Name: Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a evaluar la activación antiinflamatoria de macrófagos en médula ósea y peritoneo de ratón mediante drogas basadas en anticuerpos. Este protocolo permite medir respuestas in vitro e in vivo.

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L.K. es el recipiente de la concesión de beca posgrado beca de 4 años (4YF) Universidad de British Columbia. L.M.S. es el destinatario de una Asociación canadiense de Gastroenterología / de Crohn y de Colitis de Canadá / Premio CIHR nuevo salario del investigador y es un erudito Biomédica de la Fundación de Michael Smith para la investigación en salud. Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto de Canadian Blood Services, en colaboración con los institutos de salud de investigación de Canadá (concesión # CIHR2016-LS).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de British Columbia.
1. médula ósea macrófagos derivación y activación con anticuerpos
<ol>
	<li>Realizar la eutanasia usando CO2 asfixia.<ol>
		<li>Ratón de lugar en cámara de inducción. Eutanasia a ratón con anestesia isoflurano de 5%, para 60-90 s, hasta que inmóviles y la respiración profunda y lenta.</li>
		<li>Apague la anestesia isoflurano y administrar 6-8 L/min de CO2 hasta que el ratón ha dejado de respirar. Dejar ratón con CO2 al menos otros 5 minutos Verifique que ya no es un latido cardíaco o respiración. Realizar una dislocación cervical para asegurar la muerte. Nota: 8-12 semanas viejos ratones proporcionan el mayor rendimiento de los macrófagos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spray patas de ratón con etanol al 70% y el pin con brazos y piernas estiradas en la posición supina sobre un tablero de la espuma. Con tijeras y pinzas para sujetar la piel, hacer un corte poco profundo (0,2 cm) para quitar la piel y el pelaje de la superficie de cada una de las patas traseras. Nota: Realice este procedimiento y todas las manipulaciones de cultivo de tejidos en una campana estéril.</li>
	<li>Recorte muscular para visibilizar tibias y fémures. Quite la tibia y el fémur, cortando el hueso y los músculos debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos. Recorte tanto músculo como sea posible.</li>
	<li>Pulverizar los huesos con etanol al 70% y espere 1 minuto para que se evapore, luego colocarlos en placa 6 bien de medio al ras del hueso (Iscove modificado medio de Dulbecco (IMDM), 10% suero bovino fetal (FBS)).</li>
	<li>Recorte los extremos de los huesos mediante la reducción de 0,1 cm de hueso del tobillo y parte superior del fémur por lo que se expone la cavidad ósea. Asegúrese de que la médula es visible y se puede colocar una aguja de 26 calibre en la cavidad del hueso.</li>
	<li>Cortar los huesos y músculos para separar la tibias y fémures de los empalmes de rodilla. Inserte una aguja 26 calibre unida a una jeringa de 10 mL en la cavidad. Enjuague la médula ósea en un tubo cónico de 50 mL con 5 mL de medio al ras del hueso. Ras dos tibias y dos fémures, desde un ratón, en cada tubo de 50 mL.</li>
	<li>Pipetear arriba y abajo varias veces o vórtice la médula a una velocidad lenta para dispersar a grupos suavemente. Cadenas de médula deben dividirse en manchas pequeñas (menos de 0,5 mm) de médula ósea. Llene el tubo cónico de 50 mL con medio al ras del hueso. Contenido de la pipeta del tubo cónico en un cultivo de tejidos2 75 cm tratado frasco e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 1 h. Nota: Los macrófagos maduros y las células mesenquimales se convertirá en adherentes al matraz y descartarse, mientras que los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión.</li>
	<li>Pipetear el soporte con progenitores hematopoyéticos en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min., descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo factor (MCSF) el estimular de Colonia de macrófagos (IMDM, 10% FBS, MCSF de 5 ng/mL, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 150 μM Monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro18. Añadir medio para resuspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/mL, 1,5 x 107 células/frasco de 30 mL de medio y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo. Pipeta de 30 mL de la suspensión a un matraz de cultivo de tejidos tratado nueva de 75 cm2 .</li>
	<li>El día 4 y día 7 después de la primera cultura en el paso 1.9, comprobar que las células son adherentes y ligeramente ramificado usando un microscopio de campo brillante de contraste de fase invertida. Descartar el medio que contiene las células no adherentes. Lavar las células con IMDM una vez y añadir 30 mL de medio de cultivo MCSF.</li>
	<li>Cuando las células son maduras por día 10 (&#62; 95% positivo para F4/80 y Mac-1), compruebe otra vez que las células son adherentes y ligeramente.</li>
	<li>Células por estímulos de la placa, retirar el medio de cultivo del frasco y añadir 8 mL de buffer de enzima libre, basada en EDTA células disociación (Tabla de materiales). Incube las células durante 5 min a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Raspar las células suavemente, con una pequeña cantidad de presión, usando un raspador celular estéril. Comprobar en el microscopio que las células han separado de la superficie del frasco. Pipetear las células disociadas en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el matraz 3 veces con 5 mL de IMDM y la solución de enjuague con las células que se cosecharon de la piscina. Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 3 mL de medio de cultivo MCSF por el tubo cónico de 50 mL. Contar las células viables usando un hemocitómetro18. Resuspender las células a una concentración de 1 x 106 células/mL y la placa de 100 μL de suspensión celular (1 x 105 células/pocillo) por pozo de una cultura de tejido de 96 pocillos tratada, placa de fondo plano. Nota: Los huesos de un ratón va a generar suficientes células para pozos de 100. Si lo desea, 1 mL de células puede ser plateado en una placa de 6 pozos (cultivo de tejidos tratados, plano abajo). Un mayor número de células (1 x 106 células) puede ser útil para los análisis de western blot.</li>
