Name: Celulares corrientes inducidas por Puff aplicación de GABA en rebanadas de cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende la técnica de puff para administración farmacológica en registros de patch-clamp de corteza prefrontal. Este método permite aumentar rápidamente la concentración de fármacos y prevenir la desensibilización de receptores.

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Los autores desean agradecer a las siguientes organizaciones: Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31171018, 31171355), la ciencia y la tecnología de división de Guangdong (2013KJCX0054), la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) y Guangzhou ciencia y Technology Bureau (201607010320).

Alojamiento de los animales y todos los animales se realizaron experimentos de acuerdo con procedimientos aprobados por el Comité de ética para la investigación animal en South China Normal University, según las directrices para el cuidado del Animal establecido por el Instituto Nacional de Salud.
 1. preparación de soluciones <ol><li>preparar 500 mL de estándar artificial líquido cerebroespinal (ACSF) que contiene los componentes se describe en nuestro trabajo publicado 7 como se indica en la tabla 1.
	<ol><li>Uso limpia vidrio vasos de precipitados con agua desionizada para preparar una solución fresca de la ACSF. Limpiar espátulas con agua desionizada y seque antes de usar Añadir NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucosa y añadir CaCl 2 después de haber burbujas la solución con 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de ~ 20 minutos (como indica en la tabla 1) a 500 mL de agua desionizada. Revolver hasta que esté disuelto completamente.</li>
		<li>Asegurar la ACSF es completamente clara sin ninguna precipitación. Luego, ajustar el pH a 7.2-7.4. Burbuja con una mezcla de gases compuesta de 95% O 2 y 5% CO 2 ~ 20 min</li>
	</ol></li> <li>Preparar 250 mL de solución de corte de rebanada que contienen los productos químicos 7 descritos en la tabla 2.
	<ol><li>Añadir KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucosa y añadir CaCl 2 últimos como se indica en 1.1.1, a 250 mL de agua desionizada y disolver como se describe en 1.1.1 y 1.1.2.</li>
		<li>Después de burbujeo con 95% O 2 / 5% CO 2, coloque la solución en el congelador durante 15-20 min para que se convierte en la solución de corte parcialmente congelados y helados. 
		Nota: Utilizamos esta solución de corte al hacer rodajas de 1-2 mes-ratones del viejo; la fórmula puede variar para los ratones mayores de 2 meses.</li>
		<li>Solución de LPS preparar disolviendo en solución salina libre de endotoxina isotónica estéril (0.9% NaCl). LPS es administrado por vía intraperitoneal (0, 5 mg/kg) y comenzar a grabar 2 h más tarde.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparación de Corteza Prefrontal <ol><li>tomar la solución de corte fuera del congelador y homogeneizar para obtener un granizado. Coloque la solución en hielo y burbujas constantemente con 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>Con unas tijeras grandes y afiladas, rápidamente decapitar un ratón como descrito 9 e inmediatamente puso la cabeza en un vaso llenado de frías (0-4 ° C) solución de corte.</li>
	<li>Cortar la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media en dirección caudal nasal con tijeras finas y retirar las porciones lateral del cráneo. Quitar el cerebro con una espátula fina y colocar en solución de corte helada. 
	Nota: Pasos 2.2-2.3 deben realizarse rápidamente (idealmente &#60; 1 min).</li>
	<li>Poner el cerebro en la tapa de un plato de Petri de 9 cm con hielo. Lavar el cerebro con la solución de corte helado. Corta el cerebelo y el bulbo olfatorio con una cuchilla de afeitar.</li>
	Titular de <li>Aplicar pegamento del cianocrilato a la muestra de un vibratome. Coloque cuidadosamente el bloque del cerebro sobre la gota de pegamento, lado rostral y sumerja inmediatamente en la solución helada corte.</li>
