grado molecular (DMSO) para tener una concentración de 500 μg / mL. Realizar alícuotas de la solución madre (10 μL en un tubo de 500 μL) y almacenarlos a -20 ° C. </li><li> Preparar solución madre de LPS (E-coli K12) en agua estéril, exenta de endotoxina a una concentración de 5 mg / mL, y preparar alícuotas para almacenamiento a largo plazo a -20 ° C. Preparar una solución de LPS de trabajo mediante la dilución de la LPS stock en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 100 μ g / mL y almacenar a -20 ° C antes de su uso. PRECAUCIÓN: La preparación del reactivo para usos de cultivo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad, y todos los recipientes deben ser esterilizados antes de su uso. Se deben evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación de las soluciones PMA y LPS. </li></ol> 2. Cultivo de macrófagos derivados de células de reportero THP-1 <ol><li> Utilizar dos líneas de células reportero THP-1: células THP-1-XBlue y THP-1-Dual. El primero tiene un gen reportero de SEAP controlado por NF-κB / AP-1, y este último tiene un sistema de gen reportero doble, el mismo gen reportero de SEAP y un gen de luciferasa controlada por IRF. losIr son idénticos excepto los medios de cultivo de selección. <ol><li> Descongelar un stock de células de trabajo (~ 5 x 10 6 células) en 10 ml de medio R10, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Resuspender las células en 10 ml de medio R10 y transferirlas a un matraz de cultivo T75. Intercambiar el medio de cultivo cada 2-3 días hasta que las células alcancen una densidad de 1 x 10 6 células / mL. </li><li> Cuando el crecimiento celular alcanza su capacidad, las células de paso para reducir la densidad celular en el rango de 2-5 x 10 5 células / mL, por lo que las células pueden seguir creciendo. </li><li> Después de al menos 1 paso, empiece a cultivar las células en el medio de cultivo de selección: R10-Z para THP-1-XBlue y R10-ZB para THP-1-Dual. Después de cultivar las células con medio de cultivo de selección para al menos un paso, las células están listas para el experimento. PRECAUCIÓN: El sobrecrecimiento de células puede conducir a una muerte celular importante; La viabilidad celular debe mantener&gt; 98%. Mantenga un registro del número de pasaje como el celLs puede comportarse de manera diferente después de muchos pasajes (&gt; 20 pasajes). NOTA: Los frascos de cultivo celular pueden reutilizarse varias veces para ahorrar costes; Sin embargo, esta práctica puede aumentar el riesgo de contaminación general y contaminación cruzada entre diferentes frascos (si se manejan diferentes líneas celulares al mismo tiempo). Durante el intercambio de medios y el paso de la célula, la centrifugación se ajusta a 300 xg durante 5 min. </li></ol></li><li> Para realizar el ensayo de células reportero, las células de semilla en una placa de 96 pocillos de cultivo de células de fondo plano y diferenciarlos en macrófagos. Los procedimientos se describen a continuación. <ol><li> Transferir las células del matraz a un tubo de centrifugación, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min, y resuspender en el medio R10 a una concentración de 1 x 10 6 células / mL. Añadir alícuotas de la solución de PMA en las suspensiones celulares con una concentración final de 50 ng / ml. </li><li> Transferir 100 μL de las suspensiones celulares en cada pocillo del 96-weLl con una pipeta multicanal. Incubar la placa a 37 ° C (en un incubador de cultivo celular) durante 24 h. </li><li> Después de la incubación, retire cuidadosamente el medio de cultivo utilizando un aspirador de vacío (o con una pipeta multicanal) y lave suavemente las células con PBS (100 μl / pocillo) dos veces; Añadir 100 μl de medio R10 fresco en cada pocillo. El reposo de las células durante 2 días en una incubadora antes de realizar el ensayo de reportero. PRECAUCIÓN: El paso de reposo es muy importante para permitir que las células se calmen después de la estimulación con PMA hasta su estado de quietud normal. Esto puede reducir significativamente las señales de fondo de los genes informadores en condiciones no estimuladas. NOTA: Después de la estimulación 24 con PMA, las células se diferencian en fenotipo de tipo macrófago, con una característica de adhesión celular en el fondo del pocillo y una característica morfológica de pseudópodos. </li></ol></li></ol> 3. Detección de potenciales Nano-inhibidores TLR4 usando las células Reporter NOTA: Dado que la señalización TLR4 