	<li>Una vez adheridas, estimular el duplicado o triplicado pozos cada uno con 10 ng/mL de LPS en IMDM, 30 mg/mL de inmunoglobulina intravenosa, o IgIV + LPS. Dosis de LPS o IgIV pueden titularse para optimizar las respuestas. Deje duplicados o triplicados pozos controles sin estimular. Incúbelos durante 24 h (37 ° C, 5% CO2). Nota: Las células re-plateadas deben adherirse a pocillos de cultivo de tejidos en 1 h.</li>
	<li>Recoger sobrenadante de células de cada pozo en tubos de microcentrífuga de 1,7 mL individual y quitar cualquier materia particulada por giro a 10.000 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Retire el sobrenadante de la célula y evitar perturbar el sedimento. Lugar la célula clarificada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga estéril. Nota: Sobrenadantes celulares pueden ensayarse para citoquinas IL-10 y subunidad de la citoquina IL-12 / 23p 40, por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) inmediatamente, o almacenados a-80 ° C a largo plazo. Seguir protocolo de ELISA kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Otras citoquinas proinflamatorias pueden ensayarse, tales como IL-6 y TNF, como también son reducidas por co tratamiento con IgIV + estimulación LPS en comparación con la estimulación con LPS solo. Después de la estimulación, las células adherentes se pueden preparar para técnicas como western blot o polimerasa cuantitativa (Q-PCR) reacción en cadena 19,20.</li>
</ol>
2. un reto ratones In Vivo con la IgIV y la cosecha de los macrófagos peritoneales
<ol>
	<li>Peso de cada ratón.</li></ol>Calcular el volumen de la IgIV (concentración stock de 100 mg/mL) necesaria para proporcionar una dosis final de 2,5 g/kg de peso corporal para cada ratón. Nota: por ejemplo, para un ratón de 20 g, 500 μl de inmunoglobulina intravenosa se requiere.
	<li>Sorteo la cantidad necesaria de IVIg en una jeringa estéril de 1 mL provista de un estéril 26 Medidor de aguja. Para los ratones de control que no va a recibir IgIV, administrar un volumen de dosis equivalente de tampón de fosfato estéril salino (PBS), pH 7,4, en vez de IgIV.</li>
	<li>Pescuezo del ratón con una mano agarrando la piel en la nuca con el pulgar y el dedo índice y sostiene su cola y patas traseras con los dedos restantes. Incline su cuerpo hacia el suelo.</li>
	<li>Coloque la aguja formando un ángulo de 30-40° en relación con el abdomen del ratón, en el cuadrante inferior derecho, bisel hacia arriba e inserte 1,5 cm de la aguja. Inyectar por vía intraperitoneal la IVIg o PBS. Esperar 1 h.</li>
	<li>Eutanasia a ratones con 5% isoflurano anestesia seguida de 6-8 L/min CO2 asfixia (ver pasos 1.1.1 - 1.1.2), o de acuerdo con los principios éticos de la institución.</li>
	<li>Pin el ratón a un tablero de la espuma, con los miembros dispersos. Rocíe las piezas con etanol al 70%. Nota: Realice el procedimiento en una campana estéril.</li>
	<li>Hacer un corte superficial en la piel (0,2 cm) con tijeras a lo largo de la línea media del ratón, para evitar el corte de la cavidad peritoneal. Tire de la piel abdominal fuera del vientre del ratón con unas pinzas, para que el revestimiento de la pared peritoneal intacta es visible.</li>
	<li>Llene una jeringa de 5 mL con 5 mL de PBS estéril (pH 7.4). Inserte un 25 o 27 medidor de aguja en la parte superior de la cavidad de la izquierda o derecha hacia el centro del ratón con el bisel de la aguja hacia arriba. Nota: Coloque la aguja cuidadosamente en el ratón para que no inyecte PBS en los órganos, sino más bien, en el espacio peritoneal.</li>
	<li>Introduzca el líquido en la cavidad peritoneal. Saque la aguja de la cavidad y masaje del peritoneo para 10 s para desalojar a las células. Inserte la aguja en la parte superior de la cavidad y evitar órganos. Recoger y colocar el líquido de lavado se recuperó en un tubo cónico de 15 mL en hielo. Nota: Por cada 5 mL de líquido inyectado, aproximadamente 3,75 mL serán recuperado.</li>
	<li>Repetir la inyección y recuperación (pasos 2.8-2.9) 3 más veces (volumen total de inyección de 20 mL), recuperar 15 mL del líquido de lavado en total. Recoger el lavado de cada ratón en un tubo cónico de 15 mL separadas. Nota: Después de la inyección final, puede ser más fácil extraer el líquido de los lados lejos izquierdos y derecho del ratón, donde se ha acumulado líquido. Los órganos causan menos interferencia con la aguja en esta posición.</li>
	<li>Las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 500 μL de medio de galjanoplastia (IMDM, 10% FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina) por lavado del ratón. Recuento viables macrófagos utilizando un hemocitómetro18. Nota: Los macrófagos será ligeramente más grandes que las otras células peritoneales. Rendimiento típico es de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/ratón utilizando un ratón C57BL/6 de tipo salvaje. Opcional: Si hay un gran número de glóbulos rojos en el sedimento celulares, realizar un paso de lisis para eliminarlos, utilizando el tampón de lisis de glóbulos rojos 1 x según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Resuspender las células en placas medio macrófagos 1 x 10 6/ml y 100 μL por pozo en una placa de cultivo de tejidos Tratado de fondo plano de 96 pozos de la placa. Nota: Puede ser necesario piscina células de más de un ratón para un experimento si utiliza triplicadas pozos o valoración de estimulantes. Por ejemplo, si un ratón tiene 5 x 105 macrófagos, 500 μL de medio de galjanoplastia sería necesario. Habría suficientes células para 5 pozos o 1 experimento por duplicado, con una dosis de LPS.</li>
	<li>Incubar 1 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que los macrófagos a convertirse en células adherentes. Las células adherentes son los macrófagos peritoneales. Retire el sobrenadante de células y las células no adherentes. Enjuagar los pozos dos veces con 200 μL IMDM (previamente calentado a 37 ° C), esperar 10 s y lentamente incline la placa. Reemplazar el medio de la galjanoplastia. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2 por 30 min antes de la estimulación.</li>
	<li>Estimular los macrófagos con 10 ng/mL de LPS en IMDM, o dejar sin estimular, como un control. Incubar durante 24 h, recoger y clarificar sobrenadantes de células (ver pasos 1.16 1.17) para IL-10 citoquina análisis mediante ELISA. Seguir protocolo de ELISA kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Nota: Después de la estimulación, las células adherentes se pueden preparar para técnicas como el western blot o PCR.</li>

