Name: Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a evaluar rápidamente la generación de linfocitos T citotóxicos mediante transferencia adoptiva de células OT1 marcadas con CFSE en ratones. Este método permite determinar la capacidad de coadyuvantes en solo cuatro días.

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Estamos agradecidos a nuestros asistentes técnicos: Bröder U. y H. Shkarlet, que nos ayudaron durante procedimientos experimentales. Este trabajo fue financiado en parte por convocatoria (UniVax, contrato no. 601738 y TRANSVAC2, contratación Nº 730964) y una donación de la Asociación Helmholtz (HAI-IDR). Las fuentes de financiación no influyó en la investigación de diseño, generación del manuscrito o la decisión de presentar para su publicación.

Todos los ratones utilizados en este estudio fueron el fondo C57BL/6. Todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos fueron realizados según la normativa de la ley de protección animal alemán (TierSchG BGBl. S 1105; 25.05.1998) y fueron aprobados por el Comité de Sajonia inferior sobre la ética de los experimentos animales y la Oficina Estatal de baja Sajonia Estatal Oficina de protección al consumidor y seguridad alimentaria, bajo el permiso número 33.4-42502-04-13/1281 y 162280.
1. CFSE tinción de OT-I T las células y transferencia adoptiva
Nota: OT-los ratones son animales transgenically generados que expresan un receptor de célula T (TCR) con fijo α y β cadenas que reconocen a los péptidos inmuno-dominante de OVA, SIINFEKL10,11. Como resultado, estos ratones tienen un número considerablemente alto de CD8 específicas SIINFEKL+ T las células (97%)12 en comparación con ratones normales o vacunados de OVA (≤ 1%)13.
<ol><li>Aislamiento de trazabilidad CD8+ T células de OT-los ratones que expresaban el linfocito T específico Thy1un (Thy1.1) alelo:<ol>
<li>Eutanasia de OT 6-9 semanas de edad-ratones por la inhalación de CO2 seguido por dislocación cervical14. Disecar el bazo y ganglios linfáticos principales (sólo pares inguinales, axilares y cervicales) cortando la piel con tijeras quirúrgicas, separar la piel del cuerpo con la ayuda de pinzas quirúrgicas y fórceps y colocar en cajas Petri (60 x 15 mm) cada uno con un 100 μm poro malla taza para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido.</li>
		<li>Mantener platos de petri (cada uno con malla de una taza) en 3-5 mL de Medio RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 μg/mL) en hielo.</li>
		<li>Los órganos con la ayuda de un émbolo o un instrumento estéril similar el puré (corte previo no es necesario) y recoger la suspensión unicelular resultante en tubos de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Lavar las células en 10 mL de PBS frío mediante centrifugación y lisar los eritrocitos del bazo por volver a suspender el sedimento en 1 bazo mL de tampón de cloruro de amonio (tampón de ACK, comercialmente disponible). Incubar las células durante 1,5 min en hielo y posteriormente lavar las células con 10 mL de PBS frío por centrifugación (como antes).</li>
		<li>Vuelva a suspender el sedimento en el mismo tubo en 1 mL de PBS (pH 7.2) que contiene 5% suero bovino fetal de un aislamiento electromagnético.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para realizar el aislamiento magnético, proceder a la selección negativa de CD8+ T las células utilizando un kit de aislamiento magnético según las instrucciones del fabricante o publicado protocolos15.</li>
	<li>Para realizar la tinción de la CFSE, contar primero el número de CD8+ T las células obtienen de OT-I ratones utilizando un contador de células automatizado (contador de partículas). Mancha 1-5 x 107 células/mL en un volumen de 1 a 5 mL con 5 μm CFSE en PBS durante 7 minutos a 37 ° C, protegido de la luz en un tubo falcon de 15 ml.</li>
	<li>Sacian la CFSE tinción añadiendo el mismo volumen (1:1) de suero fetal bovino a las células e Incube por adicional 7 min a 37 ° C, protegido de la luz. Lavar las células con 10 mL de PBS dos veces.</li>
	<li>Contar las células usando un contador de células automatizado. Establecer el número de células al 3-5 x 107 células/mL de PBS para inyectar por vía intravenosa 3-5 x 106 células/ratón de 100 μl (i.v.) a través de la vena de la cola.</li>
	<li>Para realizar inyecciones de vena de la cola, inmovilizar los ratones en restrainers apropiados. Caliente la zona de la espalda y la cola de los ratones que se inyecta usando una lámpara de luz roja, entre 20 a 25 cm de los ratones por 1-3 min permitir la vasodilatación de la vena de la cola. Nota: Esto ayuda a facilidad vena detección y administración de la suspensión de células.</li>
	<li>Asegurar (con la mano colocada entre la lámpara y los ratones) que no es demasiado caliente para los ratones y cuando las venas de la cola son claramente visibles, proceder a la inyección. Inyectar las células en la vena lateral o dorsal de la cola utilizando una jeringa de 1mL con aguja de calibre 2516.</li>
