Medición de la deformabilidad y la heterogeneidad de glóbulos rojos en sangre por Ektacytometry

El objetivo general de esta técnica es medir la deformabilidad de los glóbulos rojos y la heterogeneidad celular mediante ektacitometría. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ektacitometría, como qué tan deformables son los eritrocitos, qué tan heterogénea es una muestra de sangre y cómo cambia el experimento en función de la enfermedad. Las principales ventajas de estas técnicas son la accesibilidad, la comodidad y la fiabilidad en la medición de la deformabilidad y heterogeneidad de las poblaciones de glóbulos rojos.

Las técnicas pueden ser útiles para monitorizar la respuesta al tratamiento en pacientes con anemia falciforme. Porque la deformabilidad y heterogeneidad de los glóbulos rojos se correlacionan con la composición y concentración de la hemoglobina. Estos métodos se pueden aplicar a otras enfermedades caracterizadas por una disminución de la deformabilidad de los glóbulos rojos, como la diabetes, donde la disminución de la deformabilidad de los glóbulos rojos podría contribuir a la enfermedad microvascular.

Comience conectando el tubo de osmolar cero a la solución de PVP de baja osmolar y el tubo de 500 osmolar a la solución de PVP de alta osmolar. Asegúrese de que el bob esté completamente bajado en la copa. Inicie el software y cebe la máquina seleccionando Comprobación de hardware y, a continuación, E/S del instrumento. Permita que el instrumento complete el ciclo de cebado.

Una vez que se complete el ciclo, levante el bob de la copa y seque completamente el bob y la copa con un pañuelo de limpieza con poca pelusa. Mezcle suavemente una muestra de sangre entera recién extraída invirtiendo el vial varias veces. A continuación, pipetee 25 microlitros de sangre entera en cinco mililitros de solución de PVP iso-osmolar.

Después de tapar el vial, mezcle suavemente invirtiendo de nuevo varias veces. Elija deformabilidad en el menú principal del software, luego cree un nuevo análisis y agregue los detalles experimentales. A continuación, levante la tapa del ektacitómetro y verifique que el bob esté completamente bajado en la copa y que la copa esté girando.

Pipetee un mililitro de solución sanguínea PVP en el espacio entre la copa y el bob. A continuación, levante ligeramente el bob para bajar la muestra. Espere hasta que todas las burbujas se hayan movido fuera de la solución, luego cierre la tapa del ektacitómetro.

Ajuste la ganancia a 200 moviendo la flecha a lo largo de la barra de desplazamiento en el software. Cuando la temperatura sea estable a 37 grados centígrados y la imagen de difracción sea estable, presione inicio. Observe los patrones de difracción a medida que avanza la adquisición de datos para asegurarse de que permanezcan circulares, elípticos o en forma de diamante.

Una vez completada la adquisición de datos, imprima el informe y límpielo. Un patrón de difracción obtenido de sangre sana en respuesta a la tensión de cizallamiento muestra el patrón elíptico esperado. El índice de elongación se calcula utilizando la ecuación que se muestra aquí.

Cuando se aspira la muestra, enjuague el espacio entre la copa y el bob rociando agua desionizada en el espacio mientras el instrumento permanece en el ciclo limpio. Una vez que se complete el ciclo de limpieza, levante el bob de la copa y seque completamente el bob y la copa con un pañuelo de limpieza con poca pelusa. El secado adecuado es fundamental, ya que el agua residual lisará los glóbulos rojos, produciendo interferencias.

Seleccione exportar para guardar el informe. Por último, haga clic en el botón del menú principal del software para volver a la página principal. Después de cargar otra muestra en el ektacitómetro como antes, asegúrese de que haya una imagen de difracción estable en la pantalla.

Ajusta la ganancia de la cámara moviendo una regla a lo largo de la pantalla hasta que produzca una altura de difracción de 3,8 cm. Use una regla para verificar la altura de la imagen en la pantalla de la computadora. A continuación, pulse el botón de inicio y observe la adquisición de datos como antes.