3. un reto ratones in Vivo con IgIV + LPS y cosecha de los macrófagos peritoneales
<ol>
	<li>Peso de cada ratón. Calcular el volumen de la IgIV (concentración stock de 100 mg/mL) necesaria para proporcionar una dosis final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcular la cantidad de LPS (concentración stock de 100 μg/mL de IMDM) necesaria para proporcionar una dosis final de 0.2 μg/g de peso corporal. Nota: por ejemplo, para un ratón de 20 g, 500 μl de solución stock de IVIg y 40 μL de una solución 100 μg/mL de LPS se requiere.</li>
	<li>Extraer la cantidad necesaria de IVIg y LPS en una jeringa estéril de 1 mL con una estéril 26 Medidor de aguja. Para los ratones de control que no va a recibir IgIV, reemplazar un volumen equivalente de la IgIV con pH de PBS estéril 7.4.</li>
	<li>Pescuezo del ratón con una mano agarrando la piel en la nuca con el pulgar y el dedo índice y sostiene su cola y patas traseras con los dedos restantes. Incline su cuerpo hacia el suelo.</li>
	<li>Coloque la aguja en un ángulo de 30-40° en relación con el abdomen del ratón, en el cuadrante inferior derecho, bisel e introduzca 1,5 cm. inyectar la IVIg LPS, o PBS + LPS, por vía intraperitoneal como en el paso 2.4.</li>
	<li>Después de 1h, cosecha de macrófagos peritoneales mediante pasos 2.5-2.10.</li>
	<li>Las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Retirar 1 mL del líquido de lavado recuperado y utilice para IL-10 y IL-12 / 23p 40 análisis por ELISA según instrucciones del fabricante o congelar a-80 ° C para los análisis futuros. Nota: Para asegurar la comparación precisa entre los tratamientos para el análisis de citoquinas líquido de lavado, realice flushs 5 mL de la cavidad peritoneal 4 veces para un volumen final de 15 mL. No todo el líquido será recuperado de cada descarga.</li>
	<li>Como en el paso 2.11, suspender y contar los macrófagos viables. Nota: Los macrófagos será ligeramente más grandes que las otras células peritoneales.</li></ol>Rendimiento típico es de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/ratón utilizando un ratón C57BL/6 de tipo salvaje. Opcional: Si hay un gran número de glóbulos rojos en el sedimento celulares, realizar un paso de lisis siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminarlos, como en el paso 2.11.
	<li>Como en el paso 2.12, Resuspenda las células en medio de la galjanoplastia. Nota: Puede ser necesario a las células de la piscina de más de un ratón para un experimento. Por ejemplo, si un ratón tiene 5 x 105 macrófagos, 500 μL de medio de galjanoplastia sería necesario.</li>
	<li>Como en 2.13, incubar 1 h a 37 ° C 5% CO2 para permitir que los macrófagos a convertirse en células adherentes.</li>
	<li>Recoger y clarificar el medio condicionado, según medidas 1.14-1.15, de todas las células peritoneales. Nota: Las muestras se pueden usar inmediatamente o congeladas y almacenadas a-80 ° C para el análisis del cytokine por ELISA.</li>
	<li>Realizar paso 2.11, sino incubar las células durante 24 h sin estimular. Recoger y clarificar sobrenadantes de células, según pasos 1.16 1.17, para el análisis del cytokine por ELISA. Nota: Las células se pueden preparar para técnicas como el western blot o PCR, como en pasos 1.16 1.17 y 2.14.</li>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Estados de activación del macrófago juegan un papel importante en tanto tejido homeostasis y enfermedad22. Los macrófagos pueden tener distintas así como superposición de Estados de activación, dependiendo de señales en su microentorno3. Ellos tienen diferentes roles en todas las etapas de la respuesta inflamatoria: defensa contra agentes patógenos, restitución del tejido y cicatrización de la herida, y también tienen un estado de activación antiinflamatorio distinto que es...

