Name: Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprende a derivar células estaminales embrionarias humanas mediante inmunocirugía para aislar la masa celular interna. Este protocolo detallado facilita la investigación en biología del desarrollo y medicina regenerativa.

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AEC es miembro de la Jane Coffin Niños Memorial Fund para la Investigación Médica y Merck Research Laboratories. Damos las gracias a D. Egli y Cowan C. consejo experimental y discusión.

<html> Congelados embriones humanos utilizados para la derivación de células madre embrionarias humanas (HES) fueron donados para la investigación con previo consentimiento informado adecuado bajo protocolos de investigación que fueron revisados ​​y aprobados tanto por el comité sobre el uso de seres humanos y las células madre embrionarias comité de supervisión de la investigación en la Universidad de Harvard . Protocolo escrito a continuación se basa en los parámetros publicados reportados por Cowan et al. 2004, con ligeras modificaciones. Cultivo de embriones Descongelar los embriones humanos usando Kit Quinn ventaja deshielo y la cultura en gotas de medio global complementado con un 15% Plasmanate hasta que el desarrollo de la etapa de blastocisto expandido. Immunosurgery basada en el aislamiento de la masa celular interna Preparación: <ol><li> Preparar platos para la eliminación de la zona pelúcida y immunosurgery (ver más abajo) mediante la creación de gotas de cada solución en placas de 10 cm. Superposición con aceite mineral para evitar la evaporación. Prepare una sola fila por embriones destinados a la derivación. <ul><li> EmbryoMax Tyrodes ácidas, como es el uso. </li><li> hES medios de comunicación celular derivación: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum de reemplazo, el 10% Plasmanate, el 2,5% de células ES a prueba de suero fetal bovino (FBS), 2 mM Glutamax-I, el 1% no aminoácidos esenciales, 50 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoetanol, 5ng/ml bFGF. </li><li> Conejo anti-humano de anticuerpos de glóbulos rojos primaria, reconstituido de acuerdo con la sugerencia del fabricante, se diluye a las 1:10 con los medios de comunicación hES derivación celular. </li><li> Conejillo de indias suero complemento, reconstituido de acuerdo con la sugerencia del fabricante, se diluye a las 1:10 con los medios de comunicación hES derivación celular. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure-01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> Equilibrar todas las placas a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos antes de su uso. </li><li> Tire de 50μl, 100μl pipetas capilares (VWR) para su uso en la transferencia de embriones. Corte los extremos con lápiz de diamante y el uso con un tubo de la boca de pipeta equipado con un filtro de 0.2μm. </li></ol> Immunosurgery procedimiento: Notas: <ul><li> En este procedimiento, las células de la trophectoderm son destruidos por la breve exposición a los anticuerpos dirigidos contra las células humanas en conjunto con la actividad del complemento. Por lo tanto, el protocolo funciona mejor con embriones de alta calidad con un trophectoderm intacta, ya que sólo la integridad estructural del blastocisto evita que el ICM de también ser susceptibles a la reacción inmunológica. </li><li> Todos los procedimientos llevados a cabo utilizando un endoscopio equipado con disección etapa se calienta. </li></ul> Pasos a seguir: <ol><li> Enjuague pipetear con la boca que se utilizará para la transferencia de embriones con FBS para evitar que los embriones se peguen. </li><li> La transferencia de blastocistos de placa de cultivo de hES caída celebración de AT plato. </li><li> Comience el procedimiento mediante la transferencia de blastocistos de caída hES a través de una serie de AT gotas. En tercera gota, para ver la disolución de la zona pelúcida (segundo por lo general 5-30). Tenga cuidado de no sobre-tratamiento o la integridad del embrión puede verse comprometida. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Blastocisto de transferencia a través de una serie de medios de comunicación hES derivación de células se reduce a enjuagar AT. Pipeta de precarga con los medios de comunicación se recomienda para neutralizar de inmediato la reacción. Blastocistos puede ser considerado aquí hasta que todos hayan sido procesados. </li><li> La transferencia de blastocistos a través de una serie de gotas de anticuerpo primario, dejando en la tercera gota durante 30 minutos de incubación a 37 ° C en un incubador de cultivo de tejidos. </li><li> Blastocisto de transferencia a través de una serie de medios de comunicación hES derivación de células se reduce a enjuagar primaria. </li><li> La transferencia de blastocistos a través de una serie de gotas de complemento, dejando en la tercera gota de ver para la lisis de las células trophectoderm. Observe blastocisto de los primeros 30 segundos en el escenario de &quot;burbujas&quot; de las células trophectoderm como lisis. Si se observa la lisis dentro de este plazo, mantener un plato sobre platina del microscopio para controlar la reacción hasta su finalización. Si no hay burbujas que se observa durante los primeros 30 segundos, retorno a la incubadora, comprobando cada 5 minutos hasta que la mayoría de los trophectoderm ha lisadas. Esto puede tomar 5-15 minutos. Monitorear la reacción de cerca para minimizar el tiempo de reacción y el daño potencial de la masa celular interna. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Blastocisto de transferencia a través de una serie de medios de comunicación hES derivación de células se reduce a lavar la actividad del complemento. </li><li> Usando una pipeta de vidrio con un diámetro ligeramente más pequeño que el blastocisto (sacado de 10μl tubos capilares VWR), dibuja el blastocisto arriba y hacia abajo para quitar a la mayoría de los trophectoderm lisadas. g &quot;alt =&quot; 574_Figure-0 &quot;width =&quot; 577 &quot;height =&quot; 270 &quot;/&gt; </li><li> Placa de ICM aislar a las células de conexión de los fibroblastos de embrión de ratón mitóticamente inactivadas (MEFs). MEFs debe estar preparado el día antes de la derivación y cambió a la celda hES derivación día de los medios de comunicación. 4 platos y NUNC funcionan bien para los primeros pasos de la derivación. </li><li> No moleste a la placa de 1-2 días. A partir de entonces, todos los días para ver resultado de colonias de células madre embrionarias (generalmente evidente en 1-2 semanas). Los medios de comunicación se debe cambiar en los volúmenes de media cada día, comenzando otra el día 3. </li></ol> ES consecuencia celulares y pases Cuando la extensión de células hES ha llegado aproximadamente a 0,5 mm o más, está listo para la expansión de recogida mecánica. <ol><li> Mecánicamente dispersar la mitad de la extensión y la transferencia de las nuevas placas que contienen los alimentadores fresco. Grupos de células madre embrionarias debe ser aproximadamente de 30 a 50 celdas cada uno. Agregar la otra mitad de la extensión como un back-up para el primer paso (P1). La consecuencia (P0) se pueden seleccionar de varias veces a medida que continúa expandiéndose. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> Colonias secundaria puede ser igualmente dispersado y expandido a través de placas de cultivo más grande hasta pasajes 3-5, momento en el que las nuevas líneas celulares se pueden adaptar a los pases enzimática con tripsina. El contenido en suero de los medios de cultivo también debe reducirse gradualmente hasta el 1% y 0% en los pasajes iniciales de reducir al mínimo la diferenciación de células ES. </li><li> Todas las líneas establecidas de células madre embrionarias debe ser depositado por la congelación por parte de principios de los pasajes para futuras expansiones. </li><li> Además, cada línea celular se caracteriza por el análisis de cariotipos y validado por estudios de pluripotencia y la diferenciación in vitro e in vivo. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que aquí se presenta ofrece a los investigadores con un conciso y fácil de seguir, resumen de la forma de obtener líneas embrionarias humanas de células madre mediante el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

