Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

El objetivo general de este procedimiento es preparar rodajas frescas de retinas de pez cebra para experimentos que requieren imágenes en vivo de proteínas fluorescentes o biosensores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la visión, como las funciones fisiológicas y metabólicas de los iones de calcio en tipos específicos de células y compartimentos celulares dentro de una retina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información espacial y temporal sobre metabolitos clave y moléculas de señalización en tejidos vivos.

Para que sea posible eliminar el epitelio pigmentario de la retina, o EPR, del pez cebra, se adapta el pescado durante una hora antes de hacer cortes de tejido. Para una cámara de corte, pinta líneas de esmalte de uñas en un portaobjetos. Con esmalte de uñas transparente, pinta líneas estrechas para crear un rectángulo.

Vuelve a pintar el esmalte una vez cuando esté seco. Si la cámara se va a utilizar para imágenes estáticas o experimentos de inyección con un flujo de solución mínimo, utilice una jeringa para aplicar dos tiras paralelas de vaselina a un cubreobjetos, de un centímetro de largo y a 0,5 centímetros de distancia. Ahora prepara las cuchillas.

Primero, limpia una maquinilla de afeitar de doble filo con etanol y déjala secar al aire. Luego usa unas tijeras para cortarlo en trozos de aproximadamente un centímetro. A continuación, coloque la cámara de corte en la plataforma de la cortadora de tejidos, céntrela horizontalmente en la plataforma y marque el borde largo con un marcador permanente para la alineación.

A continuación, cargue un trozo de cuchilla en el brazo de la cortadora. Asegure la hoja, de modo que el borde quede sobre el centro del portaobjetos y corra paralelo a la superficie del portaobjetos, pero no toque el esmalte de uñas. A continuación, baje el brazo de la cuchilla dando un cuarto de vuelta.

Ahora, intenta cortar papel de filtro. Vuelva a montar la cuchilla si es necesario. Para continuar, con la jeringa deposite un solo punto pequeño de gelatina en un plato de 10 centímetros, a unos 1,5 centímetros del punto medio.

A continuación, presione el lado seco de un cubreobjetos en la gelatina con unas pinzas. A continuación, coloque otro pequeño punto de gelatina a aproximadamente un centímetro del borde de entrada de la cámara de imágenes. Ahora, use una aguja de calibre 20 para hacer dos tiras paralelas delgadas de vaselina de un centímetro de largo a lo largo del centro de la cámara de corte separadas por aproximadamente un centímetro.

A continuación, transfiera el pez cebra a un plato y disloque el pez por vía cervical sin decapitarlo. Ahora, use un lazo de alambre para aflojar el tejido conectivo alrededor de un ojo y luego tire del ojo hacia adelante suavemente. A continuación, corte con cuidado el nervio óptico blanco debajo del ojo con unas microtijeras, pero no corte la parte posterior del ojo.

Para continuar, transfiera el ojo a un plato de solución fría de Ringer con hielo. A continuación, cosecha el otro ojo. Continúe trabajando bajo luz roja hasta que se elimine todo el EPR.

A continuación, transfiera un ojo a una gota de solución fría de Ringer en un portaobjetos de vidrio sobre una placa de Petri. A continuación, coloque la placa bajo un microscopio de disección de baja potencia para diseccionar la copa del ojo con luz roja. Primero, perfore la córnea con pinzas finas.

A continuación, utilice unas pinzas y unas tijeras para extraer suavemente los trozos de córnea transparente y quebradiza y la esclerótica plateada. A continuación, retire y deseche el cristalino y la mayor parte de la esclerótica para aislar la copa del ojo. Con una manipulación mínima, elimine cualquier trozo de grasa y esclerótica que permanezca adherido a la copa del ojo sin quitar la retina.

Si la retina se separa del EPR, proceda con especial precaución para evitar dañar la delicada retina. Ahora, vuelva a colocar el ocular con el lado abierto hacia abajo y córtelo en tercios o cuartos con una cuchilla nueva. Deseche los pedazos del ocular que estén demasiado curvados para aplanarlos.

Estas piezas son a menudo demasiado pequeñas para ser útiles en cualquier caso. Para montar las secciones de retina, humedezca un trozo de papel de filtro con la solución de Ringer y use pinzas planas para colocarlo junto a las piezas de la copa del ojo. A continuación, sumerja el papel de filtro y los pañuelos de papel en la solución fría de Ringer.

A continuación, utilice fórceps para colocar los trozos de retina sobre el papel de filtro con el EPR y los fotorreceptores hacia arriba. Manipule suavemente los bordes de las piezas de los oculares con pinzas finas para orientarlas en una sola línea en el centro del papel de filtro. Ahora aplana la retina usando pinzas para levantar el papel de filtro con la retina adherida y colocándolo sobre una toalla de papel seca.

