Name: Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a disecar y analizar la vasculatura retinal en pez cebra adulto tg(fli:EGFP) mediante microscopía confocal. Este protocolo estandarizado permite estudiar patologías vasculares y neoangiogénesis en modelos de retinopatía diabética.

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Los autores desean agradecer a Katrin Bennewitz y Marlene Hausner cría de pez cebra y asistencia técnica. Los autores reconocen el apoyo de la base centro vivo celular imágenes Mannheim en el centro de Biomedicina y Mannheim de tecnología médica (DFG INST 91027/9-1). Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (internacional investigación formación grupo 1874/1 "DIAMICOM", proyecto SP5 y SP9; SFB1118 de centro de investigación colaborativo, proyecto B1 y proyecto de investigación colaborativo centro SFB/TR23 Z5).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Modelos de neoangiogénesis retiniana inducida por hipoxia muestran aumento en el número de puntos de ramificación, angiogénica brotes, total área vascular y disminución de distancia intercapillary en pez cebra20. Estos resultados apoyan la idea de que el pez cebra es susceptible a las complicaciones microvasculares diabéticas21, como resultados de después de la retinopatía diabética incluyen neoangiogenesis mediada por la hipoxia, que está fuertemente vinculada a la expresión de VEGF. Cambios inducidos por la hiperglucemia en la retina de pez cebra conducen a mayor espesor de los vasos pero mantienen la general dibujo22. También alternando la inmersión en soluciones glucosadas durante 30 días disminuye el espesor de la IPL y INL23. También ya fue demostrada la influencia directa de los metabolitos de la glucosa en el pez cebra como metabólicos autores de vasculopathy. Hyperbranching vascular adicional se observó en la vasculatura de tronco de embriones de pez cebra tras la incubación con metilglioxal24. Actualmente, existe un modelo animal que proporciona todos los criterios claves de la retinopatía diabética. Cambios tempranos se encuentran a menudo, pero la progresión a retinopatía diabética proliferativa falta25. El pez cebra también cae en esta definición, como hemos visto sólo neoangiogenesis mediada por la hipoxia o los cambios inducidos por la hiperglucemia hasta ahora. Los resultados actuales apoyan la idea de que el pez cebra es susceptible a cambios vasculares mediada por hiperglucemia y como modelo animal potencialmente puede mostrar una progresión a retinopatía diabética proliferativa. Dependiendo de la fuerza y la exposición al efecto mediado por la hiperglucemia, el modelo experimental derecha podría conducir a isquemia en ciertas áreas de la retina de pez cebra y promover neoangiogenesis como los principales criterios de la retinopatía diabética proliferativa. Sin embargo, como el pez cebra es comparable nuevo jugador en el campo de la modelización a largo plazo patologías microvasculares, modelos próximos de la diabetes en el pez cebra proporcionar información adicional y aclarar su importancia con respecto a otros modelos y sus patologías. Por ejemplo, una cruz de pez cebra tg(gata1a:DsRed) con eritrocitos con etiqueta roja en la línea de tg(fli:EGFP) podría utilizarse simultáneamente visualizar potenciales intraoculares bleedings en el futuro modelos de pez cebra con microaneurismas como predictor de progresión a RDP.
