Celulares corrientes inducidas por Puff aplicación de GABA en rebanadas de cerebro

El objetivo general de esta técnica de inhalación es llevar a cabo la administración farmacológica en el registro de patch-clamp de células completas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la electrofisiología, como la administración farmacológica. La principal ventaja de esta técnica es que la concentración del fármaco alrededor del sitio de registro aumenta rápidamente, evitando así la desensibilización de los receptores de membrana.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la preparación del corte de la corteza prefrontal aguda y la posición de la micropipeta de hojaldre son relativamente difíciles. Para comenzar este procedimiento, triture la solución de corte congelada para obtener un granizado. Mantenga la solución fangosa en hielo y burbujeela con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono.

A continuación, coloque la cabeza diseccionada en un vaso de precipitados lleno de solución de corte helada y sáquela después de unos segundos. Corta el cráneo a lo largo de la línea media en dirección caudal-rostral con unas tijeras finas y retira las partes laterales del cráneo. Luego, retire el cerebro con una espátula fina y colóquelo en la solución de corte helada.

Después, coloca el cerebro en la tapa de una placa de Petri de nueve centímetros llena de hielo. Enjuague el cerebro con una solución de corte helada. Luego, corta el cerebelo y el bulbo olfativo con una cuchilla de afeitar.

A continuación, aplique pegamento de cianoacrilato al portamuestras Vibratome. Coloque con cuidado el bloque de cerebro sobre la gota de pegamento, con el lado rostral hacia arriba, e inmediatamente sumérjalo en la solución de corte helada. Ajuste el portacuchillas a un ángulo de 15 grados con respecto al plano horizontal.

Divida los tejidos cerebrales en cortes coronales de 350 micras. Luego, transfiera los portaobjetos a la cámara de recuperación llena de ACSF e incube durante una hora con un burbujeo constante de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. En nuestro experimento, la preparación del corte de la corteza prefrontal aguda también es fundamental en el procedimiento.

Un corte de cerebro saludable significa neuronas activas que se pueden parchear firmemente. En este procedimiento, fabrique micropipetas de borosilicato de vidrio para usarlas como electrodos de registro o micropipetas de soplo. Para los electrodos de registro, las resistencias de la punta están en el rango de cuatro a seis megaohmios, mientras que las micropipetas de soplo tienen diámetros de punta en el rango de dos a cinco micrómetros.

Agregue un bloqueador de canales de sodio a ACSF para bloquear el canal de sodio rápido y, por lo tanto, los potenciales de acción, y mantenga un caudal constante de esta solución de dos a tres mililitros por minuto en la cámara de registro. Burbujee el ACSF con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono constantemente para garantizar la viabilidad de las rodajas. Transfiera un trozo de cerebro a la cámara de grabación, utilizando una pipeta Pasteur con su punta fina cortada para adaptarse al tamaño del corte.

A continuación, coloque un ancla de rodaja de platino sobre la rebanada para sujetarla en la plataforma. Después de eso, llene las micropipetas de registro con solución interna y llene las micropipetas de soplo con GABA a 10 micromolares, 50 micromolares y 100 micromolares, o ACSF como control del vehículo. Para evitar la obstrucción con residuos, aplique una ligera presión positiva con una jeringa de un mililitro antes de sumergir el electrodo de registro en el ACSF.

Bajo un microscopio, coloque el electrodo de registro y la micropipeta de soplo de modo que las puntas aparezcan en el centro del monitor. A continuación, identifique una neurona objetivo. Ajuste el enfoque del microscopio mientras baja gradualmente la micropipeta de soplo y colóquela sobre la neurona registradora en un ángulo de 45 grados.

Mantenga la distancia entre la punta de la micropipeta puff y la neurona objetivo en el rango de 20 a 40 micrómetros. Acérquese lenta y cuidadosamente a la neurona con el electrodo registrador y luego libere la presión positiva. Aplique una succión débil y breve a través del tubo conectado al portaelectrodos para crear un sello de gigaohmios.

Mantenga el voltaje a cero milivoltios. Después de la formación del sello de gigaohmios, compense la capacitancia rápida y lenta de forma manual o automática. A continuación, aplique una succión breve y fuerte a través del tubo para entrar en el modo de célula completa.

Posteriormente, registre las corrientes IPSC evocadas en el modo de pinza de voltaje. Suministre bocanadas de GABA individuales o emparejadas a través de la micropipeta de inhalación controlada por un generador de pasos de voltaje Master-8. Cambie la duración del soplo para obtener los mejores resultados de corrientes IPSC evocadas y mida las corrientes IPSC evocadas en el modelo de depresión inducida por LPS.

Aquí se muestran las IPSC de muestra inducidas por GABA de 10, 50 y 100 micromolares. Y aquí están las curvas de respuesta de duración de la bocanada. Aquí se muestran las corrientes repetitivas evocadas por GABA a 50 bocanadas micromolares a intervalos entre inhalaciones de uno, dos o tres segundos.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar obtener cortes de cerebro saludables. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la administración farmacológica exploraran el efecto del fármaco en la electrofisiología.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la administración farmacológica en el registro de parches y pinzas de células completas. No olvide que trabajar con TTX puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.