Durante unos tres segundos, deja que la fuerza del líquido que penetra en la toalla de papel aplane la retina. Procesa todas las piezas de retina de esta manera, pero no dejes que se sequen. Ahora, aplique una gota de la solución de Ringer y use pinzas finas para despegar las láminas negras restantes de EPR del tejido.

Pela suavemente, y si la retina se levanta del papel, absorbe más solución como antes y debería aplanarse de nuevo. Ahora transfiera el papel con los pedazos de retina a un portaobjetos y recorte el papel en un rectángulo dejando unos 0,5 centímetros a cada lado de la fila de tejido. A continuación, mueva el papel de filtro a la cámara de corte preparada.

Empuje los bordes largos del papel de filtro en las líneas delgadas de vaselina con pinzas y luego sumerja las retinas en tres o cuatro gotas de solución fría de Ringer. Primero, transfiera la preparación a la etapa de corte de tejidos. Coloque el borde largo a lo largo de la línea marcada y asegure los extremos de la cámara a la platina con cinta de laboratorio.

Luego, comenzando por un extremo, corte la retina y el papel de filtro ejerciendo una presión firme y suave sobre el brazo de corte. Verifique que la primera rebanada se haya cortado completamente, y luego proceda a usar el micrómetro para cortar rodajas de aproximadamente 400 micras de grosor. A continuación, transfiera la cámara con secciones cortadas a la placa de Petri que contiene el cubreobjetos preparado, que servirá como escalera de imágenes.

Inunda el plato con la solución fría de Ringer y colócalo en la platina del microscopio de disección. Ahora, con un aumento bajo, use las pinzas para asegurar una tira y muévala a la escalera de imágenes deslizando la placa de Petri subyacente. Gire las rodajas 90 grados y entierre los bordes del papel de filtro en la gelatina.

Es importante mantener la retina sumergida y evitar cualquier contacto directo con la retina. A continuación, vuelva a colocar los cortes en las escaleras para que las capas de la retina sean claramente visibles. Para los cortes en cada extremo de la escalera, haga que la retina mire hacia adentro, hacia los otros cortes, para minimizar el movimiento durante la inyección o el flujo.

Deseche las rodajas que no se adhieran bien al papel. Ahora, tiñe el pañuelo. Mientras tanto, prepare la cámara de imágenes y el aparato de inyección.

Primero, enjuague el tubo con la solución de Ringer, hasta que no queden burbujas de aire. A continuación, conecte el tubo a la entrada de la cámara de imagen y cierre la llave de paso. Luego, vuelva a llenar la jeringa con la solución inyectable y vuelva a conectarla al tubo.

Ahora, use fórceps para transferir la escalera de imágenes preparada a la cámara de imágenes. Presiónalo en el punto de gelatina cerca del borde de entrada y llena la cámara con la solución de Ringer para cubrir las rodajas. A continuación, proceda con la toma de imágenes.

Con las técnicas descritas, se pueden obtener imágenes de cortes perfectamente transversales a través de todas las capas de la retina. Cuando se gira ligeramente, los haces de los segmentos exteriores serán visibles. Con la tinción PI, las células muertas se pueden eliminar del análisis.

Los fotorreceptores PI negativos sanos tienen una morfología estereotipada polarizada y alargada. Cuando están en Ringer oxigenados, se pueden obtener imágenes hasta por cuatro horas. Una estrategia de imagen es visualizar la dinámica del retículo endoplásmico del fotorreceptor del cono en relación con el núcleo.

Utilizar tejidos que expresen GFP, y el cono ER, mientras se contrarrestan con un tinte nuclear. Se puede emplear una estrategia similar para ver el citoesqueleto de actina con tejido que expresa actina fusionada con GFP. Utilizando imágenes de lapso de tiempo, se puede observar la dinámica celular, como las fluctuaciones citosólicas del calcio en un fotorreceptor de cono.

Por ejemplo, mientras se agota isotónicamente el sodio en la cámara de imágenes, GCaMP se puede utilizar para visualizar el aumento de las concentraciones de calcio citosólico. Al cuantificar las respuestas de fluorescencia de segmentos externos de conos individuales, cuerpos celulares y sinapsis, se puede determinar la dinámica del calcio intracelular durante manipulaciones farmacológicas, etc. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar la luz roja antes de eliminar el RPE.

Aplana con cuidado las copas de los ojos antes de cortarlas y mantén las rodajas sumergidas en todo momento. Una vez dominado, la disección, el corte y la preparación de los tejidos para la obtención de imágenes se pueden realizar en menos de 30 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes de retina de pez cebra para estudiar el metabolismo y la fisiología en tipos específicos de células en compartimentos celulares.