<table><tbody><tr><td>Kit de descongelación Quinn&amp;rsquo;s Advantage </td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Medio Global</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>Ácido de Tyrodes EmbryoMax</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto de suero KO</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal probado en células ES, definido</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;etanol </td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario de conejo anti-eritrocitos humanos</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>Suero de complemento de hámster sirio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas capilares de 10 µL, 50 µL y 100 µL</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de boca con tubo</td><td>VWR international</td><td></td><td>suministradas con pipetas capilares de VWR</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Acrodisc de 0,2 µm </td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA al 0,5%</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Nikon SMZ1500 equipado con platina térmica Nikon Tokai Hit ThermoPlate </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionarios de ratón (E12,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivación de células estaminales embrionarias humanas por immunosurgery

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

La capacidad de las células madre embrionarias humanas para autorrenovarse y diferenciarse en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que poseen un gran potencial tanto para...

Hola, mi nombre es Alice Chen. Soy investigadora posdoctoral en el laboratorio de melting y hoy les mostraré cómo obtenemos células madre embrionarias a partir de embriones humanos. Recibimos embriones en diversas etapas de desarrollo y los cultivamos in vitro hasta que alcanzan la etapa adecuada de blastocisto expandido.Estos son ejemplos de cómo el embrión se desarrolla desde la primera etapa, la de una sola célula, hasta el blastocisto temprano y luego al blastocisto expandido, del cual derivamos las células madre embrionarias humanas. Los embriones de alta calidad seleccionados para la derivación se transfieren luego a través de tres gotas de ACE roads, donde se dejan y se observa la disolución de la Zona de lucita. El proceso de neurocirugía es un proceso no específico en el que el anticuerpo de conejo anti-humano se unirá a la capa externa de células.En este caso, es la tríada dérmica. Tras la aplicación del complemento de suero de cobayo, todas estas células con anticuerpo unido serán lisadas. Para comenzar, queremos preparar tres placas.La primera placa es para los tyros ACE, que utilizamos para eliminar la zita. La segunda y tercera placas son para la cirugía inmunológica. Primero comenzaré generando la placa en la que colocaremos las gotas de tyros ácidos y la derivación de células madre embrionarias humanas.Gotas de medio. Prepare tres gotas de ácido tiros en el lado izquierdo de la placa y, en el lado derecho de la placa, prepare tres gotas de medio de cultivo de células madre embrionarias humanas. La segunda placa contiene el anticuerpo primario, que es un anticuerpo de conejo anti-eritrocitos humanos.Nuevamente, el lado izquierdo de la placa se dedicará al anticuerpo primario, tres gotas por embrión, y el lado derecho de la placa se dedicará al cultivo de ES humanos. Gotas de medio, nuevamente, tres gotas por embrión para la placa de complemento. Nuevamente, colocaremos tres gotas de complemento en el lado izquierdo de la placa, y luego tres gotas de medio de cultivo de ES humanos en el lado derecho de la placa.Nuevamente, cada fila está dedicada a un embrión. Las tres placas se cubren con aceite mineral para prevenir la evaporación y se colocan en el incubador para la equilibración. Este es un microscopio de disección ubicado dentro de una cabina de selección con flujo laminar, similar a la utilizada en cultivo de tejidos, y aquí realizamos la mayor parte de nuestras manipulaciones de embriones humanos.Lo primero que desea preparar antes de comenzar a trabajar con sus embriones son pipetas bucales. Esta es la tubería estándar para pipetas bucales, excepto que hemos insertado un filtro de 0,2 micrones entre su boca y el lugar donde iría la pipeta. Esto simplemente garantiza la esterilidad.Permítanme demostrar cómo fabricar pipetas de boca. Me gusta elaborar una variedad de tamaños. Pueden obtener todas estas en VWR y prefiero fabricar diámetros de 10 microlitros, 50 microlitros y 100 microlitros.Ahora estoy utilizando un punzón de diamante para cortar el tubo de montaje. Para este primer paso, se desea un diámetro bastante grande porque se está manipulando el embrión completo. Los embriones de alta calidad seleccionados para la derivación se transfieren luego a través de tres gotas.Deje caer las gotas pasando de la primera a la segunda y luego a la tercera gota, donde la dejará y observará la disolución de la zap palita. Este proceso generalmente toma menos de 30 segundos, y realmente puede ver cómo la zop palita se va disolviendo. Cuando la zap palita se haya disuelto completamente.Los embriones luego se transfieren a través de tres gotas de lavado del medio de cultivo humano Es, pasando por la primera, segunda y tercera gota de lavado. A continuación, el embrión se transfiere a la gota del anticuerpo primario, pasando nuevamente de la primera a la segunda y luego a la tercera gota, donde se dejará durante media hora de incubación en el incubador de cultivo tisular. La lisis de la trifecta dérmica se hace evidente cuando se observa la formación de burbujas en las células de la parte externa del embrión. Este es el inicio de la lisis de las células dérmicas de la trifecta.Cuando la lisis sea evidente en todo el borde externo del embrión, entonces el embrión está listo para ser lavado a través de tres gotas de medio de cultivo humanus. Después de la inmunocirugía, los embriones se trituran mecánicamente utilizando una pipeta bucal de menor