</ol>2. inmunización (Endo-libre OVA +/-adyuvante)
<ol><li>Colocar los ratones transplantados con OT-I (paso 1.7, figura 1) de las células en una cámara de anestesia y administrar isoflurano en oxígeno por una máquina de anestesia14.</li>
	<li>Cuando el ratón está totalmente dormido bajo anestesia, sacar de la cámara y afeitarse la piel del ratón en el área sobre los superficialis de los glúteos (zona lumbar lateral) mediante el uso de una máquina de corte de pelo eléctrico, con el fin de realizar una inyección limpia con una buena vista de la zona de aplicación.</li>
	<li>Inyectar 50 μl de la vacuna, s.c. en el área depilado con una aguja de calibre 25.</li>
</ol>3. aislamiento de linfocitos y de tinción para análisis de citometría de flujo
<ol><li>Aislamiento de linfocitos y esplenocitos<ol>
<li>Eutanasia a los ratones vacunados por CO2 inhalación seguida por dislocación cervical.</li>
		<li>Extraer los ganglios linfáticos de drenaje y distantes y bazo y colocar en cajas Petri separadas que contienen 100 μm poro malla tazas para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido. Siga los pasos de 1.1.2 a 1.1.3.</li>
		<li>Decantar el sobrenadante después de centrifugación y vuelva a suspender los pellets de células en el mismo volumen de PBS del remanente (aproximadamente 100 μL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tinción para análisis de citometría de flujo<ol>
<li>En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una mezcla principal que contiene los anticuerpos tinción en las concentraciones que se muestra en la tabla 1, así que rinde 2 x concentrado mezcla de tinción. Prepare suficiente volumen de mezcla principal a 100 μl por muestra. Mezcle las células y el maestro mezcla 1:1 e incubar a 4° C por 30 minutos. Nota: El volumen final de la tinción por muestra debe 200 μl (100 μl de células pellet + 100 μl de la mezcla principal anticuerpo).</li>
		<li>Lavan las células dos veces por centrifugación como se describe en 1.1.3, agregar 10 mL de PBS, dos veces.</li>
		<li>Resuspenda las células en 0.5-1 mL de PBS para la adquisición y transferencia de la suspensión a los tubos de citómetro de flujo. Siempre mantenga las muestras en hielo y protegidos de la luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. citometría de flujo
<ol><li>Siempre prefiltro las muestras de células mediante filtros de 70-100 μm.</li>
	<li>Preparar solo tinción controles de compensación para los fluoróforos detallados en la tabla 1 (granos o células). Nota: Compensación debe ser realizada en citómetro o análisis software17,18,19 y aplicada a todas las muestras.</li>
	<li>Seguir la estrategia bloquea representada en la figura 2. Brevemente, poblaciones de la puerta en altura de dispersión hacia adelante frente a la zona de dispersión hacia adelante (figura 2A) y otra vez dispersión lateral amplia vs área de dispersión lateral (SSA, figura 2B) para excluir dobletes.</li>
	<li>Puerta de la población de figura 2B trazando BV 650 (auto-fluorescencia) vs FITC (CFSE) para discriminar la CFSE verdadero manchados células de células auto-fluorescente alta. Incluir granos o células teñidas con anticuerpos conjugados a 650 de BV en controles de compensación. Este diagrama (figura 2) de 650 BV vs FITC se utiliza para el OT de la puerta-me CFSE manchadas las células.</li>
	<li>Puerta de la población de figura 2 C Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) para distinguir las células derivadas de donantes vs ratones receptores. Nota: Células derivadas de OT-I ratones donantes son Thy1.1+ (CD90.1), mientras que WT (C57BL/6, destinatarias) ratones las células derivadas son Thy1.2+ (CD90.2) (Figura 2D). Algunos laboratorios tienen OT-I ratones en un fondo de Thy1.2 y WT (C57BL/6) en un Thy1.1. En este caso tienes que usar un anticuerpo contra Thy1.2 para OT-célula de control.</li>
	<li>Volver a puerta CD8 de las células de población Thy1.1+ + trazando en una puerta que comprende 450 BV (CD4) y APC (CD8) (Figura 2E).</li>
	<li>Mostrar la población cerrada en Figura 2E mediante el uso de una pantalla de histograma de los CD8+ células mostrando CFSE (FITC, canal 530/15 - láser azul-), la puerta la población proliferada incluyendo intensidades de 102 hasta el nivel donde las poblaciones de control son (intensidades ~ 105, dependiendo de la eficacia de la tinción de CFSE y el ajuste de la tensión en el citómetro de flujo) (figura 2F).</li>
	<li>Hacer un puerta adicional (no se muestra en la figura 2) trazado marcador FITC vs L/D (450/20 canal, láser UV) con el fin de evaluar las células muertas en paralelo a la evaluación de la proliferación.</li>
	<li>Adquirir por lo menos 5000 eventos para los controles de compensación y 10,000 eventos (puerta E, figura 2) de las muestras en un citómetro de flujo. Ejecutar el citómetro de flujo de baja o media (no exceder las tasas de flujo de 20.000 eventos/s).</li>
</ol>