Puesto que la vasculatura retiniana progresa en una sucesión de arcadas, evaluación de la distancia de Punteaduras, número de puntos de ramificación y el área vascular total se relaciona con la distancia de la arteria central de la óptica. Para evitar sesgos en los parámetros vasculares evaluados, se requiere un punto de orientación. El COI es una estructura y es muy relevante puesto que las áreas de la actividad vascular mienten en la proximidad espacial directa. Para la evaluación constante, la exploración retiniana se debe dividir en varias secciones de la imagen rectangular con una distancia coherente al COI. Debe analizarse la retina entera e imágenes numéricamente simétricamente distribución. La retina de pez cebra muestra áreas con densidad alta y baja capilar y una distribución desigual de las secciones de la imagen puede dar lugar a sesgo adicional.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
Figura 12: presentación de ejemplo de parámetros vasculares como lectura de visualización de la vasculatura retiniana. Medición de distancia Punteaduras (doble flecha roja) cerca de la óptica interior del círculo (IOC) (A). Tres puntos de ramificación (círculos rojos) cerca de la IOC (B). Visualización de la vasculatura retiniana de pez cebra con un área ampliada (cuadro rojo) mostrando un vaso despunte (C). Diámetro del vaso medido sobre una cierta distancia (doble flecha blanca) de la arteria central (cruz blanca) (D). Densidad del barco es el porcentaje de área retiniana ocupada por superposición de vasos (líneas rojas diagonales) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para medir la distancia de Punteaduras, es necesario establecer una cierta distancia al COI como estándar (figura 12A, doble flecha blanca) y dibujar una línea horizontal imaginaria (figura 12A, línea blanca horizontal) paralelo al COI. La distancia entre los buques de esta línea suma y promedio aritmético es igual a la distancia de Punteaduras. Puntos de ramificación son contados dentro de cada imagen, cada vez que un buque parte y continuar con más de un lumen vascular desde el punto de origen. Esto también incluye conexiones horizontales entre capilares. Es importante permanecer consistente con el análisis y decidir qué puntos de ramificación para contar y mantener estas reglas durante todo el experimento entero para reducir la variación innecesaria. Brotes vasculares, como se muestra en la figura 12, es otro parámetro que puede ser contado en cada imagen para evaluar la influencia en la vasculatura retiniana. Brotes angiogénicos no siguen la sucesión de arcade-como entre arteria central y COI y foco cerca de la parte externa de la retina. Para evaluar determinados diámetros de vaso, un punto de orientación es siempre necesario que una distancia fija marca la medición spot. Origen de la arteria central dentro de la retina proporciona dicha orientación para los vasos del tallo principal (figura 12D, blanca Cruz). El área ocupada por los vasos (figura 12E, líneas diagonales rojas) como un porcentaje del área entera retiniano es la densidad vascular e indirectamente se corresponde con la zona avascular.
Una completa exploración confocal de una muestra debe estar compuesto por varias imágenes de alto detalle para permitir una visualización de pequeñas hypersprouting capilar. Para optimizar tiempo y recursos gastados en este paso, puede usarse un procedimiento automatizado de labranza con una profundidad de exploración general para cada azulejo. Montaje de la retina puede aumentar considerablemente el tiempo empleado para la exploración de la vasculatura con un microscopio confocal. En un enfoque óptimo uno quisiera sólo escanear la capa vascular (figura 13B, caja blanca), pero la inclusión parcial de la GCL es a menudo necesario.Dejando un exceso de longitud del nervio óptico después de truncamiento, así como los cortes para lograr el montaje plano siendo demasiado corto, puede llevar a montaje.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
Figura 13: comparación de la coloración y autofluorescencia en la retina de pez cebra adulto. Vasculatura retiniana en foco por encima de la GCL (A). Vasculatura retiniana (caja blanca) mostrando verde una señal EGFP y capas retinianas exhibiendo fuerte autofluorescencia (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como la preparación adecuada de la vasculatura retiniana del pez cebra necesita formación previa, una muestra de tamaño pequeño con disectores no entrenadas y fuertemente que varía los resultados de preparación son una limitación principal de la técnica. Mientras que la preparación de ojos de pez cebra de tg(fli:EGFP) da una visión rápida del estado de la vasculatura, la técnica utiliza todavía alrededor de 20 minutos de tiempo de trabajo por la retina para un investigador experimentado. Todos estos pasos de preparación de la vasculatura retiniana deben realizarse con un microscopio de disección y disectores necesidad de mantenerse concentrado todo el tiempo como un paso descuidado potencialmente puede inducir la rotura del recipiente. El disector debe practicar regularmente como ausencia prolongado de preparación reduce la probabilidad de un disector de mantener la integridad del buque.
Además, lectura adicional mediante inmunohistoquímica (IHQ) es aún limitado, como sólo un pequeño número de anticuerpos validado en tejido humano y roedor está trabajando con el pez cebra. Experimentadores de IHC se recomienda buscar anticuerpos específicos de pez cebra, especialmente cuando se trabaja con nuevos objetivos. Como alternativa, se recomienda utilizar líneas de reportero de pez cebra adicionales que son útiles para el estudio de células más allá de la vasculatura en el ojo. Esta estrategia, sin embargo, es lento, que tarda unos meses para generar líneas de pez cebra adulto que llevan varios reporteros transgénicos.
