Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

El objetivo general de este protocolo de disección para la vasculatura de la retina del pez cebra adulto es proporcionar una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo relacionadas con la neoangiogénesis y los cambios estructurales mediante fluorescencia o microscopía confocal de barrido láser. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las complicaciones microvasculares, como el desarrollo de la retinopatía diabética. La principal ventaja de esta técnica es que toda la retinovasculatura puede ser presentada y analizada en procesos fisiológicos y patológicos sin necesidad de aplicar fluorescencia intervascular de una manera relativamente rápida y estandarizada.

Para comenzar, transfiera seis mililitros de solución de PFA PBS al cuatro por ciento recién preparada por muestra a los pocillos de las placas de seis pocillos. Después de sacrificar al pez cebra adulto de acuerdo con el protocolo de texto, colóquelo sobre toallas de papel limpias y séquelo. Usa un bisturí y corta las cabezas detrás del opérculo.

A continuación, transfiera las cabezas directamente a los pocillos de fijador recién preparado. Guarde las placas que contienen las cabezas de pescado a cuatro grados centígrados durante al menos 24 horas para asegurarse de que el fijador penetre en las capas más profundas de la retina. Con agarosa caliente al dos por ciento, llene una placa de Petri hasta un tercio y espere hasta que el agar esté firme.

Cubra la placa de agar con un X PBS para crear un espacio de trabajo para diseccionar los ojos. Transfiera la muestra fija a la placa de Petri. Y sosteniendo la cabeza en la superficie de corte con una pinza, inserte otra pinza unida con alfileres debajo del globo ocular en la cavidad orbital.

Abra lentamente la pinza por debajo del ojo y sujete el nervio óptico. A continuación, rasgue y desprenda el ojo con cuidado. Para extirpar cualquiera de los cuatro músculos rectos y los dos músculos extraoculares oblicuos conectados al ojo, así como el tejido extraocular residual que conecta el ojo con la cavidad orbitaria, sostenga el ojo a través de una pinza medio cerrada y, agarrando la estructura con la otra pinza, use un movimiento diametral para arrancarlo suavemente.

A continuación, utilice una aguja desechable de calibre 27 para perforar la córnea en el rango exterior. A través de esta abertura, use ambas pinzas para sujetar la córnea y abrirla ligeramente. A continuación, trabaja con cuidado para crear un desgarro centrado del tamaño de la pupila respectiva.

Aplique presión en el lado de la córnea del globo ocular en el borde externo de la córnea por encima del iris. Esto creará una pequeña abolladura y empujará el cristalino a la altura del desgarro corneal. A continuación, pasa las pinzas por debajo de la lente y retírala.

A continuación, gire el ojo boca abajo con el nervio óptico hacia arriba. Tenga en cuenta que la esclerótica y la córnea están conectadas y forman la túnica fibrosa del bulbo ocular para proteger la retina en forma de copa. Esta cáscara, conocida como córnea, protege el área alrededor del nervio óptico.

Inserte una aguja en esta interrupción para crear una abertura entre la esclerótica y la retina. Luego, usando este acceso con ambas pinzas, corte con cuidado la esclerótica axialmente en tiras para aumentar la apertura alrededor del nervio óptico. Tenga cuidado de mantener la córnea intacta en la transición a la circunferencia del lado de la córnea.

Antes de extraer la córnea del tejido intraocular restante, intente cortar cualquier conexión, ya que la unión a otras estructuras será un punto crítico. A continuación, sujete la esclerótica con una pinza y, agarrando el nervio óptico con la otra y tirando de ella, retire completamente la esclerótica del ojo y deséchela. Este paso proporcionará una estructura en forma de copa que consiste en la úvea y la retina que contiene la vasculatura de la retina.

