Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

El objetivo general de estos experimentos es determinar los efectos de los fármacos basados en anticuerpos sobre los estados de activación de macrófagos antiinflamatorios utilizando médula ósea de ratón y macrófagos peritoneales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo, si los fármacos específicos de anticuerpos actúan cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatoria que produce IL-10. La principal ventaja de esta técnica, es que mide la respuesta de los macrófagos primarios de ratón de la médula ósea in vitro y de la cavidad peritoneal in vivo.

Realice este procedimiento en una capucha estéril. Asegure a un ratón sacrificado en decúbito supino sobre una tabla de espuma con las extremidades extendidas. A continuación, limpie las patas con etanol al 70%.

A continuación, haz un corte poco profundo de unos dos milímetros de profundidad para quitar la piel y el pelaje de la superficie de cada pata trasera. Luego, disecciona los tejidos para acceder a las tibias y los fémures. Para extirpar las tibias y los fémures, corte el hueso y los músculos justo debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos.

Luego, retira la mayor cantidad posible de tejido muscular de los huesos. A continuación, limpie los huesos con etanol al 70% y deje que se evapore durante un minuto. Luego, coloque los huesos en un plato de seis pocillos lleno de hueso medio de pulpa.

En la placa, recorte un milímetro de cada extremo de los fémures para que sus cavidades internas queden expuestas. Asegúrese de que una aguja de calibre 26 pueda acceder a las cavidades. A continuación, separe la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla.

Luego, inserte la aguja conectada a una jeringa de 10 mililitros en una cavidad ósea y recoja la médula ósea. Extrae la médula ósea de los cuatro huesos y colócala en un tubo cónico de 50 mililitros con cinco mililitros de medio de carne ósea. Pipa el medio y la médula hacia arriba y hacia abajo varias veces.

O vórtice a baja velocidad para dispersar suavemente los grumos en la suspensión. Los hilos de médula deben dividirse en pequeñas motas de médula de menos de medio milímetro de largo. A continuación, rellene el tubo a 50 mililitros con medio de pulpa ósea y transfiéralo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados.

Incuba la médula ósea durante una hora. Durante la incubación, las células maduras se adherirán al matraz y los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros y gire las celdas hasta convertirlas en un pellet.

A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en cinco mililitros de medio de cultivo MCSF. A continuación, ajuste la densidad de la celda a 500.000 por mililitro y cargue 30 mililitros en un nuevo matraz de 75 centímetros cuadrados. Continúe cultivando las células y, en los días cuatro, siete y 10, verifique que las células estén adheridas y ligeramente ramificadas utilizando un microscopio de campo de ruptura de contraste de fase invertida.

Al revisar las células, deseche el medio que contiene las células no adherentes. A continuación, lave las células adherentes con IMDM una vez y añada 30 mililitros de medio de cultivo MCSF fresco de nuevo en el matraz. El día 10, reemplace el medio con ocho mililitros de tampón de disociación celular basado en EDTA sin enzimas para recolectar las células.

Incuba las células brevemente, luego raspa las células suavemente y verifica que se hayan liberado con un microscopio. Una vez que se liberan las células, transfiera el tampón con las células a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, enjuague el matraz tres veces con cinco mililitros de IMDM para recoger más células.

Extraer todas las colecciones, centrifugarlas y volver a suspender el pellet en tres mililitros de MCSF. Ahora, cuenta las células y ajusta su concentración a un millón por mililitro. A continuación, coloque 100 microlitros de suspensión celular por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos.

Todo el plato debe ser rellenable . Cultive las células durante aproximadamente una hora hasta que estén adheridas. A continuación, estimulícelos con diferentes concentraciones de LPS o inmunoglobulina intravenosa o ambas preparadas en IMDM.

Realice todas las manipulaciones por duplicado o triplicado y asegúrese de mantener los controles sin tratar. A continuación, incubar las células durante 24 horas y analizar los sobrenatantes. Prepare una jeringa de un mililitro con la cantidad requerida de inmunoglobulina intravenosa y LPS, y coloque una aguja de calibre 26.