<ol><li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li>
<li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD8%2B+T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8%28%2B%29-T-cell+responses+to+DNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li>
<li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+CD8%28%2B%29+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li>
<li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective%2C+immunopathogenic%2C+and+immunoregulatory+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li>
<li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines%3B+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li>
<li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+vaccine-enhanced+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li>
<li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFN+and+not+TNF%2C+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li>
<li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-%283%27%2C5%27%29-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate%3A+strong+Th1%2FTh2%2FTh17+promoting+mucosal+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I%3A+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li>
<li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive%2C+acutely+activated%2C+and+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+of+CD8%2B+T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li>
<li>Otto, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtto%2C+K+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li>
<li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).</li>
<li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li>
<li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li>
<li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li>
<li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+immunology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+CD8%28%2B%29+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion%3A+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li>
<li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li>
<li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li>
<li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8%2B+T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li>
<li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li>
<li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity%3A+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las vacunas modernas son idealmente composedof antígeno purificado y adyuvantes, con la posible adición de un sistema de entrega como liposomas, virus-como partículas, nanopartículas o vectores vivos. Un aspecto clave en el diseño de una vacuna es elegir el adyuvante adecuado según las necesidades clínicas. Parte del ámbito podría implicar favoreciendo una humoral y respuesta inmune celular (o ambos), la elección de un local frente a una respuesta inmune sistémica (o ambos) y el tipo de memoria que la vacuna debe generar...