utiliza tanto las rutas dependientes de MyD88 como dependientes de TRIF, se selecciona como el objetivo primario para abarcar una amplia gama de vías de señalización TLR. Las células informadoras THP-1-XBlue se utilizan para examinar principalmente la activación de NF-κB / AP-1 mientras que las células THP-1-Dual son para la activación de IRF a partir de la transducción de señales dependiente de TRIF. <ol><li> Identificar la dosis óptima de LPS mediante la generación de una curva dosis-respuesta antes del cribado. <ol><li> Diluir la solución LPS de trabajo hasta una concentración final de 0,01 - 100 ng / ml en medio R10 (hacer dilución en escala log10). Diseñe el diseño de la placa y haga la dilución en una placa de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo. Asegúrese de que cada pocillo tiene un mínimo de 110 μL de solución después de la dilución. </li><li> Retire suavemente el medio de cultivo de la placa sembrada con células (de 2.2.3) usando un aspirador de vacío. </li><li> Transferir el LPS que contiene medio R10 preparado en la placa de dilución (3.1.1) iA la placa de cultivo de acuerdo con la disposición de las muestras. Incubar la placa a 37 ° C (en un incubador de cultivo celular) durante 24 h. </li><li> A las 24 h, transfiera cuidadosamente los sobrenadantes (80 μL / pocillo) en una nueva placa de fondo redondo de 96 pocillos. Realizar el ensayo de luminiscencia colorimétrica y / o luciferasa sobre estas soluciones inmediatamente o almacenarlas a 4 ° C (varias horas) o -20 ° C (días) antes del desarrollo del ensayo. NOTA: El diseño de la disposición de la placa debe ser simple y claro para el experimento y el análisis de datos. Para cada condición, deben considerarse 2-4 repeticiones. Incluya siempre un grupo de control negativo (LPS nulo). Se recomienda el uso de células THP-1-XBlue para la activación de NF-κB / AP-1, ya que las células Dual tienen un fondo relativamente alto de activación de NF-κB / AP-1 después de ser diferenciadas en macrófagos. Sin embargo, es factible utilizar las células Dual para informar tanto NF-κ B / AP-1 e IRF activación. </li></ol></li><li> Desarrollar el colorImétrico para la activación de NF-κB / AP-1 y el ensayo de luminiscencia de luciferasa para la activación de IRF. <ol><li> Para evaluar la activación de NF-κB / AP-1, transfiera 20 μl de sobrenadante de cada muestra en una nueva placa de cultivo de fondo plano de 96 pocillos; Y añadir 180 μl de solución de sustrato de SEAP precalentada en cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 - 2 h para permitir el desarrollo del color (de color rosa a azul oscuro). Recoger la absorción a 655 nm en un lector de placas. PRECAUCIÓN: El tiempo de incubación puede variarse en función del desarrollo del color (30 minutos hasta la incubación durante la noche). Se recomienda esperar hasta que la densidad óptica (OD) del color más oscuro llegue a 1, evitando la saturación del desarrollo del color (OD&gt; 3). </li><li> Para el análisis de la activación IRF, transfiera 10 μl de sobrenadante de cada muestra en una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos. Añadir la solución de luciferasa (50 μl) e inmediatamente recoger la luminiscencia wEll por bien. NOTA: Se recomienda utilizar un lector de placas de luminiscencia con una función de autoinyección para asegurar la consistencia en la lectura de luminiscencia de pozo a pozo y de placa a placa. Si las soluciones de sustrato se inyectan manualmente, asegúrese de que el tiempo de incubación y la configuración de lectura para cada pocillo sean constantes. </li></ol></li><li> Realizar el ensayo de detección en varios péptido-GNP híbridos con 10 ng / mL de estimulación de LPS (basado en 3.1). Siga el mismo procedimiento en 3.2 para el desarrollo del ensayo de reportero. <ol><li> Concentrar los híbridos péptido-GNP a 200 nM en medio R10 usando el método de centrifugación. Centrifugar 20 volúmenes de la solución híbrida (10 nM) a 18.000 xg durante 30 min, y desechar cuidadosamente los sobrenadantes. Recoger los híbridos (en la parte inferior del tubo) en un tubo, lavarlos con PBS dos veces, y volver a suspender los híbridos en un volumen del medio R10. </li><li> Mezcle volúmenes iguales de los híbridos concentrados y elLPS (20 ng / ml) que contiene medio R10 para tener una concentración final de los híbridos y LPS de 100 nM y 10 ng / ml, respectivamente. </li><li> Eliminar el medio de cultivo de la placa cultivada (2.2.3) y añadir 100 μL de la solución