Sin embargo, el pez cebra presenta una gama única de ventajas. Son relativamente pequeños y reproducir fácilmente. Pueden crecer rápidamente a etapas adultas y sus embriones son óptimas para la detección de drogas. El campo está creciendo rápidamente y más literatura resulta accesible. Con la capacidad para generar nocauts del gene en una velocidad rápida y una abundancia de líneas de reportero de fluorescencia de transgenes, la elección de pez cebra sólo es refrenada por la pregunta de investigación solicitadas.

La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica definida por hiperglucemia, resultante de la secreción de insulina disfuncional o tejido inadecuada respuesta a la insulina secretada. La OMS estima que vivían 422 millones de adultos con diabetes mellitus en 20141 y la prevalencia de diabetes en todo el mundo se espera aumentar a 8-10% de la población hasta 20352, diabetes uno de los campos de investigación clave en el próximas décadas. Vivir con la hiperglucemia crónica conduce a complicaciones microvasculares a largo plazo, incluyendo polineuropatía, la nefropatía y la retinopatía diabética. La gestión y prevención de estas complicaciones son difíciles; de hecho, la diabetes se está convirtiendo en la causa más frecuente de enfermedad renal de fase final (ESRD), que conduce a diálisis2, y la diabetes es la principal causa de ceguera entre adultos de mediana edad3.
Las causas iniciales del daño microvascular en la retinopatía diabética están la hiperglucemia crónica, alteraciones metabólicas, así como ciertos factores de riesgo (p. ej., hipertensión, dislipidemia), conduce a la disfunción endotelial vascular, pericyte deserción, y regresión capilar que resulta en mangas vasculares acelulares. La resultante de la isquemia retiniana es la causa de la neovascularización y aumento de la permeabilidad vascular promoviendo el desarrollo de la retinopatía diabética proliferativa (PDR)4. La retinopatía diabética generalmente se detectó en 37% de los pacientes con diabetes, mientras que avistar-que amenaza la retinopatía diabética fue comprobada en el 12% de la cohorte Europea blanca seleccionado en el estudio UKADS5. El tratamiento actual sólo puede prevenir otras complicaciones y no es capaz de restaurar completamente los daños ya inducido. Photocoagulation del panretinal, además de control de la glucemia, es la terapia estándar para la retinopatía diabética proliferativa (PDR) pero afecta a los tejidos sanos adyacentes también. Intervenciones anti-VEGF muestran resultados prometedores como alternativas al tratamiento de láser6,7, pero en última instancia, terapia especializada, dirigida y nuevos medicamentos son necesarios para gestionar el creciente número de pacientes con riesgo de pérdida de la visión.
Los modelos establecidos de investigación animal de la retinopatía diabética no comparten todos los aspectos de Fisiopatología humana. Utilización de la especie correcta para abordar las necesidades específicas de la cuestión de la investigación científica es una de las partes más importantes de la instalación experimental. El embrión de pez cebra (Danio rerio) es ya ampliamente utilizado en la investigación del desarrollo y proporciona un fondo práctico óptimo a genes específicos de precipitación o knockout morfolinos o el CRISPR/Cas9 técnica8. Estos métodos pueden ser utilizados fácilmente en pez cebra para investigar los genes, que fueron identificados por estudios de asociación del genoma a gran escala (GWAS), generando ideas en particular mecanismos de progresión de la enfermedad y susceptibilidad9. Corto tiempo generacional, grandes cantidades de crías, fácil y bajo costo manejo y cultivo de apoyo de análisis han aumentado la relevancia del modelo de pez cebra, especialmente teniendo en cuenta su gran potencial para el modelado de enfermedad metabólica. Conservación de los mecanismos biológicos en el pez cebra se ha mostrado como una base para el desarrollo de la terapia farmacológica. Por ejemplo, el antidiabético metformina y bajar el colesterol simvastatina han demostrado para "tratar" las condiciones en los modelos de campo/dexametasona-inducida alta PEPCK expresión y colesterol hipercolesterolemia inducida por dieta10 , 11 , 12. esta penetración avanza en general conservados mecanismos metabólicos es apoyada por el creciente número de modelos de diabetes de pez cebra, mediante experimentos tales como: alternando incubación en soluciones de glucosa, Inducida ablación de las células beta, células beta mediada por nitroreductase con el metronidazol prodrug, mediada a través de la caída en gen pdx1 o nocaut, así como modelos de resistencia creciente de la insulina en músculo esquelético de la diabetes monogénica 12. estos ya establecieron los protocolos, las características mencionadas de la especie, y la habilidad de manipular eficientemente el genoma en un gran número de muestras todos demuestran las ventajas del pez cebra para el estudio de los mecanismos conducir procesos de enfermedad compleja, así como la capacidad para detectar intervenciones farmacológicas.