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que las vacunas son fundamentales intervenciones terapéuticas que se han desarrollado para luchar contra a ciertos tipos de cáncer1. También son importantes las vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares2CTL. Por otra parte, CTL son uno de los pocos mecanismos de defensa inmunes funcionalmente activos en poblaciones de riesgo como neonatos3,4 quien también dependen de CTL para luchar contra la temprana vida infecciones5. En este sentido, las vacunas contra el Virus sincitial respiratorio (VSR) que fueron desarrolladas con un adyuvante que no provocan respuestas CTL (alumbre) resultaron en un fracaso de la vacuna lleva a serias complicaciones con infecciones en recién nacidos6. Estos efectos negativos de la vacunación pueden invertirse por una CD8+ de respuesta de la célula de T7. Previamente hemos demostrado que las citoquinas principales (tipo interferones de I) sacadas por algún estimulador de agonistas (aguijón) los genes de interferón son esenciales para las respuestas CTL generadas por estos adyuvantes8, en parte por la medición de la proliferación de OT-I T las células después de la vacunación y usar estos resultados como una medida de CTL inducen las capacidades observadas en extendieron vacunación horarios9. La medición de la proliferación de OT-I CD8+ T las células en un ratón receptor de tipo salvaje (WT) C57BL/6 por carboxyfluorescein succinimidyl tinte de éster (CFSE) dilución es una estimación robusta de la capacidad de los adyuvantes de una vacuna para generar reactividad cruzada de SIINFEKL, (el péptido inmuno-dominante de ovoalbúmina, óvulos). Variaciones de esta técnica están ampliamente utilizadas para la evaluación de la proliferación de OT-I CD8+ y OT II CD4+ T las células. Por ejemplo, se ha utilizado en la ausencia de las citoquinas (ratones KO) o para medir la eficacia de la vacuna después de memoria del antígeno en animales de peso. Ideamos un protocolo corto (4 días experimento) en el que después de la transferencia pasiva de OT CFSE-manchado-I CD8 células+ T, una vacunación subcutánea de (s.c.) que consiste en una dosis de 50 μg de huevos libres de endotoxinas complementado con adyuvantes de la prueba se administra (Figura 1). El seguimiento de los resultados 48 horas después de la vacunación proporciona una prueba confiable de la capacidad de los adyuvantes para generar respuestas CTL. Por esta estrategia, es posible evaluar la potencia de la respuesta inmune local en el nodo de linfa de drenaje después de la inmunización, así como la magnitud de la respuesta mediante la medición de la actividad CTL en el bazo (o los ganglios linfáticos distantes).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Analizador de células</td><td>BD</td><td>Citómetro de flujo</td>de <td>pedido especial</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sondas moleculares</td><td>C34554</td><td>Tinte de proliferación</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Beads y anticuerpos para la selección negativa de linfocitos T CD8 intactos.</td></tr><tr><td>Kit de tinción de células muertas azules fijables LIVE/DEAD, para excitación UV</td><td>Sondas moleculares</td><td>L23105</td><td>Marcador de células muertas</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Anticuerpo monoclonal (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>Anticuerpo eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>APC anti-ratón CD8a Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>BV421 Rata Anti-Ratón CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Z2 coulter Analizador de tamaño y recuento de partículas</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Contador de células. Z2 Contador automatizado de partículas/células</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovoalbúmina (10 mg)</td><td>Hyglos(Alemania)</td><td>321000</td><td>Ovalbúmina libre de endotoxinas probado.</td></tr><tr><td>Filtro de celdas 100&micro; m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Colador de células (100 &micro; Copas de malla de poros M).</td></tr><tr><td>Viales de muestra</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Viales de muestra para ratones con contador automático Z2</td></tr><tr><td>C57BL/6 (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Alemania)</td><td></td><td>La empresa ahora es Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 antecedentes, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Alemania)</td><td></td><td>Endogamia en nuestro centro de animales. Empresa de donde se adquiere ahora Envigo</td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Tubos de poliestireno de fondo redondo</td></tr><tr><td>Falcon Tubos de 15 mL</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Tubos de centrífuga cónicos PBS</td></tr><tr><td>(500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7.2</td></tr><tr><td>Lámpara roja (lámpara de calefacción)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Alemania)</td><td>405096</td><td>Lámpara calefactora (100 wats)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurano)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Anestésico isoflurano (matraz de 250 mL).</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia de mesa/Máquina de anestesia móvil con absorbente de CO2</fuerte></td><td>Parkland Scientific</td><td></td><td>V3000PK Máquina de anestesia de isoflurano.</td></tr><tr><td>Medio RPMI 1640</td><td>Gibco (distribuido por ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Medio base con glutamina (500 mL)</td></tr><tr><td>Solución antibiótica Pen-Strept (Gibco)</td><td>Gibco (distribuido por ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>Suero fetal de Bobine (Gibco)</td><td>Gibco (distribuido por ThermoFischer)10082147</td><td></td> <td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen de EE. UU.</td></tr><tr><td>Tampón de lisis ACK (100 ml)</td><td>Gibco (distribuido por ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Tampón de lisis de sangre entera de cloruro de amonio potásico, adecuado para la lisis de eritrocitos en suspensiones de bazo también</td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>Nunc (distribuidas por ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>Placa de Petri de plástico de 60 x 15 mm, filtro de</td></tr><tr><td>aglomeración de células</td> no tratadas <td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&reg; 50 &mu; m, estéril</td></tr></tbody></table>

