Name: Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Aprende a evaluar funciones efectoras mediadas por Fc en anticuerpos contra la hemaglutinina del virus influenza. Este protocolo de 24 horas utiliza células HEK293 y ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos para investigar la eficacia vacunal.

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Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas, institutos nacionales de salud, Departamento de salud y servicios humanos, bajo CEIRS contrato P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Los experimentos realizados en este manuscrito se realizaron código institucional siguientes Icahn escuela de medicina de ética y reglamentos.
1. expresión de la hemaglutinina del Virus de Influenza mediante transfección o infección
Transfección:
<ol><li>Células de riñón embrionario humano (HEK 293T) de placa a una densidad de 2 x 104 células/pozo en un cultivo de tejido blanco trataron placa de 96 pocillos y dejaron reposar 4 horas en una incubadora de 37 °C (con 5% CO2).</li>
	<li>Transfectar las células con 100 ng de ADN que codifica para la hemaglutinina viral y 0.2 μL de reactivo de transfección por pozo en un volumen total de 50 μL. Nota: Ambos plásmidos y transfectant reactivo se diluyen en 1 x medio de suero reducido Opti-mínimo esencial los medios de comunicación (MEM).</li>
	<li>Después de incubar las placas en una incubadora de 37 °C con 5% CO2 para 18 h, quitar medios de transfección.</li>
</ol>2. infección
<ol><li>Células de riñón canino placa A549 o Madin Darby en una densidad de 2 x 104 células/pozo en una cultura blanca de tejido trataron placa de 96 pocillos y crecen durante al menos 18 h a 37 °C la incubadora con 5% CO2.</li>
	<li>Virus diluido en 1 x MEM e infectar las células en una multiplicidad de infección de 3, 1 o 0.33 por 1 h en una incubadora de 37 °C con 5% CO2. Volumen total debe ser igual a 100 μL. Nota: 10 x MEM se diluye con agua para hacer un 1 x bolsa de trabajo de MEM para la dilución de virus mencionado.</li>
	<li>Después de la infección, eliminar el inóculo y añadir 100 μL de 1 x MEM en la placa en ausencia de tripsina.</li>
	<li>Crecen las células infectadas durante 18 a 24 h en una incubadora de 37 °C con 5% CO2.</li>
</ol>3. evaluación de la activación FcRg/NFAT-mediada de la actividad de luciferasa por anticuerpos monoclonales o sueros
<ol><li>En primer lugar, sustituir medios de crecimiento de las células transfected o infectadas con 25 μl del medio de ensayo (1 x RPMI 1640 suplementado con 4% (vol/vol) baja IgG fetal bovina sueros).</li>
	<li>En una placa de 96 pocillos separada, realizar cuatro diluciones de los anticuerpos de interés a partir de 30 μg/mL usando los medios de ensayo. Realizar diluciones en triplicado y un diseño de placa de ejemplo se ilustra en la figura 1A. Asegúrese de incluir un control que excluye anticuerpo (no control del anticuerpo) así como un control de fondo (tampón de ensayo solamente). Nota: para ambos el 'ningún anticuerpo' y los controles del fondo, añadir 25 μl de tampón de ensayo en lugar de anticuerpos.</li>
	<li>Transferencia 25 μL de anticuerpos diluidos en serie del paso 3.2 en los pocillos correspondientes en la placa de células infectadas o células transfected.</li>
	<li>Incube la placa en una incubadora de 37 °C (con 5% CO2) durante 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 25 μL de la célula de Jurkat efectoras modificado apropiado expresar FcgRIV murino o FcgRIIIa humano (75.000 de células/pocillo). Volumen total de cada bien debe ser 75 μl y la concentración final a partir de los anticuerpos es de 10 μg/mL (figura 1B). Nota: Para el control del fondo, añadir 25 μl de tampón de ensayo en vez de células efectoras. Para examinar la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo, se puede utilizar un celular Jurkat modificado expresando FcgRIIa humana.</li>
	<li>Incube la placa en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 durante 6 h.</li>
	<li>Deshielo y tampón de sustrato caliente luciferasa en un agua de 37 °C por aproximadamente 1 h antes de su uso. Nota: Para hacer el tampón de sustrato de luciferasa, reconstituir el sustrato de ensayo de luciferasa liofilizada en tampon de ensayo proporcionado. El tampón de sustrato reconstituido puede almacenarse a-30 °C a-10 °C hasta por seis semanas.</li>
	<li>Agregar 75 μL/pocillo de buffer de sustrato de luciferasa a excepción del control de fondo.</li>
	<li>Leer en un luminómetro.</li>
	<li>Calcular la inducción de la doblez con la siguiente ecuación: doble inducción = (valor de fondo valor inducido) / (ningún valor de fondo valor de mAb).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
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<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
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<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
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<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
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<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
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<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li>
</ol>