Los macrófagos son las células inmunes innatas, que desempeñan múltiples roles en la respuesta inmune a infección o lesión. Los macrófagos son responsables de iniciar una respuesta inmunitaria a la infección o tejido, deteniendo la respuesta inflamatoria y promover la curación de respuesta1. Ejemplos de los tres Estados de activación del macrófago mejor estudiados son: 1) los macrófagos tratados con interferón gamma (IFNγ) y bacteriano lipopolysaccharide (LPS), señalado M (IFNγ + LPS), que contribuyen a la respuesta inflamatoria; 2) macrófagos estimulados con interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), que se asocian con la respuesta de curación; 3) macrófagos estimulados con complejos inmunes (CI) y LPS, M (IC + LPS), que tienen la capacidad para apagar la respuesta inflamatoria2,3. M (IC + LPS) son distinto de los macrófagos de la cicatrización M(IL-4) y no expresan la arginasa (Arg-1) de la enzima o FIZZ14. El mejor marcador para estos macrófagos antiinflamatorios es la producción del cytokine del5. Los macrófagos tienen múltiples funciones en el mantenimiento de la salud, pero también contribuyan a enfermedades inflamatorias y cáncer3. Por esta razón, los macrófagos son una diana terapéutica clave para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. Es importante investigar los efectos de los anticuerpos sobre su estado de activación para desarrollar tratamientos a base de macrófagos para la enfermedad.
El enfoque de este artículo es sobre el uso de macrófagos murinos la médula ósea derivado (BMDMs) y los macrófagos peritoneales para probar el efecto de fármacos de anticuerpos en las respuestas inflamatorias in vitro e in vivo. Recientemente, ha habido varios estudios que demuestran los efectos de anticuerpos macrófago activación6,7,8. Macrófagos activados conjuntamente con complejos inmunes, que son anticuerpos complejados con un antígeno y LPS, un estímulo inflamatorio normalmente, producen niveles muy altos de la citocina antiinflamatoria IL-10 y niveles muy bajos de la citocina proinflamatoria, Interleucina 12 (IL-12)9. Además, infliximab, un anticuerpo monoclonal contra el TNFα, se ha encontrado para trabajar, en parte, mediante la inducción de macrófagos antiinflamatorios a través de su fragmento cristalizable (Fc) región7. Nos han informado que la IgIV + LPS inducen activación de macrófagos antiinflamatorio similar a M (IC + LPS), en donde co estimulados macrófagos producen grandes cantidades de IL-10 y cantidades bajas de la subunidad de citoquinas pro-inflamatorias interleuquina 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleucina 6 (IL-6) y TNF8. Inmunoglobulina intravenosa es un fármaco compuesto de anticuerpos policlonales, principalmente IgG, que ha sido de la sangre de los donantes más de 1.00010. Se utiliza para tratar una amplia variedad de Enfermedades inmunológicas, como la púrpura trombocitopénica idiopática y la polineuropatía desmielinizante crónica, pero su mecanismo de acción no es completamente entendida11. Los efectos de drogas de anticuerpos basados en la activación de los macrófagos pueden ser evaluados mediante los métodos descritos en este documento.
Los efectos de productos biológicos específicos en la activación de los macrófagos se pueden probar en BMDMs y en los macrófagos peritoneales. Utilizando estas fuentes de macrófagos permite la evaluación de células primarias. Pruebas preliminares de anticuerpos en cultivos de células primarias requiere menos tiempo y la inversión monetaria que otros modelos de enfermedad desperdiciador de tiempo y costoso. Por inyectar un medicamento en un ratón sano en vivoy aislar las células y análisis ex vivo, uno puede determinar si los estudios están garantizados para evaluar si el tratamiento con productos biológicos afecta la activación de los macrófagos en modelos de la enfermedad.
Con pocos estudios el efecto de las terapias biológicas en la activación de macrófagos in vitro e in vivo la prueba directamente, nuestras técnicas proporcionan una ventaja sobre técnicas alternativas. Las técnicas actuales implican efectos de droga biológica prueba de mezclado de la célula poblaciones en vitro, por ejemplo el efecto de infliximab en una reacción linfocitaria mixta (MLR) o inmunoglobulina intravenosa en macrófagos humanos en células mononucleares de sangre periférica, donde el efecto no se puede atribuir a una célula específica tipo7,12. Uso de BMDMs y macrófagos peritoneales es ventajoso sobre el uso de líneas celulares, tales como 264.7 células, que no producen las citoquinas pro inflamatorias, IL-12, en respuesta a LPS8,13. Prueba el efecto de una droga basada en anticuerpos en macrófago respuestas ex vivo tiene ventajas porque las respuestas del cytokine pueden atribuirse directamente a los macrófagos, en lugar de inferir las respuestas de los macrófagos mediante la medición de niveles del cytokine del suero14 . BMDMs y macrófagos peritoneales pueden ser derivados y aislados de ratones modificados genéticamente para determinar el papel específico de una proteína de activación de los macrófagos antiinflamatorio. Por ejemplo, hemos utilizado Il10 deficiente(- / -) BMDMs para demostrar que la reducción inducida por la inmunoglobulina intravenosa de la producción de citoquinas pro-inflamatorias es parcialmente dependiente de IL-108. Mecanismo de un medicamento de acción puede ser investigado utilizando el borrar occidental, donde el papel de proteínas específicas y eventos de señalización puede ser determinado. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) puede realizarse en BMDMs o los macrófagos peritoneales muestran patrones de expresión génica que resultan de la activación de anticuerpos. Modelos de la enfermedad en ratones pueden proporcionar información sobre la potencial eficacia de las terapias biológicas basados en anticuerpos en modelos para enfermedades como la inflamatoria intestinal enfermedad de, artritis reumatoide y cáncer15,16, 17. sin embargo, las técnicas descritas aquí proporcionará información sobre el mecanismo de acción de estos productos biológicos determinando si inducen la actividad de los macrófagos antiinflamatorio.