rápida in vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos t citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

La evaluación de las vacunas de subunidad moderna revela que la generación de anticuerpos neutralizantes es importante pero no suficiente para la selección del adyuvante. Por lo tanto, están urgente adyuvantes con capacidades inmuno-estimuladora humorales y celulares que son capaces de promover respuestas citotóxicas de los linfocitos (CTL) T. Así, el fiel seguimiento de candidatos de adyuvante que inducen reactividad cruzada y posteriormente aumentar la generación de CTL representa un paso crucial en el desarrollo de una vacuna. Aquí presentamos una aplicación de un método que utiliza SIINFEKL específicos (OT-I) las células T para controlar la presentación cruzada del modelo antígeno ovoalbúmina (OVA) en vivo en la presencia de candidatos de diferentes adyuvantes. Este método representa una prueba rápida para seleccionar adyuvantes con las mejores capacidades de reactividad cruzada. La proliferación de CD8+ T las células es la más valiosa indicación de reactividad cruzada y también es considerado como un correlato de presentación cruzada inducida por adyuvante. Esta característica puede ser evaluada en diversos órganos inmunes como los ganglios linfáticos y el bazo. También puede supervisar el grado de la generación de CTL, que dando ideas sobre la naturaleza de un local (nodo de linfa de drenaje principalmente) o una respuesta sistémica (distante de los ganglios linfáticos o bazo). Esta técnica además permite múltiples modificaciones para probar fármacos que pueden inhibir vías específicas de presentación cruzada y también ofrece la posibilidad de ser utilizado en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente y convencionales. En Resumen, la aplicación que presentamos aquí será útil para los laboratorios de la vacuna en la industria o la academia que desarrollaran o modificar químicos adyuvantes de la vacuna investigación y desarrollo.

Para probar los tratamientos utilizando una combinación diferente de los adyuvantes (ADJ1 y ADJ2), hemos evaluado la capacidad de generación de CTL midiendo la proliferación de OT eventualmente transferido-I CD8+ T las células mediante citometría de flujo (figura 2). Para esto, hemos manchado previamente células aisladas de los ganglios linfáticos y bazo (tabla 1) drenaje. Mediante la medición de la proliferación de CD8+...

