Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

El objetivo general de este experimento es identificar y cuantificar con precisión más de 10.000 proteínas del lisado de células o tejidos a través de diferentes tratamientos farmacológicos, cursos de tiempo o condiciones biológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina o la biología, como qué proteínas están cambiando en respuesta a un medicamento u otro estímulo biológico. La principal ventaja de esta técnica es que tiene la capacidad de cuantificar con precisión más del 70% del proteoma expresado en 10 condiciones experimentales diferentes.

Las implicaciones de esta tecnología pueden extenderse al diagnóstico de enfermedades humanas a través del descubrimiento de biomarcadores potenciales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la lisis celular óptima y la estimación de fluidos desempeñan un papel clave en los procedimientos posteriores de digestión, etiquetado y separación. Para comenzar este protocolo, obtenga células cultivadas de interés.

Lave las celdas dos veces usando 10 mililitros de PBS para cada lavado. Raspe y recoja las células lavadas en un tubo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de PBS. Centrifugar a 600 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para lisar las células. Recoja y pese los tejidos deseados rápidamente después de la disección. Después de esto, guárdelos inmediatamente en nitrógeno líquido y guárdelos a menos 80 grados centígrados.

Prepare el tampón de lisis el día del experimento como se describe en el protocolo de texto. Agregue tampón de lisis a la muestra congelada de modo que la proporción de tampón a muestra sea de 10 a uno y la concentración final de proteína esté entre cinco y 10 miligramos por mililitro. A continuación, agregue perlas de vidrio y use una licuadora para lisar las muestras a cuatro grados centígrados y velocidad ocho mezclando durante 30 segundos y luego descansando durante cinco segundos, repitiendo esto cinco veces o hasta que las muestras estén homogeneizadas.

Mida la concentración de proteínas utilizando un ensayo de cuantificación de proteínas estándar o un gel de poliacrilamida SDS teñido con Coomassie con BSA como estándar. Después de esto, agregue acetonitrilo al 100% de modo que la concentración final sea del 10% y la proteasa Lys-C esté en una proporción de enzima a sustrato de uno a 100. Incubar a temperatura ambiente durante dos horas para permitir que se produzca la digestión de las proteínas.

A continuación, añada DTT de forma que la concentración final sea de un milimolar. Incubar a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, agregue 50 milimolares HEPES hasta que la concentración de urea en las muestras se diluya a dos molares.

Agregue tripsina a cada muestra en una proporción de tripsina a proteína de uno a 50. Incubar a temperatura ambiente durante al menos tres horas. A continuación, añadir DTT hasta que su concentración vuelva a ser de un milimolar e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.

Agregue yodoacetamida de tal manera que su concentración final sea de 10 milimolares. Incubar en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, enfríe cualquier yodoacetamida no reaccionada agregando DTT de tal manera que su concentración final sea de 30 milimolares.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Verifique la eficiencia de la digestión de tripsina como se describe en el protocolo de texto. A continuación, agregue TFA a cada muestra de manera que la concentración final sea del 1%Usando una tira de pH, mida el pH de cada muestra para verificar que esté entre dos y tres.

Agregue TFA adicional gota a gota si es necesario para alcanzar un pH inaceptable. Centrifugar las muestras a 20.000 veces g y a temperatura ambiente durante 10 minutos. Recoja el sobrenadante y cargue las muestras en columnas de centrifugación preparadas.

Centrifugar a 100 veces g durante tres minutos o hasta que la muestra haya pasado completamente a través de la columna para unir las muestras. A continuación, agregue 0,5 mililitros de 0,1%TFA a cada columna. Centrifugar a 500 veces g durante 30 segundos.

Después de esto, agregue 125 microlitros de una solución que contenga 60% de acetonitrilo y 0,1 TFA a cada columna. Centrifugar a 100 veces g durante tres minutos para eluir los péptidos de la columna. Reconstituir cada muestra de péptido desalado en 50 microlitros de HEPES de 50 milimolares.

Con una tira de pH, verifique que el pH de cada muestra esté entre siete y ocho. A continuación, disuelva los reactivos de TMT en acetonitrilo anhidro, añádalos a las muestras y, a continuación, incube a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, use puntas de pipeta de 10 microlitros incrustadas con medios de cromatografía para desalar un microgramo de cada muestra y analizar la eficiencia del etiquetado como se describe en el protocolo de texto.

