Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

El objetivo general de este protocolo es lograr una disrupción génica rápida y eficiente a través de CRISPR/Cas9 y células progenitoras hematopoyéticas primarias utilizando un enfoque de ribonucleoproteínas. Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la hematopoyesis normal y maligna, como cuáles son las consecuencias moleculares y fenotípicas de la pérdida del gen X. La principal ventaja de esta técnica es que es extremadamente fácil, rápida y rentable. El tiempo estimado necesario desde la concepción del experimento hasta la ejecución es inferior a una semana.

Aunque este método se ha optimizado para las células progenitoras hematopoyéticas, se puede aplicar a otros tipos de células, como las células T primarias, las líneas celulares hematopoyéticas de ratón y humano y las muestras de leucemia primaria. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que otros enfoques de administración de CRISPR/Cas9, incluidos plásmidos y virus, eran tóxicos para nuestras células o tenían tiempos de respuesta lentos. Para diseñar ARN de una sola guía de interés, primero navegue al sitio web de CRISPRscan.

Según la celda de interés, presione el botón Mouse o Humano y luego ingrese el gen de interés en el cuadro de búsqueda de UCSC y haga clic en ir. A continuación, acérquese al exón al que desea dirigirse. Compruebe si hay alguna secuencia diana de ARN de una sola guía en el encabezado Predicciones de CRISPRscan en Genes.

A continuación, haga clic en un ARN de guía única objetivo etiquetado como un rectángulo verde y copie la secuencia completa que se muestra en la secuencia Oligo. A continuación, pegue la secuencia en un documento de texto. A continuación, agregue los nucleótidos ATAGC a los tres extremos primos de la secuencia.

Realice el pedido de la secuencia de longitud completa. Ahora, para sintetizar la plantilla de ADN para el ARN de una sola guía, disuelva y luego diluya los cebadores de ARN de una sola guía hacia adelante y hacia atrás universales. A continuación, añada todos los reactivos en un tubo de PCR para realizar la PCR superpuesta.

Después de constituir la reacción de PCR, coloque el tubo en un termociclador y ejecute el programa. Una vez finalizado el programa, purifique el producto de PCR utilizando columnas de purificación de ADN. Diluir el ADN en 11,5 microlitros de tampón de elución.

A continuación, utilice el tampón de elución como blanco en el espectrofotómetro. Mida la concentración de la muestra de ADN en el espectrofotómetro. Primero, mezcle el ADN eluido, los fosfatos desoxinucleótidos, el tampón de reacción y la mezcla de enzimas ARN polimerasa T7 en los tubos de tiras de PCR.

A continuación, incubar la muestra a 37 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, aplique el agente de limpieza RNase para eliminar la RNasa de los guantes en uso. A continuación, ajuste el volumen de cada muestra de ARN a 50 microlitros con agua sin nucleasas.

Purifique el ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, eluir el ARN en 50 microlitros de agua libre de nucleasas. Primero, use el agua libre de nucleasas para blanquear el espectrofotómetro y luego mida la concentración del ARN eluido.

Utilice la exclusión de azul tripano para contar el número de celdas. Para cada réplica, recoja 200.000 células viables por réplica, luego agregue solución salina tamponada con fosfato para lavar las células. A continuación, gire el tubo a 300 veces g durante siete minutos.

Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante. Durante el curso de la centrifugación, incube 1,5 microgramos de Cas9 con un microgramo de ARN monoguía total en un tubo de PCR durante 20 a 30 minutos. Esto es para preparar los complejos Cas9-sgRNA RNP para cada réplica.

Después de calcular el volumen del tampón de resuspensión T requerido, disuelva el pellet celular obtenido en el tampón de resuspensión T. Luego agregue 10 microlitros de la suspensión celular disuelta en el tubo de PCR con los complejos Cas9-sgRNA RNP. A continuación, encienda la unidad de electroporación. Deslice la cubeta en el soporte de la cubeta.

Luego agregue tres mililitros de tampón E.Establezca las condiciones en el dispositivo de electroporación. Para realizar la electroporación, primero sostenga la pipeta de electroporación, luego extienda la garra y agarre el disco dentro de la punta de la pipeta, luego presione firmemente la pipeta hacia abajo para asegurar la punta. A continuación, mezcle la muestra pipeteándola hacia arriba y hacia abajo 10 veces.

Extraiga 10 microlitros de la muestra y asegúrese de que no haya burbujas de aire. A continuación, inserte la punta directamente en el tampón electrolítico de la cubeta de electroporación. A continuación, pulsa Iniciar en la pantalla.

Deje que aparezca el mensaje completo en la pantalla. A continuación, retire la pipeta de la cubeta. A continuación, dispense el contenido de la cubeta en el pocillo lleno con el nuevo medio de cultivo HSPC.

Para estudiar la eficacia de la electroporación Cas9-sgRNA RNP, las HSPC aisladas de los ratones se electroporan con RNasa de guía única dirigida a GFP o tdTomato. Estas HSPCs expresan de forma ubicua GFP o tdTomato. El análisis de citometría de flujo muestra aproximadamente un 75 y 74% de pérdida de expresión de GFP o tdTomato en las HSPCs a nivel de proteína.

A continuación, se realiza un ensayo basado en la endonucleasa T7 con ADN amplificado por PCR del locus GFP de las células electroporadas. Esto es para cuantificar la eficiencia de la disrupción génica de GFP. El software ImageJ se utiliza para calcular la relación entre las intensidades de las bandas escindidas y las deshilachadas para calcular el porcentaje de escisión.

La eficacia de tres ARN de guía única diferentes dirigidos a CD45 humano se prueba en la línea celular HL-60 AML. La citometría de flujo muestra que el RNA1 de guía única es el más eficiente con una eficiencia de knockout del 98% en comparación con el control. A continuación, también se realiza la eliminación de CD45 en HSPC positivas para CD34 de sangre de cordón umbilical humano primaria utilizando ARN1 de guía única.

El análisis de citometría de flujo muestra casi un 80% de células con pérdida de CD45 sin alteración en la expresión de CD34 en comparación con solo Cas9. Con el fin de estudiar el injerto de HSPC knockout CD45 humanas, se recolectan células de médula ósea y bazo de ratones NSG transfectados retroorbitalmente CD34 positivos para su análisis, mostrando células editadas como HLA-ABC positivo y CD45 negativo. Una vez dominado, este protocolo se puede completar en tres días, si se realiza corregido.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las superficies y reactivos libres de ARNasa, verificar la interrupción génica eficiente con múltiples técnicas y utilizar los controles experimentales adecuados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, sintetizar y transfectar ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA en células progenitoras hematopoyéticas para obtener una interrupción génica rápida y eficiente.