Autores no declaran conflictos de interés.

El método aquí descrito permite al usuario medir la capacidad de un anticuerpo monoclonal de específicos HA de comprometerse FcγRIV murino. El antígeno Diana, hemaglutinina del virus de influenza, se expresa en la superficie de las células después de la infección por virus o transfección del plásmido ADN. El ensayo es más susceptible al uso de diferentes proteínas virales de superficie expresada en combinación con otros FcγRs (seres humanos o murino). Además, hemos utilizado muestras de sueros a evaluar la capacidad de l...

Inmunidad proporcionada por la vacuna contra la gripe estacional se ha valorado tradicionalmente por la hemaglutinación inhibición (HI) ensayo1, que mide la presencia de anticuerpos que atacan el sitio de unión del receptor de la hemaglutinina. Estos anticuerpos HI-active pueden conferir inmunidad esterilizante, pero son generalmente limitados en su alcance de protección, inmunidad a sólo seleccionar pocas las cepas de virus de la gripe. El aislamiento y la caracterización de ampliamente reactivos anticuerpos monoclonales que reconocen la hemaglutinina (HA) sugieren que el desarrollo de una vacuna antigripal universal está al alcance2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. uno de los objetivos principales de una vacuna universal de gripe es inducir una respuesta fuerte de anticuerpos hacia las regiones conservadas del virus de la influenza9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. ampliamente anticuerpos reactivos que reconocen estos epítopes conservados, compuesto de neutralizante y no neutralizar anticuerpos17,18, han demostrado que requieren interacciones FcγR Fc para óptima protección en vivo y a destacar la contribución de la inmunidad mediada por la Fc a la respuesta inmune a influenza virus19,20.
Correlatos de protección son cruciales para evaluar la inmunidad a la infección. Estas métricas permiten a los científicos y los clínicos estimar la eficacia de las vacunas, la importancia de los datos y el curso del tratamiento. El único correlato establecido de protección contra la infección por virus de la influenza es el ensayo de inhibición de hemaglutinación. Un título de 1:40 se asocia con una reducción del 50% en el riesgo de enfermedad1,21 – y refleja la presencia de anticuerpos que inhiben la aglutinación apuntando el receptor binding sitio ubicado en la cabeza globular de la HA. Sin embargo, también cabe señalar que las respuestas de células T pueden ser un mejor correlato de protección contra la infección por virus influenza en los ancianos. Curiosamente, un informe reciente sugiere que la actividad de inhibición de la neuraminidasa puede ser un mejor predictor de la inmunidad a la influenza22. Afortunadamente, típico en vitro ensayos tales como ensayos de inhibición de neutralización o neuraminidasa pueden medir HA tallo o neuraminidasa-anticuerpos específicos. La mayoría de estos ensayos convencionales en vitro , sin embargo, sólo tener en cuenta la función de la región de unión del antígeno del anticuerpo y no medir el papel de la región Fc. Además, el aporte de anticuerpos no neutralizantes que protegen a través de Fc receptor compromiso en vivo no son detectado17,18. Para medir la protección conferida por los anticuerpos que inducen inmunidad de Fc como citotoxicidad celular dependiente mediada por anticuerpos (ADCC), es necesario un análisis robusto en vitro .
El método se describe a continuación evalúa la capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos para inducir funciones Fc-mediada a través de una línea de células de Jurkat transgénica expresando una activación murino tipo 1 FcR, FcγRIV. Participación de anticuerpo de la FcγR transmite señalización intracelular que desencadena nuclear el factor de actividad de luciferasa mediada por células T activadas. El ensayo tiene varias ventajas sobre las técnicas tradicionales que requieren aislamiento y cultivo de células efectoras primarias y el uso de citometría de flujo para detectar la activación de efectores Fc-mediada funciones19,23,24 ,25,26. En primer lugar, el protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para incorporar objetivos virales diferentes, FcγRs y los anticuerpos de diferentes especies (humanas y murinas). En segundo lugar, el uso de un celular Jurkat modificado línea expresando un FcγR con un gen reportero de luciferasa bajo un factor nuclear de células T activadas (NFAT) permite un análisis de gran formato que pueden analizarse fácilmente usando un lector de placas de medición de luminiscencia. Aquí, se sustituye la tradicional activación de células efectoras primarias con la inducción de NFAT luciferasa sobre participación de anticuerpo de un FcγR en la superficie de las células de Jurkat. Este ensayo de placa de 96 pocillos formato permite la medición de hasta cuatro diversas muestras en triplicado con siete diluciones – un número de muestras que podrían ser incómodos usando técnicas tradicionales. Hay puntos adicionales a considerar en este ensayo que pueda afectar el diseño de experimentos y la interpretación de datos. El objetivo del viral debe expresarse en la superficie celular en orden para el reconocimiento de anticuerpos. Para mitigar esto, el antígeno de la blanco (e.g. una proteína viral interna) puede ser cubierto directamente en la superficie de una placa. Sin embargo, esto no ha todavía sido rigurosamente probado. Además, la línea de células de Jurkat modificada expresa sólo un tipo de activación FcγR y no expresa ningún FcγRs inhibitorio, mientras que líneas de células primarias expresan todos los receptores en un contexto fisiológico.
Anteriormente hemos utilizado este test para demostrar que la especificidad del epítopo en un contexto policlonal desempeña un papel crucial en la regulación de funciones efectoras mediadas por el Fc y que activación óptima de la respuesta mediada por células dependiente de anticuerpos requiere de dos puntos de Póngase en contacto con27,28. Aquí, describimos un método que evalúa la capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos del tallo de participar y activar el murino activación FcγRIV. Aunque hay excepciones29,30, un gran número de anticuerpos ampliamente reactivos destino la región del tallo antigénicamente conservada de la hemaglutinina y así jugar un papel importante en el desarrollo de una influenza universal vacuna.