mezclada en cada pocillo (3 repeticiones para cada condición); Incluyen un control negativo (sólo medio) y un control de LPS (10 ng / mL LPS sin híbridos). </li><li> Después de 24 h de incubación a 37 ° C, transferir el medio de cada pocillo en un tubo y centrifugar los tubos a 18.000 xg, 4 ° C durante 30 min. Recoger los sobrenadantes (50-80 mu l / tubo) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, y realizar el ensayo informador como se describe en 3.2. PRECAUCIÓN: Cuando descarte los sobrenadantes después de la centrifugación, no agite los híbridos en la parte inferior del tubo. NOTA: La centrifugación en la etapa 3.3.4 es muy importante para eliminar los híbridos de nanopartículas no internalizados del medio de cultivo, y puede evitar la interferencia de los híbridos con el coLecturas lorimétricas / luminescentes. Esto se debe a que las nanopartículas de oro pueden absorber largas longitudes de onda de luz dependiendo de su tamaño y aglomeración. </li></ol></li></ol> 4. Validar el Efecto Inhibidor de los Candidatos Potenciales NOTA: Para confirmar el efecto inhibitorio de los posibles candidatos de la selección, se emplean dos enfoques. Una de ellas es examinar las respuestas de dosis de los estimulantes (LPS) a una concentración híbrida fija (o al revés); El otro es mirar directamente la inhibición de las señales NF-κB / AP-1 e IRF3 a través de inmunotransferencia. <ol><li> En el enfoque uno, realice el ensayo de indicador con 100 nM de híbridos de plomo y dos concentraciones de LPS a 1 ng / mL y 10 ng / mL siguiendo los mismos procedimientos descritos en 3.3. Incluir un híbrido inactivo (basado en los resultados del cribado) como un control híbrido para la comparación. </li><li> Para el método de inmunotransferencia, siga el estándar eProcedimientos experimentales. <ol><li> Las células THP-1 de cultivo en medio R10 sembran las células en una placa de cultivo de 12 pocillos (2 x 10 ^ { 6} células / pocillo) y las diferencian en macrófagos tratando las células con 50 ng / ml de PMA durante 24 h seguido de reposo por 2 días. </li><li> Después de la diferenciación celular, estimular las células con 10 ng / mL LPS con / sin los híbridos (100 nM) con el tiempo (hasta 4 h). En varios puntos de tiempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 y 240 min), preparar los lisados ​​celulares para immunoblotting. Incluya un híbrido inactivo como control. </li><li> Probe las señales de IκBα, p65 fosforilada y IRF3 fosforilada para examinar el efecto inhibitorio de los híbridos de plomo en la activación de NF-κB e IRF3. Probe las señales β-actina y IRF3 total como controles internos. NOTA: La transducción de la señal a menudo ocurre mucho más rápido (en pocas horas) que la expresión de las enzimas reportero SEAP y luciferasa (24 h). Se recomienda encarecidamente también perforarMa ensayo de viabilidad de los híbridos probados a las 24 h como otro método de validación. </li></ol></li></ol> 5. Evaluación de la especificidad de TLR NOTA: Para investigar la especificidad de TLR del híbrido péptido-GNP de plomo, se ensayan otras vías de señalización de TLR, incluyendo TLR2, TLR3 y TLR5. TLR7, 8 y 9 se excluyen porque los macrófagos derivados de THP-1 no responden bien a la estimulación de estos TLRs debido a la falta de expresión TLR7, 8 y 9 en los macrófagos [ 34] . <ol><li> Pruebe varias concentraciones (1 ng / mL a 25 μg / mL) de los ligandos específicos de TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I: C) y TLR5 (flagelina) en ambas células reporteras derivadas de los macrófagos para obtener la concentración óptima después de la misma Procedimiento previsto en 3.1 y 3.2. </li><li> Tratar las células con las mezclas del híbrido de plomo (100 nM) y cada ligando de TLR a la concentración obtenida a partir de 5.1 para evaluar la especificidad inhibitoria del plomo hYbrid según el procedimiento experimental descrito en 3.3. Incluya el híbrido inactivo como un control para la comparación. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde TLRs están involucrados en la patogénesis de muchas enfermedades inflamatorias, que han surgido como objetivos terapéuticos para la modulación de las respuestas inmunes y las condiciones inflamatorias. Sin embargo, el desarrollo clínico de la terapéutica para inhibir TLR señalización vías ha tenido un éxito limitado hasta la fecha. El medicamento antipalúdico hidroxicloroquina que inhibe TLR7 y TLR9 está en uso clínico 35 , 36 . Del mismo modo, sólo un núm...

