Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca^{2 +} movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

El objetivo general de este ensayo celular es identificar y caracterizar moléculas capaces de estimular o inhibir la movilización de calcio intracelular mediada por receptores acoplados a proteínas G. Este método puede ser un ensayo valioso para el descubrimiento de fármacos con receptores acoplados a proteínas G, ya que puede utilizarse para detectar moléculas que modifican los cuerpos de calcio intracelulares mediados por receptores. La principal ventaja de esta técnica es que permite identificar moléculas con propiedades agonísticas o antagónicas dentro de un mismo ensayo.

Este ensayo puede ayudar en el descubrimiento de nuevos candidatos a fármacos que actúen sobre los receptores acoplados a proteínas G, prometedores dianas terapéuticas que desempeñan un papel en muchas enfermedades humanas. El día del paso de las células, cubra cada pocillo con una placa de poliestireno de 96 pocillos de paredes negras con fondos transparentes con 100 microlitros de solución de gelatina al 0,1% e incube las placas durante dos horas a temperatura ambiente. Mientras la gelatina se solidifica, use una solución de tripsina EDTA para levantar las células de interés del fondo de su matraz de cultivo, resuspendiendo las células en un medio de crecimiento fresco en un tubo cónico de 50 mililitros una vez que se hayan desprendido.

Después del conteo, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un medio de crecimiento fresco a una concentración de una vez 10 a la quinta célula viable por mililitro. Cuando las placas estén listas, deseche el exceso de solución de gelatina y seque las placas en un pañuelo de laboratorio. Luego lave los pocillos con 200 microlitros de PBS y reemplace el lavado con 200 microlitros de células por pocillo para una incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

A la mañana siguiente, golpee el plato para desechar el medio de crecimiento de los pocillos y seque el plato boca arriba sobre una toalla de papel. A continuación, etiquete las células de cada pocillo con 100 microlitros de solución de colorante de carga por pocillo e incube la placa durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Mientras las células están incubando, agregue 75 microlitros de CXCL12 por pocillo a la placa de quimiocina y 50 microlitros del compuesto de interés a cada pocillo de la placa compuesta.

A continuación, encienda la unidad de enfriamiento del lector de placas de fluorescencia seguida del propio lector de placas. Después de permitir que el sistema se inicie durante unos minutos, abra el software del lector de placas. Para configurar el protocolo de ensayo, en la pestaña de configuración, seleccione el modo de lectura y las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas para el colorante de carga.

Seleccione la pestaña de mezcla con fluido de transferencia para la mezcla automática de los compuestos en la placa de compuesto. En la pestaña de fluido de transferencia, ajuste 20 microlitros de cada pocillo de la placa compuesta para transferirlos a la placa de medición y coloque las puntas de pipeta a 20 microlitros por debajo de la superficie del líquido. Establezca la velocidad de aspiración a 50 microlitros por segundo y la velocidad de dispensación a 25 microlitros por segundo y haga clic en leer con fluido de transferencia.

Durante el primer intervalo, seleccione 60 lecturas con un intervalo de tiempo de lectura de un segundo con 10 lecturas que se registrarán antes de que los compuestos se dispensen en la placa de medición y 50 lecturas que se completarán después. Establezca el segundo intervalo con un tiempo de intervalo de lectura de 30 segundos y 18 lecturas. Seleccione tres lavados de punta para el protocolo, configurando cada paso de lavado para incluir el líquido de lavado adecuado, un ciclo de lavado, una velocidad de bombeo rápida y cinco pasadas por lavado.

Utilice la función de pipeta de pausa para incluir la pausa del pipeta de 300 segundos y utilice el ajuste de mezcla con fluido de transferencia para permitir la mezcla automática de la solución CXCL12 dentro de la placa de quimiocina. En la pestaña de fluido de transferencia posterior, ajuste 25 microlitros de cada pocillo de la placa de quimiocina para transferirlos a la placa de medición y coloque las puntas 20 microlitros por debajo de la superficie del líquido. Ajuste la velocidad de aspiración a 50 microlitros por segundo y la velocidad de dispensación a 25 microlitros por segundo.

Utilice el botón de lectura con fluido de transferencia para configurar el primer intervalo para incluir 145 lecturas con un tiempo de intervalo de lectura de un segundo. Establezca el segundo intervalo en un tiempo de intervalo de lectura de seis segundos y 20 lecturas. Seleccione tres ciclos más de punta de lavado.

A continuación, haga clic en establecer la temperatura de la etapa y ajuste la temperatura del dispositivo a 37 grados centígrados. Al final de la incubación del tinte de carga, deseche el tampón de la placa de medición y seque la placa en un pañuelo de laboratorio. Lave las células con 150 microlitros por pocillo de tampón de ensayo, reemplazando el tampón con 80 microlitros de tampón de ensayo después de dos minutos.

Coloque la placa de medición en la posición de lectura, la placa compuesta en la posición de la fuente dos, la placa de quimiocina en la posición de la fuente tres y una caja de puntas negras en la posición de la fuente uno. Cierre el dispositivo y haga clic en prueba de señal de protocolo para determinar las unidades de luz relativas de fondo y la variación de fluorescencia sobre la placa. Seleccione la señal de prueba en la ventana emergente.

Si se obtienen valores de fondo de 8.000 a 10.000 unidades de luz relativas, seleccione actualizar y haga clic en guardar para guardar el protocolo principal. A continuación, pulse ejecutar para iniciar el ensayo. En este gráfico, se puede observar un aumento de la fluorescencia dependiente de la dosis que se correlaciona con el aumento dependiente de la dosis en la liberación de calcio.

El aumento de los niveles de fluorescencia inducida por CXCL12 permite la generación de una curva de dosis-respuesta basada en la diferencia entre la respuesta mínima y máxima sobre la línea de base entre la primera medición después de la adición de la quimiocina y la medición final en el protocolo. CXCL12 no evocó ninguna respuesta relacionada con el calcio fluorescente, incluso a una concentración alta cuando se utilizaron células que carecían del receptor de quimiocinas funcional CXCR4 correspondiente, lo que demuestra la especificidad del receptor de la medición evocada por CXCL12. Una aplicación clave para este ensayo basado en células es la identificación de moléculas pequeñas que, después de la preincubación, inhiben de manera dependiente de la dosis la movilización de calcio inducida por CXCL12 en las células en comparación con los compuestos no activos de control que no inhiben la respuesta.

Para determinar la potencia inhibitoria de moléculas pequeñas, se puede generar una curva de dosis-respuesta para las moléculas inhibidoras utilizando regresión no lineal. Este ensayo se puede utilizar para estudiar otros receptores acoplados a proteínas G sin optimización adicional o con una optimización mínima adicional, así como en este experimento en el que se observó un aumento dependiente de la dosis en la fluorescencia cuando otro receptor de quimiocinas, CCR5, fue estimulado con su agonista natural de quimiocinas CCL5. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para estudiar muchos otros receptores acoplados a proteínas G que señalizan a través de la movilización de iones de calcio intracelulares tras la activación del receptor.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se puede usar este ensayo celular para identificar agonistas y antagonistas del receptor de quimiocinas CXCL4.