tamaño. Esta pipeta bucal debe tener un diámetro más pequeño que la primera pipeta, de modo que pueda hacer el proceso de trituración más eficiente para eliminar la trifecta lisada.Células dérmicas. Al final de la agitación mecánica, queda un grupo de células en el centro. Existe la masa celular interna, que está intacta.Alrededor de esto, hay muchas células dérmicas trifecta lisadas, así como algunas células dérmicas trifecta intactas. Este aislado de masa celular interna se coloca luego en un pocillo que ha sido preparado con una capa alimentadora de células embrionarias de ratón. La placa con la capa alimentadora se preparó la noche anterior, y esta mañana cambié el medio de cultivo de medio para fibroblastos embrionarios de ratón a medio para derivación de células madre humanas.El aislado de la masa celular interna se transfiere entonces desde las gotas de lavado tras el complemento a este pocillo que contiene las células de la capa de alimentación. Esta placa se devuelve luego al incubador y se deja intacta durante un par de días para permitir la adhesión del aislado de la masa celular interna. Este es un ejemplo de cómo se desarrolla el crecimiento externo.Cuando el crecimiento es lo suficientemente grande, podemos comenzar el primer pase dividiendo este crecimiento a la mitad. Ahora, han pasado 14 días desde la derivación original, y aquí se muestra un ejemplo de un crecimiento proveniente de una de nuestras derivaciones.Este es un ejemplo de un crecimiento de este tipo en el que hoy voy a separar la mitad del crecimiento. El crecimiento se dividirá en dos mitades y luego se cortará en trozos cuadrados, y cada uno de estos trozos se transferirá a un nuevo pocillo que contiene células alimentadoras. Es recomendable dejar intacta la mitad del crecimiento para tener una fuente continua de células a la que poder recurrir cuando sea necesario amplificar sus células y respaldar cualquier paso que realice.Para los primeros dos o tres subcultivos, es recomendable realizar el pase mecánico de esta manera y, eventualmente, adaptar las células a la disociación enzimática para un envasado más eficiente. Nuestro laboratorio obtiene de forma constante líneas de células madre embrionarias humanas para su uso y para comprender el desarrollo y la diferenciación.Estas líneas también se distribuyen a nivel mundial a investigadores de células madre. Considero que existen cuatro factores principales que afectan el éxito del aislamiento. El primero tiene relación con la calidad del embrión, la cual depende también del fondo genético, de la calidad con que los embriones fueron congelados y descongelados, así como de la calidad del cultivo in vitro hasta la etapa de aislamiento en el blastocisto.El segundo factor probablemente sea la integridad de la calidad de la masa celular interna tras el aislamiento, y esto puede depender de la técnica utilizada para aislar la masa celular interna, así como de la experiencia y habilidad. El tercer factor es la capacidad de adhesión de la masa celular interna aislada a las capas de alimentación, y el cuarto factor es la migración de este aislado de MCI. No creo que técnicamente sea un proceso difícil.Solo se necesita un poco de práctica. De hecho, cada paso es bastante sencillo, por lo que, siempre que se siga el protocolo, con un poco de práctica creo que cualquiera puede hacerlo. Lo que hemos encontrado en el laboratorio es que cada línea es un poco diferente por razones que no comprendemos del todo.Por ejemplo, si se fuera a evaluar el potencial de diferenciación de 10 líneas, quizás dos o tres de esas líneas tengan mayor probabilidad de desarrollarse en el tipo de célula que le interesa. Sospecho que estas diferencias están relacionadas con la etapa en la que se encontraban las células, es decir, la etapa del embrión de la cual se derivaron las líneas de células madre embrionarias, así como con el manejo manual de estas células. Considero que sus propiedades cambian a veces la heterogeneidad de las líneas celulares y que su potencial es algo que todo investigador de células madre debe tener en cuenta.Nuevamente, no sé qué causa esto, pero ciertamente, como ejemplo en mi investigación, nuestro objetivo final consiste en generar células beta productoras de insulina del páncreas. El primer paso para crear este tipo de línea celular es generar endodermo a partir de células madre embrionarias, y en una comparación entre 10 y 20 líneas, descubrimos que una o dos de estas líneas pueden generar endodermo de manera eficiente, mientras que la mitad de ellas tal vez lo generan con menor eficiencia, y algunas no logran generar endodermo adecuadamente. Por lo tanto, mediante este proceso inicial de selección, elegimos aquellas células que tienen una mayor tendencia a formar el tipo celular de interés, y continuamos con la diferenciación restante utilizando estos tipos celulares.La primera derivación de células madre embrionarias humanas fue reportada por Thompson et al. en 1998, y en 2004, nuestro laboratorio informó la derivación de 17 nuevas líneas de células madre embrionarias humanas. Al modificar estos protocolos publicados, y estas modificaciones consistieron simplemente en hacer el proceso de derivación más eficiente. Incluyen cambios en la composición del medio, en la forma en que se pasan las células y en cómo se congelan y descongelan.Desde entonces, en cada derivación, buscamos nuevas formas de mejorar el protocolo y la tasa de derivación. Por ejemplo, nuestro laboratorio está explorando maneras alternativas de aislar la masa celular interna, sin utilizar reactivos xenógenos como el anticuerpo de conejo o el complemento sérico de cobayo, sino diseccionando más bien mecánicamente la masa celular interna. Esperamos que estos métodos conduzcan a un método al menos comparable, si no mejor, para aislar la masa celular interna.

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Investigación

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Biología

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