Examine de seis a 10 péptidos separados para asegurarse de que no se detecten péptidos no marcados en las muestras etiquetadas. A continuación, mezcle aproximadamente dos microlitros de cada muestra. Utilice puntas de pipeta de 10 microlitros incrustadas con medios de cromatografía para desalar esta mezcla.

Analice las muestras por LC-MS/MS como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, solubilice la muestra de péptido desalada combinada con TMT en 65 microlitros de tampón A. Use una tira de pH para verificar que el pH sea de aproximadamente 8.0. Si la muestra sigue siendo ácida, utilice hidróxido de amonio para ajustar el pH según sea necesario.

A continuación, fraccione la muestra como se describe en el protocolo de texto. Configure el recolector de fracciones para recolectar fracciones cada dos minutos, incluido el tiempo de carga. Ajuste el caudal a 0,4 mililitros por minuto.

Recoge un total de 80 fracciones. A continuación, utilice un concentrador de vacío para secar completamente todas las demás muestras. Usando LC-MS/MS, analice las 80 fracciones para lograr una cobertura ultra profunda del proteoma.

En primer lugar, empaque 1,9 micrómetros de resina C18 en columnas vacías de 75 micrómetros de diámetro interior alcanzando un volumen de lecho de aproximadamente 1,3 microlitros. Enrolle la columna dos o tres veces dentro de un calentador de cartera de mariposa para asegurarse de que se caliente toda la longitud. Pega la columna en el interior del calentador, asegurándote de no cubrir el sensor de temperatura del calentador.

Luego, calienta la columna a 65 grados centígrados. Pase 100 nanogramos de péptidos cerebrales de rata a través del sistema LC-MS/MS para evaluar la calidad del sistema. Repita esta evaluación una vez más.

Después de esto, cargue aproximadamente 0,2 microgramos de péptidos reconstituidos en la columna mientras fluye un tampón A al 5%. Eluya los péptidos de la columna y analice con el espectrómetro de masas como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se describe un método de alto rendimiento para la cuantificación de proteínas con una estrategia de marcaje isobárico 10-plex. La eficiencia del etiquetado de TMT se examina utilizando LC-MS/MS para analizar las muestras marcadas con TMT y las muestras no etiquetadas correspondientes.

Como se puede ver, el pico peptídico no marcado se encuentra solo en la muestra no marcada, mientras que el pico peptídico marcado con TMT se encuentra solo en la muestra etiquetada. A continuación, se evalúa el efecto de la ventana de aislamiento MS2 sobre la interferencia. Todos los escaneos MS2 están designados como un escaneo limpio o un escaneo ruidoso.

Mientras que las exploraciones limpias exhiben iones y1 de lisina solamente, las exploraciones ruidosas los exhiben tanto en lisina como en arginina. Aquí se muestra la eliminación representativa de interferencias utilizando péptidos de E. coli marcados individualmente con tres reactivos TMT diferentes. Las intensidades relativas sumadas revelan que la corrección basada en iones y1 es más precisa para la cuantificación basada en TMT.

Una vez dominado, este protocolo se puede completar en cuatro o cinco semanas si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es muy importante asegurarse de que todos los pasos de control de calidad se realicen por completo para garantizar que el conjunto de datos final sea lo más preciso posible. La adaptación de este procedimiento para centrarse en las modificaciones postraduccionales puede responder a otras preguntas, como cómo cambia la ubiquitinación, la fosforilación o la acetilación en respuesta a la progresión de la enfermedad o al tratamiento farmacológico.

Después de su desarrollo, la tecnología allanó el camino para que los investigadores en el campo del producto exploraran los cambios en las proteínas en células y tejidos. Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo identificar y cuantificar con precisión más de 10,000 proteínas de una célula o tejido de mamífero. No olvide que trabajar con UPLC de alta presión y pocas columnas de sílice puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad al realizar este procedimiento.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando comenzamos a abordar el conocido problema de la compresión de proporciones que se produce en el marcaje isobárico. Nos hemos dado cuenta de que el fraccionamiento extensivo es una excelente manera no solo de aliviar este problema, sino que también aumenta la identificación de proteínas y péptidos que pueden aumentar aún más y adaptarse a un análisis de proteoma.