A continuación, crea una ruptura en la capa coroidea y RPE sosteniendo una aguja de calibre 27 de lado con la copa restante mientras raspas la superficie exterior con el borde de la punta de la aguja. Use la ruptura como punto de acceso para agarrar la capa coroidea y RPE y use ambas pinzas para rasgarla en rayas, manteniendo intacta la conexión con el iris. A continuación, pase una pinza por debajo del iris y muévala en un circuito desde el exterior mientras crea tensión tirando de la capa coroidal y RPE discontinuada y separe la estructura combinada.

Si partes del iris no se pueden extirpar y permanecen conectadas a la retina en forma de copa después de la eliminación de la capa coroidea y del EPR, utilice otro punto de ruptura natural que el ojo del pez cebra adulto exhibe dentro de la capa fotorreceptora. De manera similar se acaba de demostrar que se elimina el iris. Raspe la retina en forma de copa restante para inducir interrupciones en la capa de fotorreceptores.

A continuación, utilice el acceso creado para eliminar la capa manteniendo intacta la posible conexión con el iris. Luego, pase las pinzas por debajo del iris y continúe en un circuito como se demostró anteriormente en este video para separar la estructura combinada. Es crucial desconectar el iris de su tejido subyacente de una manera sensata, ya que bloqueará la fluorescencia directamente sobre el círculo óptico interno durante la visualización de los vasos.

Un enfoque demasiado directo puede provocar la rotura de un vaso. A continuación, utilice unas tijeras de resorte de microdisección con un filo recto de dos puntos y cinco milímetros para cortar el nervio óptico lo más cerca posible de la retina. Esto permitirá un mejor montaje plano del tejido.

Para montar y visualizar la vasculatura de la retina, use un X PBS para lavar la retina disecada dos veces durante cinco minutos cada una. Coloque una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio. Luego, con una espátula de laboratorio con un extremo de microcuchara, transfiera la retina a la gota.

Con una pinza, mantenga el tejido en su lugar mientras usa un bisturí para cortar la estructura en forma de copa para crear una forma plana de cuatro o cinco pétalos, según el tamaño de la retina. Con un pedazo de papel fino, aspire el PBS sobrante, teniendo cuidado de no tocar la retina. A continuación, recubra la retina de montaje plano con un medio de montaje y cúbrala con el cubreobjetos.

Tenga cuidado de no crear espuma, ya que las burbujas de aire pueden distorsionar la visualización de los vasos de la retina. Usa esmalte de uñas para sellar la cubierta. Por último, realizar microscopía de fluorescencia o láser de barrido para visualizar la vasculatura de la retina.

Aquí se muestra un ejemplo morfológico de la vasculatura de la retina en un pez cebra EGFP de mosca transgénica adulta visualizado con un microscopio de fluorescencia y un segundo ejemplo fotografiado con un microscopio de barrido láser confocal que reduce la fluorescencia de fondo. La estructura retiniana revelada muestra un patrón altamente organizado. La arteria óptica penetra en la retina en la cabeza del nervio óptico y, en la mayoría de las muestras, se distribuye en cinco a siete vasos principales.

Luego, los vasos principales se ramifican en una sucesión de arcadas y se conectan al círculo óptico interno o IOC, también llamado vena circunferencial, que rodea el disco óptico en la periferia de la retina montada en plano. La retina del pez cebra adulto está compuesta por las siguientes capas de adentro hacia afuera. La capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa nuclear externa, la capa fotorreceptora y el epitelio pigmentado de la retina.

Aquí se muestra la estimación de los parámetros de la vasculatura a partir de la visualización de la vasculatura de la retina. La vasculatura interna de la retina está situada en la capa de células ganglionares, mientras que los capilares cordiales estarían asociados con el epitelio pigmentado de la retina. Una vez entrenada, esta técnica se puede realizar en menos de 20 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar practicar con regularidad, ya que la ausencia prolongada de la preparación reduce el resultado de la integridad de la embarcación. Siguiendo este procedimiento, se pueden analizar la diabetes y las patologías neurovasculares en el pez cebra adulto.