Una comprensión general de la anatomía de ojo de pez cebra básicos (figura 1) es necesaria para el disector para utilizar el pez cebra como modelo de Angiopatía retiniana. El ojo de pez cebra tiene seis músculos extraoculares, cuatro rectos y dos músculos oblicuos que inserten en el exterior del globo en la esclera13. La córnea es el tejido transparente que cubre el lente y sigue directamente en la esclerótica, que forma la capa exterior del ojo. La esclerótica no es transparente, tiene una superficie que refleja parcialmente la luz y es fuertemente pigmentada. La lente sí mismo está más en forma de bola que la contraparte humana. La retina consta de tres capas nucleares de las células neuronales, mientras que la vasculatura retiniana proporcionando oxígeno está estrechamente relacionada con la capa de células ganglionares interno pero no forma una red subretinal. Los vasos coroides, en cambio, se encuentran entre la esclerótica y la retina y están asociados con el epitelio pigmentado retiniano (RPE). Esta red suministra oxígeno a las partes exteriores de la retina14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
Figura 1: representación esquemática del ojo de pez cebra adulto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Visualización directa de la vasculatura retiniana se logra por la utilización del pez cebra transgénico tg(fli:EGFP) línea15. La proteína verde fluorescente, expresada bajo el control del fli promotor en células endoteliales de la vasculatura es la base para la visualización mediante un microscopio en los pasos posteriores de escaneo láser. Esto se logra a través de la disección de la retina de pez cebra y montaje de la totalidad del tejido. Este modelo transgénico proporciona una lectura rápida vascular sin ninguna aplicación de etiquetado intravascular o immunohistochemistry del montaje en conjunto. Para analizar la retinopatía diabética en el pez cebra, se recomienda una rutina de preparación paso a paso y estandarizada por cada disector.El siguiente protocolo de preparación permite a otros grupos de investigación para evaluar fácilmente los cambios vasculares en los vasos expuestos del ojo del pez cebra adulto y proporcionar orientación para establecer una rutina de disección optimizado para la retina de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3 KCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato de dihidrógeno</td><td>Roth</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS-222, tricaína)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo-Fischer</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Greiner Bio one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de seis pocillos</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Aguja</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pinza</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Tijera de microdisección</td><td>World Precision Instruments 501778</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Carl Roth</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip 22mmx22mm</td><td>neoLab</td><td></td><td></td>103512222</tr><tr><td>Bisturí</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Iluminación</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia MZ10 F</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal SP5 DS</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico M80</td><td>Leica</td><td>NA</td> Línea de pez cebra Leica NA <td></td></tr><tr><td>: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td><td>NA</td><td>NA ver</td><td>Referencia 15</td></tr><tr><td>Mayer' s hematoxilina</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0.5% eosina</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9% etanol</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Merck</td><td>1.071.501.000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

estudiar la diabetes a través de los ojos de un pez: microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:egfp)

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera entre adultos de mediana edad. La creciente prevalencia de diabetes en todo el mundo hará la prevención de complicaciones microvasculares de la diabetes uno de los campos de investigación clave de las próximas décadas. Terapia especializada, específica y nuevos medicamentos son necesarios para gestionar el creciente número de pacientes con riesgo de pérdida de la visión. El pez cebra es un animal modelo establecido para las preguntas de investigación del desarrollo con el aumento de relevancia para el modelado de procesos de enfermedad metabólica multifactorial. Las ventajas de las especies permiten una visualización óptima y enfoques, combinados con la fuerte capacidad de noquear a genes de interés de la detección de drogas de alto rendimiento. Aquí, describimos un protocolo que permita la fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis, daños a la embarcación. Esto se logra a través de la disección de la retina de pez cebra y montaje de la totalidad del tejido. Visualización de los vasos expuestos se obtiene entonces mediante microscopia confocal de la reportera EGFP verde expresada en la vasculatura retiniana adultos. Manejo correcto del tejido llevará a mejores resultados y menos rotura de vasos internos para asegurar la visualización de la estructura vascular inalterada. El método puede ser utilizado en modelos de pez cebra de la vasculopatía retiniana ligado a cambios en la arquitectura del buque así como la neoangiogénesis.