Para los controles, use PBS más LPS en su lugar. Agarra al ratón por el pescuezo mientras aseguras sus cuartos traseros y su cola con una mano. Apunte al cuadrante inferior derecho del abdomen e inserte la aguja en un ángulo de 30 a 40 grados con el bisel hacia arriba, e insértela aproximadamente 1,5 centímetros.

A continuación, inyecte el bolo. Después de una hora, recoja los macrófagos peritoneales después de sacrificar al ratón. En una capucha estéril, sujete al ratón sacrificado a una tabla de espuma con las extremidades extendidas y esterilice el abdomen con etanol al 70%.

Luego, haz una incisión poco profunda de dos milímetros a lo largo de la línea media y retira la piel abdominal. Evite perforar la pared peritoneal. A continuación, cargue completamente una jeringa de cinco mililitros con PBS estéril a pH 7,4 e inyecte el ratón con una aguja de calibre 25 o 27, en la parte superior de la cavidad peritoneal, desde cualquier lado, hacia la línea media, con el bisel de la aguja hacia arriba.

Después de sacar la aguja, masajee el peritoneo durante 10 segundos para desalojar las células. Ahora, inserte la aguja nuevamente, nuevamente en la cavidad, y recoja aproximadamente 3,75 mililitros de líquido de lavado. Transfiera el líquido de lavado a un tubo cónico de 15 mililitros con hielo.

Repita la inyección, el masaje y la recolección del líquido de lavado tres veces más, y coloque todas las colecciones en el mismo tubo. Durante la recolección final, puede ser más fácil extraer el líquido de lavado del lado más alejado del ratón. A continuación, gire las células y vuelva a suspenderlas en 500 microlitros de medio de siembra.

A continuación, cuente los macrófagos viables y vuelva a suspenderlos a un millón por mililitro. Ahora, coloque 100 microlitros de suspensión en los pozos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, incuba las células durante una hora.

Los macrófagos peritoneales se adherirán a la placa. A continuación, retire las células no adherentes y enjuague cada pocillo dos veces con 200 microlitros de IMDM tibio. Después de cada lavado, espere 10 segundos e incline lentamente la placa para extraer la solución de enjuague.

Después de los lavados, vuelva a agregar 100 microlitros de medio de enchapado y coloque la placa en la incubadora. Para el ELISA, continúe incubando las células sin estimulación durante 24 horas. A continuación, recoja y clarifique el medio condicionado para el análisis de citocinas.

Los BMDM se pueden utilizar para probar las respuestas a los fármacos basados en anticuerpos cuando se enfrentan a un estímulo inflamatorio in vitro. La inmunoglobulina intravenosa con LPS aumenta siete veces la producción de la citocina antiinflamatoria IL-10 en comparación con la estimulación con LPS sola. Y disminuye la producción de IL-12/23p40.

Además, la estimulación intravenosa de inmunoglobulinas sola o con LPS aumentó la activación de la quinasa MAP ERK1/2, con fosforilación temprana y prolongada. La activación del P-38 también se produjo antes. Además, los macrófagos peritoneales aumentaron significativamente la producción de IL-10 con la estimulación in vitro, en comparación con los ratones inyectados con PBS.

A continuación, se evaluó la producción de citocinas en el líquido de lavado y en sobrenadantes de macrófagos peritoneales estimulados ex vivo. La IL-10 aumentó en el líquido de lavado, las células peritoneales y los macrófagos peritoneales cuando los ratones fueron desafiados con inmunoglobulina intravenosa y LPS. En comparación, la producción de la subunidad de citocinas proinflamatorias IL-12/23p40 se redujo significativamente en los macrófagos peritoneales cultivados, pero no en el líquido de lavado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar los efectos de los medicamentos basados en anticuerpos en los estados de activación de macrófagos in vitro e in vivo utilizando médula ósea de ratón y macrófagos peritoneales.