<table><tbody><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado' s medio (IMDM)</td><td>Tecnologías de vida</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Tecnologías de vida</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Factor estimulante de colonias de macrófagos murinos recombinantes (MCSF)</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Tecnologías de vida</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de disociación celular</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>13150016</td> Lipopolisacárido (LPS) <td>de EDTA sin enzimas, a base de HanksSigma</td></tr> <tr><td></td><td>aldrich</td><td>L 4516</td><td>de E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>recibidos del BC Children's Hospital, Medicina</td><td></td></tr> <tr><td>TransfusionalIVIg (Gammagard líquido)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Recibido de BC Children's Hospital, Medicina</td><td></td>Transfusional</tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Recibido de BC Children's Hospital, Medicina</td><td></td>Transfusional</tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (estéril), pH 7.4</td><td>Tecnologías de vida</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ratón IL-10 ELISA</td><td>BD biociencias 555252</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ratón IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Erk1/2</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-PP38</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GAPDH</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 26 g</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 15 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 50 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga (1,7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>Matraz tratado para cultivo > tejidos de 75 cm2 </sup</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>punta fina, de disección&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicado, 4 1/2"</td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Escala de contraste de fase invertida</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mettler&nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Los macrófagos son las células inmunes innatas fagocíticas, que inician la respuesta inmune a patógenos y contribuyan a la restitución del tejido y cicatrización. Los macrófagos son igualmente importantes en la desactivación de las respuestas inflamatorias. Hemos demostrado que los macrófagos estimulados con inmunoglobulina intravenosa (IgIV) pueden producir altas cantidades de la citocina antiinflamatoria, interleucina 10 (IL-10) y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias en respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos ( LPS). IVIg es que un anticuerpo polivalente, principalmente inmunoglobulina Gs (IgGs), agrupados desde el plasma de más de 1.000 donantes de sangre. Se utiliza para complementar los anticuerpos en pacientes con inmunodeficiencias o para suprimir la respuesta inmune en pacientes con enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Infliximab, un factor terapéutico antifactor de necrosis tumoral alfa (TNFα) anticuerpo, también se ha demostrado para activar a los macrófagos a producir IL-10 en respuesta a estímulos inflamatorios. Inmunoglobulina intravenosa y otros productos biológicos basados en anticuerpos pueden analizarse para determinar sus efectos sobre la activación de los macrófagos. Este artículo describe métodos para la derivación, la estimulación y la evaluación de los macrófagos de médula ósea murina activados por los anticuerpos en vitro y macrófagos peritoneales murinos activados con anticuerpos in vivo. Por último, se demuestra el uso de western blot para determinar la contribución de la señalización de caminos hacia la actividad de los macrófagos antiinflamatorios específicos de la célula. Estos protocolos se pueden utilizar con ratones genéticamente modificados, para determinar el efecto de una proteína específica sobre la activación de macrófagos antiinflamatorio. Estas técnicas pueden usarse para evaluar si determinados productos biológicos pueden actuar cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatorio de producción de IL-10 que reduce las respuestas inflamatorias en vivo. Esto puede proporcionar información sobre el papel de la activación de los macrófagos en la eficacia de productos biológicos en modelos de la enfermedad en ratones y proporcionar la penetración en un nuevo mecanismo de potenciales de acción en las personas. Por el contrario, esto puede precaución contra el uso de productos biológicos basados en anticuerpos específicos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente si los macrófagos juegan un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por esa.