<table><tbody><tr><td>Células A549&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Células epiteliales basales alveolares humanas adenocarcinomicas</td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Células de riñón embrionario humano</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11668019</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Medio de suero reducido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido blanco</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>Placas de ensayo</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr>El kit FcgRIV <td>promega</td><td>M1201</td> que<td>expresa células Jurkat que expresan células murino</td> proporciona <td>células, sistema de ensayo Bio-Glo Luciferasa, 1X RPMI y suero</td></tr><tr><td>de baja IgG El kit Jurkat que expresa FcgRIIIa</td><td>humano Promega</td><td>G7010</td><td>proporciona incluye células, sistema de ensayo Bio-Glo Luciferasa, 1X RPMI y suero</td></tr> <tr><td>de baja IgGEl kit Promega G9901 que expresa células Jurkat humanas que expresan FcgRIIa</td><td></td><td></td><td>proporciona células, sistema de ensayo Bio-Glo Luciferasa, 1X RPMI y luminómetro sérico de baja IgG</td></tr><tr><td>Lector</td> multimodo <td>BioTek</td><td>Synergy H1 Lector de placas de</td><td>luminiscencia</td></tr> Sistema <tr><td>de ensayo de luciferasa Bio-Glo</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>Contiene tampón de ensayo de luciferasa y sustrato de ensayo de luciferasa</td></tr><tr><td>Células de riñón canino Madin Darby</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Células renales caninas</td></tr></tbody></table>

un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Los anticuerpos desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas frente a patógenos virales a través de sus dominios de unión a antígeno y las regiones Fc de acoplamiento. Aquí, describimos cómo medir la activación del Fc funciones efectoras de los anticuerpos monoclonales contra la hemaglutinina del virus de influenza con el uso de una línea de células de Jurkat transgénicos expresando una activación tipo 1 Fc-FcγR. utilizando este método, la contribución de interacciones Fc FcγR conferido por las inmunoglobulinas puede ser determinado mediante un ensayo en vitro .

