Un método General para la detección de formación de Nitrosamide en el metabolismo In Vitro de nitrosaminas por Cytochrome P450s

El objetivo general de esta metodología es determinar si el citocromo P450s puede oxidar procesivamente n nitrosaminas a n nitosamidas in vitro. Este método beneficia al campo de la toxicología al evaluar si las nitosaminas se metabolizan directamente a nitrosamidas. Debido a que las nitrosamidas son relativamente estables en el ADN alquilado, podrían desempeñar un papel en la carcinogénesis.

La principal ventaja de esta técnica es el uso de un espectrómetro de masas de alta sensibilidad que proporciona límites de detección más bajos que los alcanzados anteriormente para ensayos similares in vitro del metabolismo de la nitrosamina. Para comenzar este procedimiento, coloque un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, que contenga una barra magnética para agitar, en un horno. Secar durante 16 horas a 140 grados centígrados.

Después de esto, transfiera el matraz a una campana extractora y enfríelo bajo un chorro de gas nitrógeno. Agregue 31,8 miligramos de norcotinina, cinco mililitros de anhídrido acético y un mililitro de ácido acético al matraz y comience a revolver. Transfiera el matraz a un baño de agua helada.

Agrega 33.3 miligramos de nitrito de sodio. Continúe revolviendo durante 2,5 horas, luego vierta la reacción en 18 mililitros de agua helada para apagar la reacción. Transfiera inmediatamente la solución a un embudo separador que contenga 18 mililitros de DCM y extraiga la solución acuosa.

Extraiga la capa acuosa dos veces más, utilizando 9 mililitros de DCM cada vez. A continuación, seque los compuestos orgánicos acumulados con más de 100 miligramos de sulfato de magnesio durante dos minutos. Después de filtrar, use un evaporador rotativo para concentrar la solución a 30 grados Celsius para producir un aceite amarillo crudo.

Purifique el compuesto crudo utilizando cromatografía en columna como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, disuelva el compuesto puro en un mililitro de cloroformo deuterado. Usando RMN, confirme la estructura y molaridad de la solución como se describe en el protocolo de texto.

Guarde esta solución en la oscuridad a una temperatura entre dos y ocho grados centígrados hasta que la necesite. A continuación, confirme la masa principal precisa y determine las masas de iones producto de la solución de NNC pura mediante infusión directa en un espectrómetro de masas de alta resolución, como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, retire los reactivos necesarios de un congelador a 80 grados centígrados y descongele con hielo.

Una vez descongelado, utilice un tampón de reacción de 0,5 para diluir los baculosomas en el sistema de regeneración de NADPH 1-10 y 1-50 respectivamente, en un tubo de un mililitro. A continuación, añada tres microlitros de la solución madre de NADP a un tubo de un mililitro que contenga 97 microlitros de un tampón de reacción de 0,5 grados. Para cada incubación, prepare un tubo de un mililitro añadiendo 40 microlitros de una solución de NNN de cuatro micromolares hecha con tampón de reacción.

Agregue 50 microlitros de solución enzimática que contenga cinco picomoles de P450 2A6 a cada tubo. Preincubar en un baño de agua a 37 grados durante dos minutos. A continuación, añada 10 microlitros de solución diluida de NADP+ a cada tubo.

Incubar a 37 grados centígrados durante entre uno y 30 minutos. Después de esto, primero agregue 10 microlitros de sulfato de zinc normal 3.0 y luego agregue 10 microlitros de hidróxido de bario normal 3.0 para apagar la reacción. Vórtice la solución para formar un precipitado blanco.

A continuación, centrifugar a ocho mil Gs durante cuatro minutos. Recoja inmediatamente el sobrenadante y analice dos microlitros por cromatografía líquida con ionización positiva por nanoelectrospray y espectrometría de masas en tándem de alta resolución. En este estudio, la norcotinina se nitrosata a NNC de forma limpia y con alto rendimiento, produciendo un estándar para su uso en el experimento in vitro.

El éxito de la reacción se verifica mediante análisis espectroscópicos, incluida la espectrometría de masas en tándem de alta resolución, que confirmó que la masa del progenitor está dentro de las cinco partes por millón del valor teórico. A continuación, se utiliza la fragmentación por espectrometría de masas en tándem de NNC para determinar las masas de iones producto más abundantes. Como se puede ver, los dos iones producto más abundantes son 134 y 162, con una detección precisa de la masa hasta cinco decimales.

A continuación, el NNC sintetizado se utiliza como estándar para el ensayo de metabolismo in vitro P450. En las condiciones utilizadas, el NNC sintético eluye aproximadamente a los 17,5 minutos, con picos bien resueltos tanto en el canal iónico principal como en el canal iónico producto. De acuerdo con el control positivo, la formación de NNC se observa en las incubaciones de un minuto, cinco minutos y 10 minutos.

Si se realiza correctamente, el análisis espectroscópico de síntesis de nitrosamida se puede realizar en aproximadamente seis horas. Del mismo modo, el ensayo in vitro con múltiples incubaciones no debe durar más de ocho horas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la evaluación del riesgo de cánceres relacionados con el tabaco, ya que la medición de los biomarcadores relacionados con la nitrosamida podría ser informativa sobre la activación individual de la nitrosamina.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar procesar las incubaciones de enzimas rápidamente. Las nitrosamidas se hidrolizan en estas condiciones y no deberían permanecer mucho tiempo antes del análisis de espectrometría de masas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar patrones de nitrosamida y evaluar si se forman in vitro por el sistema adecuado de citocromo nitrosamina P450.

No olvide que trabajar con NNN, NNC o carcinógenos relacionados puede ser peligroso. Estos compuestos siempre deben manipularse en una campana extractora mientras se usa una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Además, todos los desechos cancerígenos deben almacenarse y etiquetarse adecuadamente.