Aquí muestran dos ejemplos morfológicos típicos de la vasculatura retiniana en el pez cebra adulto tg(fli:EGFP): una vez visualizado con el microscopio de fluorescencia (Figura 9A) y una vez con un láser confocal de barrido microscopio (figura 9B). La estructura retiniana revelada muestra un patrón altamente organizado. Autofluorescencia fuerte se ve en la retina de pez cebra, cuando es visualizado con el microscopio de fluorescencia. Así, se recomienda una visualización de sólo la capa vascular a través de una exploración confocal para reducir la fluorescencia del fondo y aumentar el contraste. Para la más rápida adquisición de la imagen o situaciones donde los datos cualitativos son bastantes, el microscopio de fluorescencia es una alternativa atractiva.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
Figura 9: cuadros representativos de la vasculatura retiniana de pez cebra adulto tg(fli:EGFP). Se muestran dos ejemplos morfológicos típicos de la vasculatura retiniana: la arteria central de la óptica se separa en 5-7 principales vasos, que luego se ramifican en una sucesión de arcadas. Todos los buques más drenan en la vena periférica (CV) limita la parte exterior de cada pétalo. Visualización mediante microscopía de fluorescencia en 2.5 x de aumento (A). Visualización de la vasculatura retiniana por láser confocal de barrido microscopía a través de un análisis combinado de azulejo imagen de 5 x 5 (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La arteria óptica penetra la retina en la papila óptica y, en la mayoría de las muestras, se separa en 5-7 vasos principales (figura 10A). Los vasos principales entonces rama en una sucesión de arcadas y conecta al óptico círculo interno (COI), también llamado la vena periférica (CV), rodea el disco óptico en la periferia de la retina montada plana (ver figura 10B). El COI es el vaso venoso que drena la sangre arterial en el borde interno del globo ocular (bulbus oculi). La vasculatura retiniana de pez cebra también muestra las áreas de alta actividad vascular con ramificación de los capilares y angiogénicos brotación (figura 10). Esta actividad vascular se encuentra principalmente en proximidad cercana al COI. Es importante hacer notar que el mismo ojo puede demostrar ambas actividades y vasculares en diferentes regiones de la retina (Comparar figura 10B y figura 10). En general, la vasculatura retiniana del pez cebra muestra más espacio avascular y menos capilares entre las ramas principales con respecto a, por ejemplo, la retina de ratones17. Ambos ojos de cada muestra deben ser analizadas ya la vasculatura puede variar entre inspección singular puede dar lugar a sesgo.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
Figura 10: amplifica las zonas de visualización de la vasculatura retiniana pez cebra adulto tg(fli:EGFP). La arteria óptica ramificación en los vasos principales (A). Capilares de la retina en una zona de baja actividad vascular conexión al círculo interno de óptico (COI) en la parte inferior de la imagen (B). Capilares de la retina en una zona de alta actividad vascular que conecta a la IOC (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Una arquitectura altamente conservadas de capas neuronales ya está presente en el pez cebra de aproximadamente 72 h post fertilización (hpf),18. La retina de pez cebra adulto muestra las siguientes capas de adentro hacia afuera (figura 11): capa de células ganglionares (GCL), la capa plexiforme interna (IPL), la capa nuclear interna (INL), la capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear externa (ONL), capa de fotorreceptores (PL), y el epitelio pigmentado retiniano (RPE). La estimación de los parámetros de visualización de la vasculatura retiniana vasculares se muestra en la figura 12. La vasculatura retiniana interna está situada en la capa de células ganglionares (GCL) (figura 13B, caja blanca) mientras la coroides capilares estaría asociados con el epitelio pigmentado retiniano (RPE).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
Figura 11: la coloración del pez cebra adulto ojo. Resumen transversal del ojo entero después del retiro de la lente (A). Capas de retinales de pez cebra adulto ojo19 (B). Indicación (flecha negra) del natural punto de ruptura en la PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, discutimos un protocolo de método que permita un fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis y cambios estructurales.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