Los receptores Toll-like (TLRs) son uno de los elementos clave en el sistema inmune innato que contribuye a la primera línea de defensa contra las infecciones. TLRs son responsables de la detección de patógenos invasores mediante el reconocimiento de un repertorio de patógenos asociados patrones moleculares (o PAMPs) y el montaje de las reacciones de defensa a través de una cascada de la señal de transducción [ 1 , 2] . Hay 10 humanos TLRs identificados; Excepto TLR10 para el cual el ligando (s) permanece incierto, cada TLR puede reconocer un grupo distinto, conservado de PAMPs. Por ejemplo, TLR2 y TLR4, localizados principalmente en la superficie celular, pueden detectar lipoproteínas y glicolípidos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, respectivamente; Mientras que TLR3, TLR7 / 8 y TLR9, presentes principalmente en los compartimentos endosómicos, pueden detectar productos de ARN y ADN de virus y bacterias 3 . Cuando estimulados por PAMPs, TLRs desencadenar respuestas inmunes esenciales mediante la liberación de pro-infMediadores lammatorios, reclutamiento y activación de células inmunitarias efectoras y coordinación de sucesivos eventos inmunes adaptativos 4 . La TLR señalización transducción puede ser simplemente categorizado en dos vías principales 5 , 6 . Una es dependiente del factor de diferenciación mieloide de proteína adaptador 88 (MyD88) - la vía dependiente de MyD88. Todos TLRs excepto TLR3 utilizar esta vía para activar el factor nuclear kappa-cadena de luz-potenciador de células B activadas (NF-κ B) y mitógeno asociado a proteínas quinasas (MAPK), dando lugar a la expresión de mediadores pro-inflamatorios como TNF- Α, IL-6 e IL-8. La segunda vía utiliza interferón-β (TRIF) que induce el adaptador TIR-dominio y que depende de TRIF o MyD88 independiente para activar los factores reguladores del interferón (IFN) y NF-κB, dando como resultado la producción de IFN de tipo I. Señalización TLR intactaEs fundamental para nuestra protección diaria de infecciones microbianas y virales; Defectos en las vías de señalización TLR puede conducir a la inmunodeficiencia y son a menudo perjudiciales para la salud humana. 7 Sin embargo, la señalización de TLR es una &quot;espada de doble filo&quot; y la activación de TLR excesiva y no controlada es perjudicial. Las respuestas de TLR hiperactivas contribuyen a la patogénesis en muchas enfermedades inflamatorias humanas agudas y crónicas 8 , 9 . Por ejemplo, la sepsis que se caracteriza por inflamación sistémica y lesión multiorgánica, se debe principalmente a respuestas inmunes agudas y abrumadoras hacia las infecciones, con TLR2 y TLR4 desempeñando un papel crucial en la fisiopatología de la sepsis 10 , 11 , 12 . Además, TLR5 se ha encontrado para contribuir a la inflamación pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística 13, 14 . Además, señalización endosomal TLR desregulada (por ejemplo, TLR7 y TLR9) está fuertemente asociada con el desarrollo y la progresión de varias enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR) 15 , 16 . Estas líneas convergentes de evidencia de identificar TLR señalización como un potencial objetivo terapéutico para muchas enfermedades inflamatorias [ 17] . Aunque se anticipa que la regulación farmacológica de las respuestas de TLR es beneficiosa en muchas afecciones inflamatorias, desafortunadamente, actualmente hay muy pocos compuestos clínicamente disponibles para inhibir la señalización de TLR 9 , 17 , 18 . Esto se debe en parte a la complejidad y redundancia de las vías TLR implicadas en la homeostasis inmune y la patología de la enfermedad. Por lo tanto, en busca de novela, potenT de agentes terapéuticos para dirigirse múltiples vías de señalización de TLR podría puentear una brecha fundamental, y superar el reto de avanzar los inhibidores de TLR en la clínica. A la luz de los rápidos avances en nanociencia y nanotecnología, los nanodispositivos están emergiendo como los moduladores TLR de nueva generación debido a sus propiedades únicas 19 , 20 , 23 . El tamaño de nanoescala permite que estos nano-terapéuticos tengan una mejor distribución biológica y una circulación sostenida 24 , 25 , 26 . Pueden funcionalizarse adicionalmente para cumplir los perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos deseados 27 , 28 , 29 . Más emocionante, la bioactividad de estos nuevos nanodispositivos surge de sus propiedades intrínsecas, que pueden ser adaptadas paraAplicaciones médicas específicas, en lugar de simplemente actuar como vehículo de administración de un agente terapéutico. Por ejemplo, una nanopartícula similar a lipoproteína de alta densidad (HDL) fue diseñada para inhibir la señalización de TLR4 mediante la eliminación del ligando TLR4 LPS 23 . Además, hemos desarrollado un sistema híbrido de nanopartículas péptido-oro, donde los péptidos decorados pueden alterar las propiedades superficiales de las nanopartículas de oro, y permitirles tener varias bioactividades 30 , 31 , 32 , 33 . Esto los convierte en una clase especial de droga (o &quot;nano-droga&quot;) como la nano-terapéutica de próxima generación. En este protocolo, presentamos un enfoque para identificar una nueva clase de péptido-nanopartícula de oro (péptido-GNP) híbridos que pueden potentemente inhibir múltiples TLR vías de señalización en células inmunes fagocíticas 32 , </suP&gt; 33 . El enfoque se basa en líneas de células informadoras THP-1 comercialmente disponibles. Las células reportero- res consisten en dos construcciones repórter inducibles, estables: una lleva un gen secretado de fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP) bajo el control de un promotor inducible por los factores de transcripción NF-κB y la proteína activadora 1 (AP-1); El otro contiene un gen reportero de luciferasa secretado bajo el control de promotores inducibles por factores reguladores de interferón (IRF). Tras la estimulación con TLR, la transducción de señales conduce a la activación de NF-κB / AP-1 y / o IRFs, que convierte los genes informadores en SEAP y / o luciferasa secretas; Tales acontecimientos pueden detectarse fácilmente usando sus correspondientes reactivos sustrato con un espectrofotómetro o luminómetro. Usando este enfoque para examinar nuestra biblioteca previamente establecida de híbridos péptido-GNP, hemos identificado candidatos de plomo que pueden potentemente inhibir las vías de señalización TLR4. La actividad inhibidora del péptido de plomo-GNP híbridos fue validado mediante otro enfoque bioquímico de inmunoblotting, y evaluado en otros TLR vías. Este enfoque permite un rastreo rápido y eficaz de nuevos agentes dirigidos a las vías de señalización de TLR.

