Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

El objetivo general de este método de adquisición de imágenes de dos fotones en dos colores in vivo es monitorizar los cambios dinámicos vasculares agudos de la columna vertebral que se producen tras una lesión contusiva de la médula espinal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo estos cambios vasculares dinámicos afectan la progresión patológica y los déficits funcionales que ocurren después de una lesión de la médula espinal. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas tradicionales que utilizan muestras promodernas es que proporciona evidencia de la dinámica vascular aguda de la lesión de la médula espinal dentro de un animal vivo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la lesión medular, ya que este método permite examinar posibles estrategias neuroprotectoras dirigidas a la reparación vascular precoz. La primera vez que tuvimos la idea de este método de imagen de dos colores fue cuando descubrimos que la inyección secuencial de colores fluorescentes contrastantes nos permite visualizar los vasos rotos después de una lesión de la médula espinal. Antes de comenzar el procedimiento, confirme el nivel adecuado de sedación por falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie de una rata Sprague Dawley hembra de seis semanas de edad, seguido de una inyección subcutánea de analgesia y un agente antiinflamatorio.

Afeitar a la rata en la región de la columna cervical y en la región del cuello en el lado del pecho del animal, y frote la piel expuesta con un exfoliante quirúrgico Betadine y toallitas con alcohol al 70%. Aplique ungüento en los ojos del animal y coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla quirúrgica estéril encima de una almohadilla térmica de 37 grados Celsius debajo de un microscopio estéril. Encuentre el punto de pulso cerca de la clavícula para ubicar la vena yugular externa y use un par de tijeras pequeñas de resorte estéril para hacer una incisión vertical en la intersección de la rama caudal de la mandíbula derecha, el tubérculo mayor del húmero y el manubrio.

Use las tijeras de resorte y las pinzas finas para aislar el vaso yugular, y use una línea de sutura quirúrgica estéril para ligar el extremo distal del vaso. A continuación, use un par de microtijeras para hacer una pequeña incisión en la pared del vaso y deslice un catéter especializado hecho de una aguja de calibre 21 unida a una jeringa de un mililitro llena de solución salina en el vaso. Si una pequeña cantidad de sangre ingresa a la aguja, la inserción fue exitosa.

Asegure la aguja en sus extremos proximal y distal. Para estabilizar la columna vertebral, cambie al animal a la posición prona y use una hoja de bisturí número 15 para cortar la piel a lo largo de la línea media a los niveles deseados de la columna. Localiza la segunda vértebra torácica por la espiga entre las escápulas y cuenta hacia arriba desde T2 para encontrar la vértebra C7.

Diseccionar las capas musculares de la quinta a la séptima vértebras cervicales bilateralmente para exponer las facetas laterales y hacer una hendidura a ambos lados del hueso vertebral lateral. Deslice los brazos de acero inoxidable de un aparato estabilizador modificado debajo de las facetas expuestas del proceso transversal y apriete los tornillos para estabilizar la columna vertebral. A continuación, retire con cuidado las láminas C5 a C7 y coloque un pequeño trozo de espuma de gel empapada en solución salina encima de la duramadre expuesta para mantenerla hidratada.

Para crear la ventana de imágenes de dos fotones, coloque pequeños trozos de espuma de gel en el espacio entre los músculos y los huesos vertebrales y una línea delgada de espuma de gel entre la médula espinal y los huesos vertebrales. A continuación, selle la zona ósea muscular circundante con pegamento adhesivo para tejidos. El paso más crítico para preparar una ventana de imagen exitosa es asegurarse de que no haya ningún sangrado menor dentro de la ventana.

Después de dejar que el pegamento se seque durante unos cinco minutos, llene una jeringa estéril de un mililitro con agar 4% tibio y dispense una pared de agar a lo largo del borde de la ventana. El agar se solidificará rápidamente sin dejar de ser flexible. Para obtener una imagen de referencia, primero retire la espuma de gel y agregue líquido de inmersión dentro de la ventana.

Coloque el animal estabilizado en la cámara oscura del microscopio de dos fotones con la ventana de imagen de dos fotones directamente debajo de un objetivo de bajo aumento, y baje la lente con cuidado dentro de la ventana. Llene una jeringa estéril de un mililitro con 0,5 mililitros de solución de dextrano de isotiocianato de rodamina B recién preparada y conecte la jeringa al catéter. Presione el émbolo muy lentamente para administrar el tinte usando el ocular para identificar el área de interés, y use una cámara de dispositivo de carga acoplada para adquirir una imagen de campo claro de los patrones de los vasos sanguíneos de la superficie.

A continuación, abra el software de imágenes de dos fotones para encender y seleccionar la longitud de onda de excitación láser adecuada. A continuación, seleccione la potencia del láser de dos fotones, el nivel de HV y el canal fluorescente adecuados que correspondan con el experimento de fluoróforo inyectado y obtenga imágenes del tejido a través de la ventana de imágenes para recopilar imágenes y datos de escaneo lineal. Para introducir la lesión por contusión C7 en la línea media, coloque a la rata en un dispositivo del sistema de lesiones de Louisville y seleccione un ajuste de 0 puntos.

A continuación, ajuste el desplazamiento del tejido y haga clic en ejecutar el experimento para desencadenar el impacto o la liberación que crea la lesión. A continuación, coloque un pequeño trozo de espuma de gel empapada en solución salina sobre la duramadre expuesta para mantenerla hidratada y abrir nuevas imágenes a través de la ventana de imagen utilizando los mismos parámetros de imagen. Transfiera al animal de vuelta a la cámara oscura e inyecte 0,5 mililitros de isotiocianato de fluoresceína dextrano recién preparado en el catéter.

A continuación, devuelva el animal a la cámara oscura del microscopio y obtenga imágenes en ambos canales de fluoróforos. La inyección de colorante fluorescente de rodamina dextrano permite la captura de una imagen de referencia para el mapeo de la red vascular al inicio. Después de la generación de una lesión contusiva C7 de la línea media moderadamente grave, la introducción de FITC-dextrano facilita la detección de la estructura vascular después de la fuga inducida por la lesión del primer tinte en el parénquima circundante.

Las imágenes del vaso antes y después de la lesión también permiten cuantificar los cambios en el diámetro del vaso y la respuesta a la lesión, así como los cambios en la velocidad de los glóbulos rojos antes y después de la lesión a través de los vasos. Tomados en conjunto, estos datos se pueden utilizar para clasificar los vasos de los que se obtienen imágenes como venas o arterias. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar los artefactos respiratorios notables y tratar de limitar cualquier sangrado menor dentro de la ventana de la imagen.

Este procedimiento también se puede realizar en animales transgénicos para responder preguntas adicionales sobre las interacciones neurovasculares que ocurren después de una lesión de la médula espinal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía de dos fotones para monitorear los cambios dinámicos vasculares agudos después de una lesión contusiva de la médula espinal en un animal vivo.