Macrófagos de derivados de médula ósea murina pueden cultivarse a partir de precursores de células hematopoyéticas en aspirados de médula ósea. Aspirados de médula ósea agrupados de fémures y tibias de un ratón C57BL/6 por lo general rinden 107 médula ósea derivado de macrófagos, haciéndolos una fuente conveniente de los macrófagos para experimentos. BMDMs pueden ser utilizados para probar las respuestas del medicamento anticuerpo basado en cuando con un estímulo inflamatorio <...

Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

El objetivo general de estos experimentos es determinar los efectos de los fármacos basados en anticuerpos sobre los estados de activación de macrófagos antiinflamatorios utilizando médula ósea de ratón y macrófagos peritoneales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo, si los fármacos específicos de anticuerpos actúan cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatoria que produce IL-10. La principal ventaja de esta técnica, es que mide la respuesta de los macrófagos primarios de ratón de la médula ósea in vitro y de la cavidad peritoneal in vivo.Realice este procedimiento en una capucha estéril. Asegure a un ratón sacrificado en decúbito supino sobre una tabla de espuma con las extremidades extendidas. A continuación, limpie las patas con etanol al 70%.A continuación, haz un corte poco profundo de unos dos milímetros de profundidad para quitar la piel y el pelaje de la superficie de cada pata trasera. Luego, disecciona los tejidos para acceder a las tibias y los fémures. Para extirpar las tibias y los fémures, corte el hueso y los músculos justo debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos.Luego, retira la mayor cantidad posible de tejido muscular de los huesos. A continuación, limpie los huesos con etanol al 70% y deje que se evapore durante un minuto. Luego, coloque los huesos en un plato de seis pocillos lleno de hueso medio de pulpa.En la placa, recorte un milímetro de cada extremo de los fémures para que sus cavidades internas queden expuestas. Asegúrese de que una aguja de calibre 26 pueda acceder a las cavidades. A continuación, separe la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla.Luego, inserte la aguja conectada a una jeringa de 10 mililitros en una cavidad ósea y recoja la médula ósea. Extrae la médula ósea de los cuatro huesos y colócala en un tubo cónico de 50 mililitros con cinco mililitros de medio de carne ósea. Pipa el medio y la médula hacia arriba y hacia abajo varias veces.O vórtice a baja velocidad para dispersar suavemente los grumos en la suspensión. Los hilos de médula deben dividirse en pequeñas motas de médula de menos de medio milímetro de largo. A continuación, rellene el tubo a 50 mililitros con medio de pulpa ósea y transfiéralo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados.Incuba la médula ósea durante una hora. Durante la incubación, las células maduras se adherirán al matraz y los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros y gire las celdas hasta convertirlas en un pellet.A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en cinco mililitros de medio de cultivo MCSF. A continuación, ajuste la densidad de la celda a 500.000 por mililitro y cargue 30 mililitros en un nuevo matraz de 75 centímetros cuadrados. Continúe cultivando las células y, en los días cuatro, siete y 10, verifique que las células estén adheridas y ligeramente ramificadas utilizando un microscopio de campo de ruptura de contraste de fase invertida.Al revisar las células, deseche el medio que contiene las células no adherentes. A continuación, lave las células adherentes con IMDM una vez y añada 30 mililitros de medio de cultivo MCSF fresco de nuevo en el matraz. El día 10, reemplace el medio con ocho mililitros de tampón de disociación celular basado en EDTA sin enzimas para recolectar las células.Incuba las células brevemente, luego raspa las células suavemente y verifica que se hayan liberado con un microscopio. Una vez que se liberan las células, transfiera el tampón con las células a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, enjuague el matraz tres veces con cinco mililitros de IMDM para recoger más células.Extraer todas las colecciones, centrifugarlas y volver a suspender el pellet en tres mililitros de MCSF. Ahora, cuenta las células y ajusta su concentración a un millón por mililitro. A continuación, coloque 100 microlitros de suspensión celular por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos.Todo