Name: Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende a preparar rebanadas frescas de retina de pez cebra adulto para experimentos de imagen ex vivo. Este método permite estudiar la dinámica de iones calcio en células retinianas específicas.

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Agradecemos a Ralph Nelson y Daniel Possin orientación reflexiva en el desarrollo de este protocolo y Eva Ma, Ashley George y Gail Stanton para la generación de líneas de pez cebra transgénico estable. El trabajo fue apoyado por NSF GRFP 2013158531 a M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. y M.G. y EY026020 a J.H. y S.B.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Ex vivo la proyección de imagen de pez cebra frescas rebanadas retiniana ha demostrado para ser una herramienta versátil para el estudio de fotorreceptor biología20,21,22y es el única que permite el análisis de células individuales en una madura totalmente diferenciados retina. Con la práctica, es posible realizar múltiples experimentos con el tejido de un solo pez, incluso usando rebanadas seriales de la misma parte de...

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en ampliamente utilizado en investigación científica básica y médica1, debido a su tamaño pequeño, rápido desarrollo y sistemas de órganos vertebrados. La transparencia natural de larvas de pez cebra combinado con métodos establecidos para transgénesis han permitido la visualización detallada de los procesos celulares en un animal vivo. Una serie de biosensores fluorescentes genéticamente codificados ha sido blanco específico de pez cebra células para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrógeno3, activación de apoptosis4 y ATP5.
En vivo la proyección de imagen de larvas de pez cebra ha llevado a avances en el campo de las neurociencias, incluida la asignación de cerebro los circuitos6 y7trastornos del desarrollo de medicamentos para el sistema nervioso central. Pez cebra son muy adecuadas para la investigación de visión porque sus retinas la estructura laminar y tipos de neuronas de vertebrados superiores, y muestran comportamientos visual robusto8,9. Varios tipos de degeneraciones retinianas análogas a la enfermedad en humanos han sido modelados con éxito y estudió en el pez cebra10,11, incluyendo proyección de imagen viva de los fotorreceptores individuales degeneren en una retina de2, 12.
Mientras que en vivo imágenes de larvas de pez cebra es una valiosa herramienta, se convierte en más difícil como peces crecen y desarrollan la pigmentación, y algunos tratamientos farmacológicos pueden impregnar un animal entero. Además, ciertos procesos celulares cambian con desarrollo y edad, haciendo más adelante momentos críticos para la función de la comprensión y la progresión de la enfermedad en animales adultos. Métodos bioquímicos como inmunoblot, quantitiative PCR, el consumo de O2 y análisis metabolómicos pueden proporcionar pistas importantes sobre la biología de la retina en su totalidad, pero es difícil distinguir las contribuciones individuales de tipos de células afectadas por de la enfermedad. Imagen tejido retiniano aislado ex vivo pasa por alto estas cuestiones y mientras que la proyección de imagen plana montados retinas ofrece una vista de la retina externa13, características retinianos internos más profundo se oculta. Rebanadas de retina transversal, tales como los presentados en análisis immunohistochemical, permiten una visión clara de todas las capas y tipos de la célula pero nadamas una sola instantánea de los procesos dinámicos implicados en la enfermedad y la función normal.
Aquí, presentamos un método para generar ex vivo transversal rebanadas de retina de pez cebra adulto para la proyección de imagen. Es similar a los métodos para la preparación de rodajas de retina de anfibios y peces cebra para estudios electrofisiológicos y morfológicos14,15, con modificaciones importantes para lapso de tiempo de imagen ex vivo con confocal microscopia. Respuestas de fluorescencia de biosensores o tintes en rodajas son monitoreadas en tiempo real con un microscopio confocal mientras que entregan los agentes farmacológicos mediante perfusión. Mientras que el método fue desarrollado por fotorreceptores la proyección de imagen, puede ser factible utilizar para visualizar las células de Müller, células bipolares, células horizontales, células amacrinas o las células ganglionares de la retina con marcadores fluorescentes apropiados. Además, se pueden cargar rebanadas con tintes fluorescentes permeable a la célula a la viabilidad celular de informe, transporte vesicular, función mitocondrial o estado redox. Esta preparación permite la visualización de una amplia gama de procesos subcelulares a lo largo de la retina, incluyendo dinámicas de Ca2 + , transduction de la señal y estado metabólico.