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

El objetivo general de este experimento es determinar la capacidad de los adyuvantes de interés para generar linfocitos T citotóxicos mediante el seguimiento de la proliferación de linfocitos T positivos OT1 CD8 teñidos con CFSE transferidos adoptivamente en los ganglios linfáticos drenantes y el bazo de animales receptores inmunizados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la vacunología, como la potencia de un adyuvante para generar una respuesta celular de citotoxicidad. La principal ventaja de esta técnica es que se puede determinar no solo la capacidad CTL de un adyuvante, sino también si esta es local o sistémica y se puede hacer solo en cuatro días.La comprobante del procedimiento estará a cargo de una técnica de nuestro laboratorio, Elena Reinhard. Para aislar las células T CD8 positivas para el muslo 1.1 de ratones OT1, primero se extrae el bazo y los ganglios linfáticos inguinales, axilares y cervicales de acuerdo con los protocolos estándar, colocando todos los órganos en un colador de malla de poros de 100 micrómetros en una placa de Petri de 60 milímetros que contiene de tres a cinco mililitros de medio completo en hielo por ratón a medida que se recolectan. No recoja en bazos o ganglios linfáticos grandes de OT1 porque las células T de estos tejidos linfáticos pueden ser leucémicas y proliferar incluso sin estimulación, lo que confunde los resultados del ensayo.Cuando se hayan recuperado todos los órganos de cada animal donante, utilice un émbolo de jeringa para triturar las muestras a través del filtro de malla y transfiera las suspensiones individuales resultantes a un tubo cónico de 15 mililitros por ratón. Granular las células por centrifugación, seguido de un lavado por centrifugación en 10 mililitros de PBS frío. Lise la pastilla de glóbulos rojos en un mililitro de tampón de cloruro de amonio por tubo en hielo.Después de 90 segundos, lave las células en otros 10 mililitros de PBS y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS más 5% de FBS por tubo. A continuación, utilice un kit selectivo negativo para aislar los linfocitos T CD8 positivos de acuerdo con los protocolos estándar de aislamiento de perlas magnéticas y cuente el número de linfocitos T CD8 positivos clasificados con perlas magnéticas. A continuación, diluya las células T de una a cinco por 10 a la séptima célula por mililitro de concentración de PBS en tubos cónicos individuales de 15 mililitros y tiña cada muestra de células con cinco micromolares CFSE durante siete minutos a 37 grados Celsius y protegidas de la luz.Al final de la incubación, apague la reacción de tinción con un volumen igual de FBS y devuelva las células a una incubadora a 37 grados Celsius durante siete minutos adicionales. Al final de la segunda incubación, lave las células dos veces en 10 mililitros de PBS por lavado y vuelva a suspender las células en volúmenes de tres a cinco por 10 hasta la séptima célula por mililitro de PBS. Para la transferencia adoptiva de las células T OT1 marcadas con CFSE, cargue las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 25 por muestra de células experimentales e inmovilice el primer ratón receptor en un retenedor.Luego, cuando las venas de la cola se hayan vasodilado, libere 100 microlitros de células a través de la vena lateral o dorsal de la cola. Para la inmunización de los animales transferidos adoptivamente, se afeita el pelaje sobre el glúteo superficial del ratón trasplantado de células T OT1 y se utiliza una aguja de calibre 25 para inyectar subcutáneamente 50 microlitros de OVA libre de endotoxinas en la zona afeitada. Es importante usar OVA libre de endotoxinas porque los rastros de endotoxina en OVA pueden llevarlo a resultados falsos.Cuarenta y ocho horas después de la inmunización, se extraen los ganglios linfáticos inguinales y el bazo de cada animal receptor de acuerdo con los protocolos estándar y se generan suspensiones individuales de células individuales para cada muestra de ganglios linfáticos y bazo, como se acaba de demostrar. Recoja las células por centrifugación y resuspenda los gránulos en 100 microlitros de PBS por muestra. Para teñir las muestras para el análisis por citometría de flujo, incube las células con 100 microlitros de cóctel de mezcla maestra de anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Al final de la incubación, lavar las células dos veces en 10 mililitros de PBS y volver a suspender las muestras en 0,5 a un mililitro de PBS por tubo. Filtre las células a través de filtros de 70 a 100 micrómetros en tubos de análisis de citometría de flujo de cinco milímetros y adquiera los controles de compensación de tinción individuales, así como las muestras en el citómetro de flujo. Para compuerta las muestras, abra un diagrama de altura de dispersión directa frente a área de dispersión directa y un diagrama de dispersión lateral amplia frente a área de dispersión lateral y puerta para excluir los dobletes.Genere un gráfico de FITC frente a autofluorescencia para discriminar la población de células verdaderamente teñidas con CSFE de las células con alta autofluorescencia. Compruebe estas células teñidas con CSFE OT1 como las poblaciones que se extienden principalmente en el eje FITC. Para distinguir las células derivadas de animales donantes frente a las receptoras, se deben controlar las células T 1,1 más CD90 y 0,1 más CD8 más CD8 y volver a dirigir la población de CD8 más para excluir las células T CD4 más CD4.A continuación, muestre esta población de células T CD8 proliferadas en un histograma de acuerdo con su expresión de CSFE y dirija las poblaciones proliferadas desde una intensidad de 10 a la segunda hasta la intensidad de la población de control indivisa. Adquiera al menos 5.000 eventos para los controles de compensación y 10.000 eventos para cada muestra a una tasa de análisis de flujo baja o media. En este experimento, dos grupos de ratones fueron vacunados con uno de dos adyuvantes diferentes.Los ratones a los que se inyectó OVA más el segundo adyuvante mostraron una mayor capacidad de generación de células T citotóxicas localmente en los ganglios linfáticos drenantes en comparación con los ratones inyectados con el primer adyuvante más OVA, OVA solo o la vacuna de control PBS. Por el contrario, en los ratones inyectados con el segundo adyuvante más OVA no generaron una respuesta de células T citotóxicas en un compartimento sistémico, mientras que las células T CD8 positivas aisladas del bazo de los ratones adyuvante uno más OVA mostraron niveles más altos de proliferación que las células T esplénicas CD8 positivas aisladas de OVA solo, control de PBS y adyuvante dos más animales vacunados con OVA. Una vez dominada, esta técnica permitirá determinar la capacidad CTL de una molécula adyuvante mediante el uso de antígeno OVA en tan solo cuatro días de trabajo.Después de realizar esta técnica, podrá aplicar aún más todas las demás técnicas a las células T aisladas y luego fenotipar el perfil de citocinas o el perfil metabólico de la respuesta CTL de su adyuvante.