Hemos demostrado que un tallo específico mAb, 6F12, pero no específicos de la cabeza un jefe específico mAb, PY102, fue capaz de activar células de asesino naturales primarias regular CD107a y el interferón γ19. Para modelar la capacidad de un anticuerpo específico de tallo para activar las células NK humanas primarias, mostramos que un tallo específico mAb, 6F12, robusta puede activar el celular Jurkat modificado expresando el FcγRIV murino por ~ 14-fold. Por otro lado, el mAb de cabeza específic...

Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

El objetivo general de este protocolo es evaluar la capacidad de un anticuerpo o una muestra de suero para activar la función efectora mediada por el fragmento Fc. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la vacunología mediante la medición de la activación de la inmunidad mediada por el fragmento Fc dependiente de anticuerpos. La principal ventaja de esta técnica es que el experimento puede realizarse en menos de 24 horas, desde la preparación del material hasta el análisis de datos.Para demostrar este procedimiento, contaremos con Mark Bailey, estudiante de posgrado del laboratorio de Peter Palese. Para inducir la expresión de hemaglutinina viral mediante transfección, siembre primero células de riñón embrionario humano 293 a una concentración de dos veces 10 a la cuarta células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos blanca de 96 pocillos. Después de cuatro horas a 37 grados Celsius y 5 %CO2, transfecte las células con 100 nanogramos de ADN que codifica la hemaglutinina viral y 0,2 microlitros de reactivo de transfección por pocillo, en un volumen total de 50 microlitros de medio óptimo con suero reducido 1X.Añada complejos de liposomas de ADN a cada pocillo para transfectar y devuelva la placa al incubador durante otras 18 horas. Para inducir la expresión de hemaglutinina del virus de la influenza mediante infección, siembre células A549 a una concentración de dos veces 10 a la cuarta células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos tratada, blanca, y sométalas a una incubación de al menos 18 horas a 37 grados Celsius y 5 %CO2. Al final de la incubación, diluya el virus de la influenza a una multiplicidad de infección de tres en 100 microlitros de medio MEM 1X por pocillo e infecte las células A549 durante una hora en el incubador de cultivo celular.Al final de la incubación, reemplace el inóculo con 100 microlitros de medio MEM 1X fresco sin virus y regrese las células al incubador durante otras 18 a 24 horas. Para evaluar la capacidad de anticuerpos específicos de interés para dirigirse a las células que expresan hemaglutinina, reemplace el sobrenadante de los cultivos celulares afectados por el virus con 25 microlitros de medio para el ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). A continuación, en una placa separada de 96 pocillos, realice cuatro diluciones completas de los anticuerpos de interés en triplicado en medio ADCC fresco, comenzando en 10 microgramos por mililitro según el esquema, teniendo cuidado de incluir los controles de fondo y sin anticuerpo.Cuando todo el anticuerpo haya sido diluido, transfiera 25 microlitros del anticuerpo diluido a los pozos correspondientes apropiados en la placa de células experimentales y coloque la placa en el incubador de cultivo celular. Después de 15 minutos, agregue 7,5 veces 10 a la cuarta de células Jurkat efectoras modificadas que expresan el receptor Fc adecuado por pozo en 25 microlitros de medio ADCC, para un volumen final de 75 microlitros de medio ADCC por pozo. Devuelva la placa al incubador de cultivo celular durante seis horas, descongelando el tampón de sustrato de luciferasa en un baño de agua a 37 grados Celsius durante la última hora de la incubación.Cuando el tampón esté listo, agregue 75 microlitros de tampón de sustrato de luciferasa a todos los pocillos excepto al pocillo de control de fondo y lea la placa en un luminómetro. Luego, se puede calcular la inducción relativa de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en las culturas de células transfectadas o infectadas. En este experimento, un anticuerpo monoclonal específico para la cepa activó y modificó robustamente las células Jurkat que expresaban el receptor Fc gamma murino cuatro en aproximadamente 14 veces en comparación con los anticuerpos monoclonales específicos para la cabeza y los anticuerpos IgG de control.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo configurar un experimento para evaluar la capacidad de anticuerpos específicos de interés para activar la inmunidad mediada por Fc.