El objetivo general de este protocolo de disección para la vasculatura de la retina del pez cebra adulto es proporcionar una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo relacionadas con la neoangiogénesis y los cambios estructurales mediante fluorescencia o microscopía confocal de barrido láser. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las complicaciones microvasculares, como el desarrollo de la retinopatía diabética. La principal ventaja de esta técnica es que toda la retinovasculatura puede ser presentada y analizada en procesos fisiológicos y patológicos sin necesidad de aplicar fluorescencia intervascular de una manera relativamente rápida y estandarizada.Para comenzar, transfiera seis mililitros de solución de PFA PBS al cuatro por ciento recién preparada por muestra a los pocillos de las placas de seis pocillos. Después de sacrificar al pez cebra adulto de acuerdo con el protocolo de texto, colóquelo sobre toallas de papel limpias y séquelo. Usa un bisturí y corta las cabezas detrás del opérculo.A continuación, transfiera las cabezas directamente a los pocillos de fijador recién preparado. Guarde las placas que contienen las cabezas de pescado a cuatro grados centígrados durante al menos 24 horas para asegurarse de que el fijador penetre en las capas más profundas de la retina. Con agarosa caliente al dos por ciento, llene una placa de Petri hasta un tercio y espere hasta que el agar esté firme.Cubra la placa de agar con un X PBS para crear un espacio de trabajo para diseccionar los ojos. Transfiera la muestra fija a la placa de Petri. Y sosteniendo la cabeza en la superficie de corte con una pinza, inserte otra pinza unida con alfileres debajo del globo ocular en la cavidad orbital.Abra lentamente la pinza por debajo del ojo y sujete el nervio óptico. A continuación, rasgue y desprenda el ojo con cuidado. Para extirpar cualquiera de los cuatro músculos rectos y los dos músculos extraoculares oblicuos conectados al ojo, así como el tejido extraocular residual que conecta el ojo con la cavidad orbitaria, sostenga el ojo a través de una pinza medio cerrada y, agarrando la estructura con la otra pinza, use un movimiento diametral para arrancarlo suavemente.A continuación, utilice una aguja desechable de calibre 27 para perforar la córnea en el rango exterior. A través de esta abertura, use ambas pinzas para sujetar la córnea y abrirla ligeramente. A continuación, trabaja con cuidado para crear un desgarro centrado del tamaño de la pupila respectiva.Aplique presión en el lado de la córnea del globo ocular en el borde externo de la córnea por encima del iris. Esto creará una pequeña abolladura y empujará el cristalino a la altura del desgarro corneal. A continuación, pasa las pinzas por debajo de la lente y retírala.A continuación, gire el ojo boca abajo con el nervio óptico hacia arriba. Tenga en cuenta que la esclerótica y la córnea están conectadas y forman la túnica fibrosa del bulbo ocular para proteger la retina en forma de copa. Esta cáscara, conocida como córnea, protege el área alrededor del nervio óptico.Inserte una aguja en esta interrupción para crear una abertura entre la esclerótica y la retina. Luego, usando este acceso con ambas pinzas, corte con cuidado la esclerótica axialmente en tiras para aumentar la apertura alrededor del nervio óptico. Tenga cuidado de mantener la córnea intacta en la transición a la circunferencia del lado de la córnea.Antes de extraer la córnea del tejido intraocular restante, intente cortar cualquier conexión, ya que la unión a otras estructuras será un punto crítico. A continuación, sujete la esclerótica con una pinza y, agarrando el nervio óptico con la otra y tirando de ella, retire completamente la esclerótica del ojo y deséchela. Este paso proporcionará una estructura en forma de copa que consiste en la úvea y la retina que contiene la vasculatura de la retina.A continuación, crea una ruptura en la capa coroidea y RPE sosteniendo una aguja de calibre 27 de lado con la copa restante mientras raspas la superficie exterior con el borde de la punta de la aguja. Use la ruptura como punto de