Esta imagen muestra un patrón de difracción de 3,8 cm obtenido de la sangre de un paciente con anemia de células falciformes. Después de limpiar el ektacitómetro como se muestra anteriormente, repita el procedimiento para obtener patrones de difracción a alturas de 4,5 cm y 5,4 cm. La distorsión del patrón de difracción ocurre en muestras de sangre heterogéneas porque los glóbulos rojos rígidos no se alinean correctamente con las células deformables, lo que resulta en un patrón de difracción en forma de diamante.

Este patrón de distorsión es cada vez más detectable a medida que la ganancia de la cámara se ajusta para generar patrones de difracción más grandes. Para la ektacitometría de gradiente osmótico, comience agregando 250 microlitros de sangre total a un vial que contenga cinco mililitros de PVP iso-osmolar y mezcle suavemente. Elija Osmoscan en el menú principal del software.

A continuación, coloque el vial que contiene la solución de PVP en sangre debajo de la aguja en el lado izquierdo de la máquina. Baje la aguja hasta que toque el fondo del vial. Asegúrese de que la tubería esté correctamente conectada a las soluciones de osmolar bajo y alto para la producción de gradiente.

Cierre la tapa del ektacitómetro y abra la puerta de la mitad inferior para permitir una vista de la sangre que ingresa al tubo. Presione Nuevo análisis y escriba los detalles experimentales. Después de ajustar la ganancia de la cámara a 200, deje que la máquina funcione hasta que la sangre ingrese a la copa desde el tubo debajo del instrumento.

Cuando la pantalla de la computadora muestre un patrón de difracción estable, comience la adquisición de datos presionando el botón Comenzar ahora en el cuadro de diálogo. Permita que el ektacytometer adquiera datos de hasta aproximadamente 500 miliosmoles por kilogramo y luego detenga el instrumento. Imprima el informe.

A continuación, retire el vial de sangre PVP viejo y reemplácelo con un vial limpio que contenga agua desionizada. Lleve la aguja hacia abajo para que toque el fondo del vial y, a continuación, pulse el botón de enjuague en el cuadro de diálogo para enjuagar el sistema de degradado. Una vez que se complete el enjuague, presione la opción limpiar en el cuadro de diálogo en el monitor de la computadora y seleccione exportar para guardar el informe.

Seca el bob y la taza como antes. Las poblaciones sanguíneas homogéneas, como las que se encuentran en voluntarios sanos, no producen curvas de deformabilidad diferentes cuando se miden los tamaños de difracción. Por el contrario, las poblaciones sanguíneas heterogéneas, como la sangre de pacientes con anemia de células falciformes, muestran disminuciones significativas en las medidas de deformabilidad en función del tamaño del patrón de difracción.

En la sangre falciforme, cuando se mide el grado de distorsión del patrón de difracción en función de la IE máx., se correlaciona con la hemoglobina S y la variante de hemoglobina adulta, la hemoglobina A2. La transfusión corrige la distorsión, como lo indica su relación inversa con el porcentaje de hemoglobina adulta normal en la sangre. Ya sea que el grado de distorsión del patrón de difracción se mida en función del esfuerzo cortante requerido para lograr la deformabilidad máxima media, o en función de la EI máx., se correlaciona con la hemoglobina fetal. Los parámetros clave de la ektacitometría del gradiente osmótico, como EI max, EI min y O min, proporcionan información adicional sobre la hidratación celular, las relaciones superficie-volumen y la fragilidad osmótica, respectivamente.

Una vez dominadas, estas técnicas se pueden realizar en aproximadamente una hora, si se realizan correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía, para responder preguntas adicionales relacionadas con la deformabilidad de los eritrocitos individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la deformabilidad y la heterogeneidad del suero en muestras de sangre.