	<li>Ajustar el sujetador de la cuchilla de vibratome a un ángulo de 15° en relación con el plano horizontal y preparar 350 μm rebanadas de cerebro coronales (frecuencia de la vibración de la lámina = 85 Hz, velocidad = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Con una pipeta, transfiera las rebanadas en la cámara de recuperación llenan con ACSF, incubar durante 1 h (a RT) con burbujeo constante de 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Grabación de parche de celulares <ol><li>hacer vidrio Micropipetas de borosilicato para utilizar como electrodos de grabación o puff Micropipetas según las directrices específicas en el Manual de operación del tirador. Para la grabación de los electrodos, las resistencias de punta están en el rango 4-6 M &#8486;, mientras que el soplo Micropipetas tienen diámetros de punta en el rango de 2-5 μm.</li>
	<li>Agregar bloqueador de canales de Na + (TTX, 1 μm), bloque rápido Na + de canales y así los potenciales de acción, a la ACSF y mantener un flujo constante de esta solución de 2-3 mL/min en la sala de grabación, por bomba peristáltica en la cámara de y aspiraciones de ella. Burbuja la ACSF con 95% O 2 / 5% CO 2 constantemente para garantizar la viabilidad de las rodajas de.</li>
	<li>Transferir un trozo de cerebro en la sala de grabación con una pipeta Pasteur modificada cuya punta fina fue cortada para ajustarse al tamaño de rebanada. Cubre la rebanada con un ancla de platino rebanada con hilos de nylon paralelo espaciados &#8805; 2 mm aparte hacer la rebanada en la plataforma de.</li>
	<li>Llenar la micropipeta de grabación con solución interna 7 (tabla 3) y se llenan de las Micropipetas puff GABA en 10 μm, 50 μm y 100 μm (disuelto en ACSF) o ACSF como control del vehículo.</li>
	<li>Para evitar la obstrucción con residuos, aplique ligera presión positiva utilizando una jeringa de 1 mL antes de sumergir el electrodo de la grabación en la ACSF. Utilizando un micromanipulador bajo un microscopio (objetivo del x 4), colocar la micropipeta de electrodo y puff de grabación para que aparezcan las puntas en el centro de la imagen en el monitor ( figura 1 A).</li>
	<li>Ajustar el enfoque del microscopio (objetivo x 40) reduciendo gradualmente la micropipeta de hojaldre y colocar por encima de la neurona de la grabación en un ángulo de 45°. Mantener la distancia entre la punta de la micropipeta de hojaldre y la neurona registrada entre 20-40 μm ( figura 1 B). Lenta y cuidadosamente abordar la neurona con el electrodo de la grabación y luego suelte la presión positiva. Aplicar una succión débil y breve a través del tubo conectado a la pinza portaelectrodos para crear un sello de giga ohmios.</li>
	<li>Mantener la tensión a 0 mV. Después de la formación del sello giga ohmios, compensar rápido y lento capacitancia manualmente o automáticamente. Luego aplicar una succión breve y fuerte a través del tubo mencionado arriba para entrar en la célula entera.</li>
	Modo de <li>eIPSC de registro en la abrazadera de tensión. Presión baja de gas (nitrógeno, 4-6 psi) se aplican a la micropipeta de hojaldre utilizando un Picospritzer controlado por un generador de paso de voltaje Master 8 para entregar GABA unitarios o emparejado soplos ( figura 2).</li>
	<li>Cambiar la duración del soplo para obtener los mejores resultados de la eIPSC ( figura 3) y medir el eIPSC en el modelo de la depresión inducida por LPS ( figura 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aplicación de hojaldre es ampliamente utilizado para evaluar la función de receptores postsinápticos3,4,7, pero requiere un control preciso en cada experimento. Aquí describimos un procedimiento que implica sujeción parche de células enteras, que demuestra que GABA-puff inducida IPSCs (es decir, eIPSCs) en rebanadas de cerebro cortical prefrontal. La resistencia del electrodo de registro es MΩ cerca de 5, mientras que el diámetr...