acceso para agarrar la capa coroidea y RPE y use ambas pinzas para rasgarla en rayas, manteniendo intacta la conexión con el iris. A continuación, pase una pinza por debajo del iris y muévala en un circuito desde el exterior mientras crea tensión tirando de la capa coroidal y RPE discontinuada y separe la estructura combinada.Si partes del iris no se pueden extirpar y permanecen conectadas a la retina en forma de copa después de la eliminación de la capa coroidea y del EPR, utilice otro punto de ruptura natural que el ojo del pez cebra adulto exhibe dentro de la capa fotorreceptora. De manera similar se acaba de demostrar que se elimina el iris. Raspe la retina en forma de copa restante para inducir interrupciones en la capa de fotorreceptores.A continuación, utilice el acceso creado para eliminar la capa manteniendo intacta la posible conexión con el iris. Luego, pase las pinzas por debajo del iris y continúe en un circuito como se demostró anteriormente en este video para separar la estructura combinada. Es crucial desconectar el iris de su tejido subyacente de una manera sensata, ya que bloqueará la fluorescencia directamente sobre el círculo óptico interno durante la visualización de los vasos.Un enfoque demasiado directo puede provocar la rotura de un vaso. A continuación, utilice unas tijeras de resorte de microdisección con un filo recto de dos puntos y cinco milímetros para cortar el nervio óptico lo más cerca posible de la retina. Esto permitirá un mejor montaje plano del tejido.Para montar y visualizar la vasculatura de la retina, use un X PBS para lavar la retina disecada dos veces durante cinco minutos cada una. Coloque una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio. Luego, con una espátula de laboratorio con un extremo de microcuchara, transfiera la retina a la gota.Con una pinza, mantenga el tejido en su lugar mientras usa un bisturí para cortar la estructura en forma de copa para crear una forma plana de cuatro o cinco pétalos, según el tamaño de la retina. Con un pedazo de papel fino, aspire el PBS sobrante, teniendo cuidado de no tocar la retina. A continuación, recubra la retina de montaje plano con un medio de montaje y cúbrala con el cubreobjetos.Tenga cuidado de no crear espuma, ya que las burbujas de aire pueden distorsionar la visualización de los vasos de la retina. Usa esmalte de uñas para sellar la cubierta. Por último, realizar microscopía de fluorescencia o láser de barrido para visualizar la vasculatura de la retina.Aquí se muestra un ejemplo morfológico de la vasculatura de la retina en un pez cebra EGFP de mosca transgénica adulta visualizado con un microscopio de fluorescencia y un segundo ejemplo fotografiado con un microscopio de barrido láser confocal que reduce la fluorescencia de fondo. La estructura retiniana revelada muestra un patrón altamente organizado. La arteria óptica penetra en la retina en la cabeza del nervio óptico y, en la mayoría de las muestras, se distribuye en cinco a siete vasos principales.Luego, los vasos principales se ramifican en una sucesión de arcadas y se conectan al círculo óptico interno o IOC, también llamado vena circunferencial, que rodea el disco óptico en la periferia de la retina montada en plano. La retina del pez cebra adulto está compuesta por las siguientes capas de adentro hacia afuera. La capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa nuclear externa, la capa fotorreceptora y el epitelio pigmentado de la retina.Aquí se muestra la estimación de los parámetros de la vasculatura a partir de la visualización de la vasculatura de la retina. La vasculatura interna de la retina está situada en la capa de células ganglionares, mientras que los capilares cordiales estarían asociados con el epitelio pigmentado de la retina. Una vez entrenada, esta técnica se puede realizar en menos de 20 minutos si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar practicar con regularidad, ya que la ausencia prolongada de la preparación reduce el resultado de la integridad de la embarcación. Siguiendo este procedimiento, se pueden analizar la diabetes y las patologías neurovasculares en el pez cebra adulto.

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Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

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