el plato debe ser rellenable . Cultive las células durante aproximadamente una hora hasta que estén adheridas. A continuación, estimulícelos con diferentes concentraciones de LPS o inmunoglobulina intravenosa o ambas preparadas en IMDM.Realice todas las manipulaciones por duplicado o triplicado y asegúrese de mantener los controles sin tratar. A continuación, incubar las células durante 24 horas y analizar los sobrenatantes. Prepare una jeringa de un mililitro con la cantidad requerida de inmunoglobulina intravenosa y LPS, y coloque una aguja de calibre 26.Para los controles, use PBS más LPS en su lugar. Agarra al ratón por el pescuezo mientras aseguras sus cuartos traseros y su cola con una mano. Apunte al cuadrante inferior derecho del abdomen e inserte la aguja en un ángulo de 30 a 40 grados con el bisel hacia arriba, e insértela aproximadamente 1,5 centímetros.A continuación, inyecte el bolo. Después de una hora, recoja los macrófagos peritoneales después de sacrificar al ratón. En una capucha estéril, sujete al ratón sacrificado a una tabla de espuma con las extremidades extendidas y esterilice el abdomen con etanol al 70%.Luego, haz una incisión poco profunda de dos milímetros a lo largo de la línea media y retira la piel abdominal. Evite perforar la pared peritoneal. A continuación, cargue completamente una jeringa de cinco mililitros con PBS estéril a pH 7,4 e inyecte el ratón con una aguja de calibre 25 o 27, en la parte superior de la cavidad peritoneal, desde cualquier lado, hacia la línea media, con el bisel de la aguja hacia arriba.Después de sacar la aguja, masajee el peritoneo durante 10 segundos para desalojar las células. Ahora, inserte la aguja nuevamente, nuevamente en la cavidad, y recoja aproximadamente 3,75 mililitros de líquido de lavado. Transfiera el líquido de lavado a un tubo cónico de 15 mililitros con hielo.Repita la inyección, el masaje y la recolección del líquido de lavado tres veces más, y coloque todas las colecciones en el mismo tubo. Durante la recolección final, puede ser más fácil extraer el líquido de lavado del lado más alejado del ratón. A continuación, gire las células y vuelva a suspenderlas en 500 microlitros de medio de siembra.A continuación, cuente los macrófagos viables y vuelva a suspenderlos a un millón por mililitro. Ahora, coloque 100 microlitros de suspensión en los pozos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, incuba las células durante una hora.Los macrófagos peritoneales se adherirán a la placa. A continuación, retire las células no adherentes y enjuague cada pocillo dos veces con 200 microlitros de IMDM tibio. Después de cada lavado, espere 10 segundos e incline lentamente la placa para extraer la solución de enjuague.Después de los lavados, vuelva a agregar 100 microlitros de medio de enchapado y coloque la placa en la incubadora. Para el ELISA, continúe incubando las células sin estimulación durante 24 horas. A continuación, recoja y clarifique el medio condicionado para el análisis de citocinas.Los BMDM se pueden utilizar para probar las respuestas a los fármacos basados en anticuerpos cuando se enfrentan a un estímulo inflamatorio in vitro. La inmunoglobulina intravenosa con LPS aumenta siete veces la producción de la citocina antiinflamatoria IL-10 en comparación con la estimulación con LPS sola. Y disminuye la producción de IL-12/23p40.Además, la estimulación intravenosa de inmunoglobulinas sola o con LPS aumentó la activación de la quinasa MAP ERK1/2, con fosforilación temprana y prolongada. La activación del P-38 también se produjo antes. Además, los macrófagos peritoneales aumentaron significativamente la producción de IL-10 con la estimulación in vitro, en comparación con los ratones inyectados con PBS.A continuación, se evaluó la producción de citocinas en el líquido de lavado y en sobrenadantes de macrófagos peritoneales estimulados ex vivo. La IL-10 aumentó en el líquido de lavado, las células peritoneales y los macrófagos peritoneales cuando los ratones fueron desafiados con inmunoglobulina intravenosa y LPS. En comparación, la producción de la subunidad de citocinas proinflamatorias IL-12/23p40 se redujo significativamente en los macrófagos peritoneales cultivados, pero no en el líquido de lavado.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar los efectos de los medicamentos basados en anticuerpos en los estados de activación de macrófagos in vitro e in vivo utilizando médula ósea de ratón y macrófagos peritoneales.

