Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

El objetivo general de este protocolo es purificar y aislar las células endoteliales primarias del cerebro porcino con el fin de establecer un modelo de barrera hematoencefálica in vitro estricto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la barrera hematoencefálica, como la administración de fármacos, la permeabilidad, el tráfico de receptores, así como la estanqueidad y la polaridad del BB. La principal ventaja de este modelo es el alto rendimiento de células endoteliales cerebrales primarias que se pueden utilizar para crear un modelo de barrera hematoencefálica in vitro que tiene un alto TEER y una baja permeabilidad. Para comenzar este procedimiento, coloque los cerebros en un banco de flujo estéril y lávelos suavemente con un litro de PBS en un vaso de precipitados colocado sobre hielo.

A continuación, retire con cuidado las meninges de cada cerebro con pinzas de punta fina. Con un bisturí, raspe la materia gris de los cerebros de uno en uno y transfiera el material aislado a placas de Petri que contienen 20 mililitros de DMEM/F-12 colocadas en hielo. Para la fragmentación inicial, pase el material de materia gris a través de una jeringa de 50 mililitros sin la aguja.

Repita el procedimiento para todos los cerebros y agrupe el material de materia gris recolectado. Transfiera el material de materia gris aislado con medio DMEM/F-12 al tubo de molienda de un homogeneizador de tejido manual. Homogeneice el material haciendo ocho trazos hacia arriba y hacia abajo con un mortero suelto, seguidos de ocho trazos hacia arriba y hacia abajo con un mortero apretado.

A continuación, aísle los capilares filtrando el homogeneizado con una botella de tapa azul de 500 mililitros con soporte de filtro y malla de filtro de 140 micras. Coloque los filtros que contienen capilares en placas de Petri con una solución de digestión. Posteriormente, incubar las placas de Petri a 37 grados centígrados durante una hora en un agitador orbital a 180 RPM, o removerlas suavemente cada 10 minutos.

Después de una hora, lave los capilares de los filtros con suspensión de la placa de Petri. Luego, divida la suspensión de los tres platos en dos tubos de 50 mililitros y detenga la digestión agregando 10 mililitros de DMEM / F-12 a cada tubo de 50 mililitros. Centrifugar las suspensiones celulares a 250 veces g, cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Posteriormente, aspire los sobrenadantes y vuelva a suspender cada pellet en 10 mililitros de DMEM/F-12. A continuación, añada otros 20 mililitros de DMEM/F-12 a cada tubo. Para optimizar las condiciones para la fijación de PBECs, agregue solución de recubrimiento al matraz T-75, dando como resultado las concentraciones finales de colágeno cuatro a 150 microgramos por mililitro y fibronectina a 50 microgramos por mililitro y por agua destilada, asegurándose de que la solución cubra toda la superficie.

A continuación, descongele los capilares en un baño de agua a 37 grados centígrados. Para eliminar el medio de congelación, gire los capilares a 250 veces g, cuatro grados centígrados, durante siete minutos. Después de eso, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en uno o dos mililitros de la alícuota de 10 mililitros.

A continuación, transfiera la suspensión capilar al matraz T-75 recubierto e incline suavemente el matraz para asegurar una distribución uniforme sobre la superficie. Coloque el matraz T-75 a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación durante la noche, prepare 10 mililitros de medio de crecimiento PBEC, suplementado con puromicina a cuatro microgramos por mililitro para un matraz T-75 y realice un cambio de medio.

Luego, prepare los insertos de membrana permeable para la siembra de PBEC recubriéndolos con colágeno IV a 500 microgramos por mililitro y fibronectina a 100 microgramos por mililitro, y con agua destilada. Tripsinizar las células añadiendo dos mililitros de solución de tripsina-EDTA al matraz T-75 y colocarlo a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante cinco a siete minutos. Para separar las células endoteliales del cerebro, golpee suavemente el costado del matraz T-75 con las yemas de los dedos.

Posteriormente, transfiera la solución celular a un tubo de 15 mililitros y centrifuga las células endoteliales del cerebro por centrifugación a 250 veces g, cuatro grados Celsius, durante siete minutos. Luego, retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio. A continuación, añade otros dos mililitros de medio para llevar el volumen total a tres mililitros.

Cuente el número de celdas manualmente utilizando una cámara de conteo de celdas o un sistema automático de conteo de celdas. Para el cocultivo sin contacto, transfiera los insertos a los pocillos que tienen astrocitos, que se refrescaron con medio de crecimiento de astrocitos el día anterior. Al día siguiente, reemplace el medio en los insertos de membrana permeable que contienen PBEC.

Luego, aspire cuidadosamente el medio de los pocillos y agregue 750 microlitros de medio de diferenciación a cada pocillo. A continuación, aspire cuidadosamente el medio de los insertos y agregue 500 microlitros de medio de diferenciación por inserto. A continuación, añada los 750 microlitros restantes de medio de diferenciación a cada pocillo de astrocitos.

Después de eso, incubar las células con medio de diferenciación a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, hasta el día siguiente. Al día siguiente de estimular las células con medio de diferenciación, prepare el sistema de cámara de medición de resistencia tisular para las mediciones de TEER enjuagando la cámara dos veces con agua bidestilada, una vez con etanol al 70% durante cinco minutos y dos veces más con agua bidestilada. A continuación, conecte la cámara al sistema, agregue cuatro mililitros de DMEM/F-12 a la cámara de medición de resistencia de tejidos y déjela permanecer a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.

Después de eso, realice mediciones de TEER colocando cuidadosamente los insertos en la cámara de medición de resistencia de tejido. Estas son las imágenes de microscopía de contraste de fase de PBEC, cultivos y astrocitos observadas durante cinco días. Los fragmentos capilares purificados en el primer día del cultivo inicial mostraron presencia tanto de capilares como de células contaminantes, que después de un cambio medio en el segundo día y un día adicional de crecimiento, mostraron selección para PBECs, iniciando su crecimiento a partir de los fragmentos capilares.

Las monocapas confluentes de PBEC generalmente se lograron en el día cuatro al seis, momento en el que las PBEC mostraron una morfología en forma de huso y se alinearon longitudinalmente. Los astrocitos de rata sembrados en los pozos de fondo normalmente proliferaron a las capas confluentes en cinco días, y se utilizaron para modelos de cocultivo sin contacto después de dos semanas de crecimiento. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en siete horas.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la administración de fármacos y el tráfico de receptores en células endoteliales cerebrales apretadas y polarizadas. Después de ver este vídeo, deberías tener una buena comprensión de cómo crear un modelo de barrera hematoencefálica in vitro que pueda utilizarse para nuevos estudios que no se pueden llevar a cabo in vivo.