<table><tbody><tr><td>THP-1-XBlue célula reportera</td><td>InvivoGen</td><td>thpx-sp</td><td>mantiene el paso del cultivo celular por debajo de 20</td></tr><tr><td>THP-1-Célula de rebote dual</td><td>InvivoGen</td><td>thpd-nfis</td><td>mantiene el paso del cultivo celular por debajo de 20</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sin L-glutamina)</td><td>GE Health Care</td><td>SH30096.02</td><td>Calentamiento hasta 37 &deg; C antes de usar; Agregue suplementos para hacer un medio completo R10</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (calificado)</td><td>Thermo Fisher Scientific 12484028</td><td></td><td>Calor inactivado; 10% en RPMI-1640</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>2 mM en el medio completo R10</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>1 mM en el medio completo R10</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, sin calcio, magnesio</td><td>GE Health Care</td><td>SH30028.02</td><td>Uso para el lavado de células y la preparación de reactivos</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td>Sustrato SEAP</td></tr><tr><td>QUANTI-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qlc2</td><td>Sustrato de luciferasa</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1 Selección de</td><td>antibióticos para células reporteras</td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>InvivoGen</td><td>anti-bl-1</td><td>Selección de antibióticos para células reporteras</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO) para biología molecular</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Uso para la preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para biología molecular</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Uso para la diferenciación celular</td></tr><tr><td>Lipopolisacárido (LPS) de E. coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td>ligando TLR4</td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pms</td><td>Lando TLR2/1</td></tr><tr><td>Poly (I:C) HMW</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pic</td><td>Lligando TLR3</td></tr><tr><td>Flagelina de S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapuro</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-epstfla</td><td>Ligando TLR5</td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384 lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Leer ensayo colorimétrico</td></tr><tr><td>Lector de microplacas multimodo Infinite M200 Pro con inyectores</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Leer luminiscience</td></tr><tr><td>Centrífuga Microfuge 22R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Microcentrífuga con control de temperatura (hasta 18.000 g)</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X-15R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Centrífuga de uso general con control de temperatura (para uso en cultivos celulares)</td></tr><tr><td>Placa de ensayo Costar, blanca de 96 pocillos con fondo plano transparente, tratado con tejido</td><td>Corning Costar</td><td>3903</td><td>Se utiliza para el ensayo de luminiscencia</td></tr></tbody></table>

proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo toll

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

La regulación farmacológica de las respuestas de los receptores Toll-like (TLR) es muy prometedora en el tratamiento de muchas enfermedades inflamatorias. Sin embargo, ha habido compuestos limitados disponibles hasta ahora para atenuar la señalización de TLR y no ha habido ningún inhibidor de TLR clínicamente aprobado (excepto el fármaco antipalúdico hidroxicloroquina) en uso clínico. A la luz de los rápidos avances en nanotecnología, la manipulación de la respuesta inmune usando nano-dispositivos puede proporcionar una nueva estrategia para tratar estas enfermedades. En el presente documento, presentamos un método de selección de alto rendimiento para identificar rápidamente nuevas nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización de TLR en células inmunitarias fagocíticas. Esta plataforma de cribado está construida sobre células reporteras basadas en células THP-1 con ensayos colorimétricos y de luciferasa. Las células reporteras se manipulan por ingeniería genética a partir de la línea celular monocítica THP-1 humana mediante la integración estable de dos construcciones informadoras inducibles. Uno expresa un gen secretado de fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP)Bajo el control de un promotor inducible por los factores de transcripción NF-κB y AP-1, y el otro expresa un gen informador de luciferasa secretado bajo el control de promotores inducibles por factores reguladores de interferón (IRFs). Los factores de transcripción y posteriormente producen SEAP y / o luciferasa, que se pueden detectar usando sus correspondientes reactivos sustrato. Utilizando una biblioteca de híbridos de nanopartículas de péptido-oro (GNP) establecida en nuestros estudios anteriores como ejemplo, identificamos un híbrido péptido-GNP que podría inhibir eficazmente los dos brazos de la cascada de señalización TLR4 desencadenada por su ligando prototípico, lipopolisacárido (LPS). Los hallazgos fueron validados por técnicas bioquímicas estándar incluyendo inmunotransferencia. Otros análisis establecieron que este híbrido de plomo tenía un amplio espectro inhibitorio, actuando sobre múltiples vías TLR, incluyendo TLR2, 3, 4 y 5. Este enfoque experimental permite una evaluación rápida deRa (u otros compuestos terapéuticos) pueden modular la señalización TLR específica en células inmunes fagocíticas.

El enfoque experimental general se ilustra en la Figura 1 . Las dos líneas de células informadoras THP-1, THP-1-XBlue y THP-1-Dual, se usan para examinar rápidamente las respuestas de TLR probando la activación de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. La activación de NF-κB / AP-1 puede detectarse mediante el ensayo colorimétrico de SEAP, mientras que la activación de IRF es monitorizada por la luminiscencia de luciferasa. Las células monocíticas THP-1 puede...