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Investigación

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Medicine

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Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

El video muestra un método inmunológico para monitorear in vivo la producción de linfocitos T citotóxicos o CTL inducidos por adyuvantes. A un ratón se le inyectan previamente linfocitos T CD8+ de donantes modificados genéticamente, teñidos con colorante proliferativo. La inyección subcutánea de ovoalbúmina con adyuvantes genera linfocitos T CD8+ citotóxicos que se identifican después de la cosecha mediante inmunotinción y citometría de flujo.

Una técnica inmunológica para monitorizar la generación de linfocitos T citotóxicos mediados por adyuvantes

La capacidad de controlar las respuestas de células T en detalle en vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune. Aquí se describe el uso de conjuntos de blancos fluorescentes (TLC) en un ensayo in vivo de células T en el que evalúa&gt; 250 parámetros simultáneamente por citometría de flujo.

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Presentamos una demostración del modelo de recuperación cutánea de ampolla de succión. El modelo permite un fácil acceso a estudiar humano en vivo respuesta inmune adaptativa, por ejemplo en el contexto del desarrollo de una vacuna.

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Procedimientos experimentales para la posterior extracción de los tejidos linfáticos para probar la activación de las células dendríticas linfoides se describen después del tratamiento de un nanomaterial inmunoestimulante.

Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.

Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo

La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Aprende a evaluar rápidamente la generación de linfocitos T citotóxicos mediante transferencia adoptiva de células OT1 marcadas con CFSE en ratones. Este método permite determinar la capacidad de coadyuvantes en solo cuatro días.

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Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

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