<table><tbody><tr><td>pez cebra</td><td>Universidad de Washington South Lake Union Las existencias de las instalaciones</td><td></td> acuáticas <td>se mantienen internamente como líneas transgénicas estables</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-843</td><td>para vaselina jeringa</td></tr> de <tr><td>3</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td>para vaselina jeringa</td></tr><tr><td>20g 3,8 cm aguja de punta deslizante</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>para vaselina jeringa</td></tr><tr><td>lisa 7 cm X 2,5 cm portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>para disección de oculares, cámara de corte</td></tr><tr><td>Seche Vite esmalte de uñas transparente</td><td>Amazon</td><td>B00150LT40</td><td>para cámara de corte</td></tr><tr><td>18 mm X 18 mm #1 cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>para escaleras de imagen</td></tr><tr><td>cera dental sin sabor</td><td>Amazon</td><td>B01K8WNL5A</td><td>para escaleras de imagen hojas</td></tr><tr><td>de afeitar de doble filo</td><td>Stoelting</td><td>51427</td><td>para el corte de tejidos</td></tr><tr><td>cortadora de tejidos con micrómetro digital</td><td>Stoelting</td><td>51415</td><td>para el corte de tejidos</td></tr><tr><td>papel de filtro - celulosa mixta cuadriculada blanca, 13 mm de diámetro, 0,45 y micro; m tamaño de poro</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWG01300</td><td>papel de filtro para el montaje de retinas placa de</td></tr><tr><td>Petri de 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>para peces de eutanasia, disección, montaje de escalera de imagen</td></tr><tr><td>varilla aplicadora de madera de punta lisa de 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>para alambre herramienta de bucle de</td></tr><tr><td>ojo de 30 g (0,25 mm de diámetro) alambre de tungsteno</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>para herramienta de bucle ocular</td></tr><tr><td>de alambre D-glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>componente de la solución madre del suplemento</td></tr><tr><td>L-lactato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td>componente de la solución madre del suplemento</td></tr><tr><td>piruvato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>componente de la solución madre del suplemento</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>componente de la solución madre del suplemento</td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutatión reducido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>componente de la solución madre del suplemento</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>componente de la solución madre del suplemento</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>componente de la solución de Ringer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>componente de la solución</td></tr> <tr><td>de RingerCaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>componente de la solución de Ringer</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>componente de la solución de Ringer</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0250</td><td>componente de la solución de Ringer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>componente de la solución de Ringer</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td>componente de Na+-free Solución de Ringer</td></tr><tr><td>6 N HCl Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-003-063</td><td>componente de Na+-free Solución de Ringer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>componente de Na+ sin solución de Ringer</td></tr> tubo de <tr><td>centrífuga cónico de 50 ml</td><td>Contenedor Denville Scientific</td><td>C1062-P</td><td>para solución de Ringer</td></tr><tr><td>Tijeras Vannas - 8 cm, hojas angulares de 5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501790</td><td>microtijeras para la disección de oculares Pinzas suizas</td></tr><tr><td>- #5, 11 cm, rectas, puntas de 0,06 X 0,07 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504510</td><td>Pinzas finas para la disección de oculares y manipulación</td></tr><tr><td>de cortes cuchillas de afeitar de un solo filo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>para disección y recorte de oculares Papel de filtro</td></tr><tr><td>EMD Pinzas de filtro Millipore Pinzas</td> planas <td>Fisher Scientific</td><td>XX6200006P</td><td>para manipular papel de filtro húmedo</td></tr><tr><td>C12 558/568 BODIPY</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3835</td><td>tiñe núcleos de células vivas; incubar 5 &micro; g/mL durante 15 min a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>yoduro de propidio (PI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>tiñe núcleos de células muertas; incubar 5 &micro; g/mL durante 20 min a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td>tiñe núcleos de células vivas; incubar 5 &micro; g/mL durante 20 min a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T668</td><td>tiñe mitocondrias funcionales cargadas negativamente; incubar 1 nM durante 30 min a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>cámara de perfusión tisular</td><td>Cell MicroControls</td><td>BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td><td>cámara de imagen para inyección o perfusión</td></tr><tr><td>2-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-Desoxiglucosa (NBDG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N13195</td><td>análogo de glucosa fluorescente administrado por vía oral a pez cebra 30 minutos antes de la eutanasia</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser Olympus</td> Microscopio confocal <td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>para visualizar la fluorescencia de cortes a resolución de una sola célula</td></tr><tr><td>Cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td>reactivo experimental que ablaciona la respiración mitocondrial; Trate las rodajas hasta una concentración final de 1 &micro; </td></tr><tr><td>M posicionador de aspirador en miniatura</td><td>Cell MicroControls</td><td>FL-1</td><td>para perfusión</td></tr><tr><td>colector de perfusión, colector de burbujeo de gas, válvula de flujo, soporte de jeringa de 60 cc</td><td>Warner Instruments</td><td>varios</td><td>para perfusión</td></tr></tbody></table>

preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para ex vivo de experimentos