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método sencillo slot blot fue desarrollado para la cuantificación de la hemaglutinina y la neuraminidasa viral de la gripe utilizando anticuerpos universales dirigidas a sus secuencias más conservadas identificados a través de análisis de la bioinformática. Este enfoque innovador puede ofrecer una alternativa útil para la determinación cuantitativa de todos los hemaglutinina y la neuraminidasa viral.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

El video muestra un ensayo de inhibición de la hemaglutinación para detectar anticuerpos séricos contra antígenos específicos. La confirmación de la inhibición de la hemaglutinación en el pocillo de prueba y la hemaglutinación en el pocillo de control se logra a través de patrones visuales distintos. Este ensayo desempeña un papel crucial en la evaluación de la respuesta inmunitaria, la eficacia de las vacunas y el estudio de las infecciones virales en virología e inmunología.

Ensayo de inhibición de la hemaglutinación para detectar anticuerpos séricos contra un antígeno diana

Este video muestra un ensayo que mide la activación mediada por anticuerpos de las funciones efectoras de las células T. La adición de un anticuerpo monoclonal específico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza a las células de mamíferos transfectadas que expresan HA da como resultado la formación de complejos inmunes con HA. Al introducir células T modificadas que expresan receptores Fc y un indicador de luciferasa, las células T son activadas por los complejos anticuerpo-HA, y esta...

Medición de la activación de las funciones efectoras mediadas por Fc por anticuerpos HA

Este video muestra un ensayo que mide los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en una muestra de suero. Se añade una muestra de suero que contiene anticuerpos contra el NA a una placa de micropocillos recubierta de fetuina. Al agregar el virus, los anticuerpos evitan que el NA viral escinda la fetina y exponga su fracción de galactosa. A continuación, se añade una lectina conjugada con peroxidasa, que se une a la galactosa expuesta. El título de...

Un ensayo para medir los títulos de anticuerpos de inhibición de la neuraminidasa de la influenza

Utilizando una estrategia de microarrays de glicanos impresos, se miniaturizó un ensayo convencional de placa de 96 pocillos para analizar la avidez de hemaglutinina del virus de la influenza A y la especificidad de los receptores que contienen ácido siálico.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Describimos el ensayo de lectina ligado a enzimas (ELLA) para medir los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en sueros. El ensayo utiliza aglutinina de cacahuete para cuantificar los residuos de galactosa que se vuelven accesibles cuando la NA elimina el ácido siálico de las placas de 96 pocillos recubiertas de fetuina.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Los protocolos presentados describen cómo realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe de las muestras de suero de los receptores de la vacuna de influenza. El primer ensayo determina las concentraciones óptimas de antígeno viral por hemaglutinación. El segundo ensayo cuantifica los títulos de anticuerpos específicos de la gripe por inhibición de la hemaglutinación.

Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

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Presentamos un protocolo para el uso de un microarray proteico construido mediante la impresión de antígenos de la gripe en diapositivas recubiertas de nitrocelulosa para sondear simultáneamente el suero de múltiples anótipos de anticuerpos contra más de 250 antígenos de diferentes cepas de virus, por lo tanto permitiendo la medición de la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus.

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Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

Aprende a evaluar funciones efectoras mediadas por Fc en anticuerpos contra la hemaglutinina del virus influenza. Este protocolo de 24 horas utiliza células HEK293 y ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos para investigar la eficacia vacunal.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe (Video) | JoVE Journal

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

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