La señalización de receptores de tipo Toll-like (TLR) juega un papel importante en la fisiopatología de muchas enfermedades inflamatorias humanas y se anticipa que la regulación de las respuestas de TLR por nanopartículas bioactivas es beneficiosa en muchas afecciones inflamatorias. Las células informadoras basadas en células THP-1 proporcionan una plataforma de cribado versátil y robusta para identificar nuevos inhibidores de la señalización de TLR.

Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

El objetivo general de este procedimiento de cribado es identificar nuevas nanopartículas bioactivas que puedan inhibir la señalización del receptor tipo toll. Este método puede ayudarle a identificar físicamente nuevos nanoinhibidores que actúen sobre la señalización del receptor tipo toll en células inmunitarias innatas. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, robusta y fácil de realizar utilizando sistemas de células reporteras.Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de muchas enfermedades inflamatorias porque se ha encontrado que la señalización de los receptores tipo toll participa en la patogénesis de estas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar una alta capacidad de cribado en nanopartículas de oro, también puede aplicarse a otros sistemas de nanopartículas, así como a moléculas pequeñas terapéuticas y a productos biológicos. Para comenzar este procedimiento, prepare los medios de cultivo según se describe en el protocolo escrito.A continuación, agregue 100 mililitros de agua ultrapura libre de endotoxinas a un matraz de vidrio limpio de 125 mililitros. Añada un sobre de polvo de sustrato de fosfatasa alcalina secretada de e

screening-bioactive-nanoparticles-phagocytic-immune-cells-for

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El ensayo sialidasa es un enfoque simple técnica que dilucidar nuevo mecanismo molecular (s) de los sensores de TLR de las infecciones microbianas y la participación en las enfermedades inflamatorias a nivel del receptor en la superficie celular de los macrófagos en vivo.

Detección de actividad sialidasa Neu1 en la regulación de Toll-like receptor de activación

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Tome cultivos de células similares a microglías derivadas de monocitos humanos.Introducir nanopartículas que contengan un fármaco antiinflamatorio en el cultivo experimental y el fármaco libre en el control.Las nanopartículas cuentan con una capa hidrofílica y un núcleo hidrofóbico que encapsula el fármaco lipofílico.Las células endocitan las nanopartículas, que liberan el fármaco intracelularmente, mejorando su administración.El fármaco libre ingresa por difusión pasiva, un proceso limitado...

Administración mejorada mediada por nanopartículas de un fármaco antiinflamatorio en células similares a la microglía

Este video muestra un ensayo basado en células reporteras para la detección de posibles nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización del receptor tipo Toll (TLR). El ensayo consiste en introducir lipopolisacáridos (LPS) mezclados con híbridos de nanopartículas de péptido y oro a macrófagos reporteros que expresan las proteínas reporteras: fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) y luciferasa. La reducción de la señal TLR inducida por LPS mediada por los híbridos se determina...

Un ensayo para examinar nanopartículas bioactivas para la inhibición de la señalización de receptores tipo Toll

En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Este papel utiliza un ensayo basado en la citometría de flujo para las bibliotecas de la pantalla de inhibidores químicos para la identificación de los inhibidores y los objetivos que influyen en la del receptor de células T de señalización. Los métodos descritos aquí pueden ampliarse también para proyecciones de alto rendimiento.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

Este protocolo proporciona a los investigadores un método rápido e indirecto para medir la actividad del factor de transcripción NF--B/AP-1 dependiente de TLR en una línea celular de macrófagomur en respuesta a una variedad de superficies poliméricas y capas de proteínas adsorbidas que modelan el microambiente de implantes de biomaterial.

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

Este protocolo describe un método de imagenología con células vivas y lapso de tiempo para visualizar la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína verde fluorescente por macrófagos derivados de células mononucleares de sangre periférica, mediante el uso de un microscopio automatizado.

Imágenes de lapso de tiempo de la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína de fluorescencia verde por macrófagos mediada por anticuerpos

Aprende a identificar nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización de receptores Toll en células THP-1 mediante ensayos reporteros rápidos y robustos. Este método facilita el descubrimiento de nanoinhibidores para aplicaciones terapéuticas en enfermedades inflamatorias.

Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll (Video) | JoVE Journal

Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll

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