La técnica de patch-clamp, una herramienta primaria para la investigación de las señales eléctricas en las neuronas, se desarrolló en la década de 19701,2. Una gran ventaja de esta técnica es que proporciona conocimiento sobre tratamientos específicos cómo (por ejemplo, farmacológicas) pueden alterar las funciones neuronales o canales en tiempo real3. Evaluación farmacológica de la función neuronal durante la grabación en una rebanada del cerebro de células completas requiere la aplicación de fármacos, como agonistas o antagonistas de receptores específicos, las neuronas se registran. Este método permite la identificación de alteraciones neuronales que ocurren después de la aplicación de un medicamento específico, lo que conduce a una mejor comprensión de las propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas4. Aunque la administración farmacológica puede llevarse a cabo mediante perfusión5 o soplo6, este último es la técnica superior. En particular: () aplicación de hojaldre rápido aumenta la droga concentración alrededor de la neurona grabada a un nivel tal que se evita la desensibilización de los receptores de membrana; (ii) el volumen de droga inflado es extremadamente bajo, por lo que hay poco efecto en la solución del baño, que por lo tanto reduce los efectos indeseables de las sustancias químicas administradas en rebanadas de cerebro; (iii) el protocolo de hojaldre puede ser establecido y guardado, haciendo el experimento precisamente reproducible; (iv) puff aplicación representa uso económico de agonistas/antagonistas, especialmente donde tales reactivos son caros o difíciles de conseguir.
Aquí, nos centraremos en la grabación de celulares corrientes inducidas por GABA el soplar en rebanadas de cerebro agudo preparado, una preparación que tiene la ventaja de circuitos cerebrales relativamente bien conservado. Cómo llevamos a cabo corrientes inhibitorios inducidos por el soplo7 se describen en este artículo. Utilizando cesio (Cs+)-soluciones internas y el mantenimiento de las neuronas a 0 mV, presentamos GABA-puff evocado inhibitorias postsynaptic corrientes (eIPSCs) con las características técnicas adecuadas. Utilizando un modelo de ratón de la depresión inducida por lipopolisacárido (LPS) inyección8, se muestra que el eIPSC amplitud evocada por un soplo de GABA se reduce significativamente en rebanadas de ratones inyectados por LPS comparados con el control del vehículo. Nuestra intención es que este artículo debería mostrar cómo la técnica de soplo es ampliamente aplicable a estudios dirigidos a evaluar el efecto de productos químicos, compuestos o drogas sobre actividades neuronales en rebanadas de cerebro.

<table><tbody><tr><td>Micropipetas de borosilicato de vidrio</td><td>Instrumentos de obturación</td><td>BF150-86-10</td><td>Diámetro exterior de 1,50 mm; Diámetro interior de 0,86 mm</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Instrumentos de obturador</td><td>MODELO P-97&nbsp;</td><td>Tirador de micropipetas para cejas</td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador controlado desde computador (PC)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td>Sistema de adquisición digital <td>Multiclamp 700B</td><td></td>de <td>Molecular Devices</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de imágenes Nikon</td><td>&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Equipos de inspección</td></tr><tr><td>Microscopía&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 Estimulador</td><td></td>de pulsos</tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Monitor de vídeo</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Pegamento de cianoacrilato</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de video</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

celulares corrientes inducidas por puff aplicación de gaba en rebanadas de cerebro

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Administración farmacológica es de uso general cuando se realizan células completas-abrazadera del remiendo en rebanadas de cerebro. Uno de los mejores métodos de aplicación de la droga durante la grabación electrofisiológica es la técnica de soplo, que puede utilizarse para estudiar el efecto de reactivos farmacológicos en actividades neuronales en rebanadas de cerebro. La mayor ventaja del uso del hojaldre es que la concentración del fármaco en el sitio de grabación aumenta rápidamente, evitando así la desensibilización de receptores de membrana. Exitosa aplicación del soplo implica especial atención a los siguientes elementos: la concentración del fármaco, los parámetros de la micropipeta de hojaldre, la distancia entre la punta de una micropipeta de hojaldre y la neurona registrada y la duración y presión conduce el soplo (libras por pulgada cuadrada, psi). Este artículo describe un procedimiento paso a paso para registrar celulares corrientes inducidas por ácido gamma - aminobutírico (GABA) en una neurona de un segmento cortical prefrontal de soplar. En particular, el mismo procedimiento se puede aplicar con pequeñas modificaciones a otras áreas del cerebro como el hipocampo y el striatum y a diferentes preparaciones, tales como los cultivos celulares.