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Inmunología e Infección

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los...

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

En este video, demostramos la activación de macrófagos derivados de la médula ósea en respuesta al lipopolisacárido bacteriano y la inmunoglobulina intravenosa.

Activación de macrófagos derivados de la médula ósea de ratón en respuesta a anticuerpos

Este video muestra la activación de los macrófagos peritoneales de un ratón utilizando inmunoglobulina intravenosa y lipopolisacárido bacteriano. La coestimulación activa los macrófagos peritoneales en macrófagos antiinflamatorios que poseen actividad inmunorreguladora.

Activación in vivo de macrófagos peritoneales en respuesta a anticuerpos en un modelo murino

En este video, demostramos el efecto de diferentes concentraciones de anticuerpos anti-c-fms en la osteoclastogénesis, que es el proceso de formación de osteoclastos a partir de progenitores de osteoclastos.

Efecto del anticuerpo anti C-fms sobre la osteoclastogénesis en células de médula ósea de ratón in vitro

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Este protocolo incluye la disección de huesos largos murinos y aislamiento de médula ósea, macrófagos de médula ósea y producir osteoclastos con estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL) de colonias de macrófagos o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y su detención por el anticuerpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Dendríticas las células de captación de antígenos y migran hacia los órganos inmunes para presentar antígenos procesados ​​a los linfocitos T. Qdot nanocristales etiquetado proporciona una señal fluorescente de larga duración y estables. Esto permite el seguimiento de las células dendríticas a los diferentes órganos por microscopía de fluorescencia.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Aprende a evaluar la activación antiinflamatoria de macrófagos en médula ósea y peritoneo de ratón mediante drogas basadas en anticuerpos. Este protocolo permite medir respuestas in vitro e in vivo.

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

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