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

La retina es un tejido complejo que inicia e integra de los primeros pasos de la visión. Disfunción de células de la retina es una de muchas enfermedades cegadoras y terapias futuras dependen de entendimientos fundamentales sobre cómo diferentes de la retina las células funcionan normalmente. Obtener esa información con métodos bioquímicos ha demostrado ser difícil porque las contribuciones de los tipos de la célula particular se disminuyen en el ambiente de células retinianas. En proyección de imagen retiniana puede proporcionar una vista de los numerosos procesos biológicos a nivel subcelular, gracias a un número creciente de biosensores fluorescentes genéticamente codificados. Sin embargo, esta técnica hasta el momento se ha limitado a los renacuajos y larvas de pez cebra, las capas más externas de la retinales de retinas aisladas, o proyección de imagen de resolución baja de retinas en animales vivos. Aquí presentamos un método para generar vivo ex vivo rebanadas de retina de pez cebra adulto vivo imagen mediante microscopía confocal. Esta preparación rinde rebanadas transversales con todas las capas retinianas y más tipos de células visibles para realizar experimentos de proyección de imagen confocales mediante perfusión. Pez cebra transgénico expresando proteínas fluorescentes o biosensores en tipos de células retinianas específicas u organelos se utilizan para extraer información de unicelular de una retina intacta. Además, rebanadas de retinales se pueden cargar con indicador fluorescente tintes, añadiendo a la versatilidad del método. Este protocolo fue desarrollado para la proyección de imagen Ca2 + en fotorreceptores del cono de pez cebra, pero con los marcadores adecuados podría adaptarse para medir Ca2 + o metabolitos en células de Müller, células bipolares y horizontales, microglia, células amacrinas o retina células del ganglio. El epitelio retiniano del pigmento se retira de rebanadas por lo que este método no es adecuado para el estudio de ese tipo de célula. Con la práctica, es posible generar seriales rebanadas de un animal para experimentos múltiples. Esta técnica adaptable proporciona una poderosa herramienta para responder a muchas preguntas sobre biología celular retiniana, Ca2 +y homeostasis de la energía.

Colocación estable y orientación transversal de rebanadas son clave para la proyección de imagen exitosa con inyección o perfusión de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine y colocar rebanadas antes de la proyección de imagen confocal según sea necesario para asegurar que todas las capas retinianas son visibles (figura 2A, sector ii). Si se hace girar un trozo ligeramente hacia adelante (figura 2A, sector iii), paquetes d...

Proyección de imagen del tejido retiniano puede proporcionar información de unicelulares que no se desprende de los métodos bioquímicos tradicionales. Este protocolo describe la preparación de rodajas de retinales de pez cebra para la proyección de imagen confocal. Fluorescentes genéticamente codifican sensores o indicador tintes permiten visualización de numerosos procesos biológicos en los tipos de células retinianas distintas.

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar rodajas frescas de retinas de pez cebra para experimentos que requieren imágenes en vivo de proteínas fluorescentes o biosensores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la visión, como las funciones fisiológicas y metabólicas de los iones de calcio en tipos específicos de células y compartimentos celulares dentro de una retina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información espacial y temporal sobre metabolitos clave y moléculas de señalización en tejidos vivos.Para que sea posible eliminar el epitelio pigmentario de la retina, o EPR, del pez cebra, se adapta el pescado durante una hora antes de hacer cortes de tejido. Para una cámara de corte, pinta líneas de esmalte de uñas en un portaobjetos. Con esmalte de uñas transparente, pinta líneas estrechas para crear un rectángulo.Vuelve a pintar el esmalte una vez cuando esté seco. Si la cámara se va a utilizar para imágenes estáticas o experimentos de inyección con un flujo de solución mínimo, utilice una jeringa para aplicar dos tiras paralelas de vaselina a un cubreobjetos, de un centímetro de largo y a 0,5 ce

preparing-fresh-retinal-slices-from-adult-zebrafish-for-ex-vivo

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este artículo describe un método para microdissect retinas del pez cebra con y sin epitelio pigmentario de la retina adjunta, de uno a tres embriones postfertilización días.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de...

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

El video muestra un método para cultivar células ganglionares primarias de la retina de embriones de pez cebra. Los embriones en etapa temprana se someten a disección para aislar los ojos, que posteriormente se disocian mecánicamente en una suspensión de células ganglionares de la retina. Esta suspensión celular se cultiva en cubreobjetos recubiertos con proteínas adhesivas para facilitar el desarrollo de los axones.

Generación de cultivos primarios de ganglios angulares de la retina a partir de embriones de pez cebra

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Presentamos un método eficiente para marcar retrógradamente las células ganglionares de la retina (RGCs) en peces cebra adultos.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

Aquí, discutimos un protocolo de método que permita un fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis y cambios estructurales.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H2O2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O2durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Aprende a preparar rebanadas frescas de retina de pez cebra adulto para experimentos de imagen ex vivo. Este método permite estudiar la dinámica de iones calcio en células retinianas específicas.

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

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