La técnica de soplo permite a los investigadores a estudiar el efecto de las drogas en particular receptores en la superficie de una neurona determinada. En este artículo, nos centramos en corrientes mediadas por receptores de GABA. La figura 1 muestra las Micropipetas puff y grabación. Para eliminar cualquier efecto en las neuronas registradas de la presión física generado por el soplo, ACSF y soplos de sacarosa (figura 2<strong...

Describimos la técnica de soplo, que reactivos farmacológicos pueden ser administrados durante la grabación de la abrazadera del remiendo de célula entera y resaltar diversos aspectos de las características que son cruciales para su éxito.

Celulares corrientes inducidas por Puff aplicación de GABA en rebanadas de cerebro

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

El objetivo general de esta técnica de inhalación es llevar a cabo la administración farmacológica en el registro de patch-clamp de células completas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la electrofisiología, como la administración farmacológica. La principal ventaja de esta técnica es que la concentración del fármaco alrededor del sitio de registro aumenta rápidamente, evitando así la desensibilización de los receptores de membrana.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la preparación del corte de la corteza prefrontal aguda y la posición de la micropipeta de hojaldre son relativamente difíciles. Para comenzar este procedimiento, triture la solución de corte congelada para obtener un granizado. Mantenga la solución fangosa en hielo y burbujeela con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono.A continuación, coloque la cabeza diseccionada en un vaso de precipitados lleno de solución de corte helada y sáquela después de unos segundos. Corta el cráneo a lo largo de la línea media en dirección caudal-rostral con unas tijeras finas y retira las partes laterales del cráneo. Luego, retire el cerebro con una espátula fina y colóquelo en la solución de corte helada.Después, coloca el cerebro en la tapa de una placa de Petri de nueve centímetros llena de hielo. Enjuague el cerebro con una solución de corte helada. Luego, corta el cerebelo y el bulbo olfativo con una cuchilla de afeitar.A continuación, aplique pegamento de cianoacrilato al portamuestras Vibratome. Coloque con cuidado el bloque de cerebro sobre la gota de pegamento, con el lado rostral hacia arriba, e inmediatamente sumérjalo en la solución de corte helada. Ajuste el portacuchillas a un ángulo de 15 grados con respecto al plano horizontal.Divida los tejidos cerebrales en cortes coronales de 350 micras. Luego, transfiera los portaobjetos a la cámara de recuperación llena de ACSF e incube durante una hora con un burbujeo constante de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. En nuestro experimento, la preparación del corte de la corteza prefrontal aguda también es fundamental en el procedimiento.Un corte de cerebro saludable significa neuronas activas que se pueden parchear firmemente. En este procedimiento, fabrique micropipetas de borosilicato de vidrio para usarlas como electrodos de registro o micropipetas de soplo. Para los electrodos de registro, las resistencias de la punta están en el rango de cuatro a seis megaohmios, mientras que las micropipetas de soplo tienen diámetros de punta en el rango de dos a cinco micrómetros.Agregue un bloqueador de canales de sodio a ACSF para bloquear el canal de sodio rápido y, por lo tanto, los potenciales de acción, y mantenga un caudal constante de esta solución de dos a tres mililitros por minuto en la cámara de registro. Burbujee el ACSF con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono constantemente para garantizar la viabilidad de las rodajas. Transfiera un trozo de cerebro a la cámara de grabación, utilizando una pipeta Pasteur con su punta fina cortada para adaptarse al tamaño del corte.A continuación, coloque un ancla de rodaja de platino sobre la rebanada para sujetarla en la plataforma. Después de eso, llene las micropipetas de registro con solución interna y llene las micropipetas de soplo con GABA a 10 micromolares, 50 micromolares y 100 micromolares, o ACSF como control del vehículo. Para evitar la obstrucción con residuos, aplique una ligera presión positiva con una jeringa de un mililitro antes de sumergir el electrodo de registro en el ACSF.Bajo un microscopio, coloque el electrodo de registro y la micropipeta de soplo de modo que las puntas aparezcan en el centro del monitor. A continuación, identifique una neurona objetivo. Ajuste el enfoque del microscopio mientras baja gradualmente la micropipeta de soplo y colóquela sobre la neurona registradora en un ángulo de 45 grados.Mantenga la distancia entre la punta de la micropipeta puff y la neurona objetivo en el rango de 20 a 40 micrómetros. Acérquese lenta y cuidadosamente a la neurona con el electrodo registrador y luego libere la presión positiva. Aplique una succión débil y breve a través del tubo conectado al portaelectrodos para crear un sello de gigaohmios.Mantenga el voltaje a cero milivoltios. Después de la formación del sello de gigaohmios, compense la capacitancia rápida y lenta de forma manual o automática. A continuación, aplique una succión breve y fuerte a través del tubo para entrar en el modo de célula completa.Posteriormente, registre las corrientes IPSC evocadas en el modo de pinza de voltaje. Suministre bocanadas de GABA individuales o emparejadas a través de la micropipeta de inhalación controlada por un generador de pasos de voltaje Master-8. Cambie la duración del soplo para obtener los mejores resultados de corrientes IPSC evocadas y mida las corrientes IPSC evocadas en el modelo de depresión inducida por LPS.Aquí se muestran las IPSC de muestra inducidas por GABA de 10, 50 y 100 micromolares. Y aquí están las curvas de respuesta de duración de la bocanada. Aquí se muestran las corrientes repetitivas evocadas por GABA a 50 bocanadas micromolares a intervalos entre inhalaciones de uno, dos o tres segundos.Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar obtener cortes de cerebro saludables. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la administración farmacológica exploraran el efecto del fármaco en la electrofisiología.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la administración farmacológica en el registro de parches y pinzas de células completas. No olvide que trabajar con TTX puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Utilizamos la técnica de patch-clamp para medir GABA-activa de un solo canal corrientes (GABAA canales, los receptores GABA A) y las corrientes sinápticas y tónico que generan en las neuronas. La activación de los canales disminuye la excitabilidad neuronal en la salud y la...

GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata

Este video muestra el registro de corrientes de células enteras inducidas por ácido gamma-aminobutírico, o GABA, en un corte de cerebro cortical prefrontal de ratón. La administración controlada de GABA abre canales de cloruro en una neurona postsináptica, generando corrientes postsinápticas inhibitorias o IPSC. Estas IPSCs aumentan con concentraciones más altas de GABA, lo que refleja la actividad inhibitoria de GABA en la transmisión sináptica.

Registro de corrientes de células enteras con resoplido de GABA en un corte de cerebro de ratón

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Las oscilaciones son propiedades fundamentales de la red y son modulados por la enfermedad y las drogas. El estudio de las oscilaciones cerebrales rebanada permite la caracterización de las redes aisladas en condiciones controladas. Los protocolos se proporcionan para la preparación de cortes de cerebro agudos para evocar oscilaciones γ CA1.

Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Aquí, presentamos protocolos para descubrir compuestos activos en los receptores GABAA , de la Unión a la fisiología y la farmacología.

Métodos para el descubrimiento de nuevos compuestos modular un Receptor del ácido Gamma - Aminobutírico tipo una neurotransmisión

Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

El protocolo presentado describe el transporte y la preparación del tejido hipocampal humano resecado con el objetivo final de utilizar las rebanadas cerebrales vitales como una herramienta de evaluación preclínica para posibles sustancias antiepilépticas.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.

Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Aprende la técnica de puff para administración farmacológica en registros de patch-clamp de corteza prefrontal. Este método permite aumentar rápidamente la concentración de fármacos y prevenir la desensibilización de receptores.

Celulares corrientes inducidas por Puff aplicación de GABA en rebanadas de cerebro

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