Name: Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a reorganizar la estructura de bucles de cromatina usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9) para estudiar la regulación génica. Este método permite modular reversiblemente la expresión génica en diversos tipos celulares.

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Agradecemos a H. Chang, T. Oro, Tavazoie S., R. Flynn, P. Batista, E. Calo y todo Wang laboratorio de asistencia técnica y lectura crítica del manuscrito. S.L.M. ha recibido el apoyo en este trabajo a través de la NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) y el Instituto Nacional del cáncer (1F99CA222541-01). K.C.W. es apoyada por un premio de carrera para los científicos médicos de la Burroughs Wellcome Fund y es Donald E. y Delia B. Baxter Fundación Facultad erudito.

1. gRNA diseño
<ol><li>Seleccione una herramienta de diseño de gRNA estándar para el diseño de la guía RNAs10. Utiliza pares complementarios de CLOuD9 construcciones previamente desarrollados9 (es decir, construyen al menos 1 S. aureus (CSA) y 1 S. pyogenes (CSP)) para cada experimento.<ol>
<li>Dentro de la herramienta de diseño en línea seleccionados, utilice la secuencia Protospacer motivo adyacente (PAM) "NGG" con una longitud de guía de 20 bp para CSP y el PAM de la secuencia "NNGRRT" con una longitud de guía de 21 para CSA.</li>
		<li>Guías basadas en la especificidad de elegir marcar y diseñar guías en ambos filamentos para maximizar las posibilidades de obtener una guía de trabajo.</li>
		<li>Orden 2 oligonucleótidos por guía un oligo fabricante: para el oligo forward, agregar "caccg", en el extremo 5' de la secuencia de la guía y para la inversa oligo, añadir "aaac" al "c" para el extremo 3' y 5' el extremo antes de ordenar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicialmente, el diseño gRNAs 3-5 para cada región de interés, sobre una región de bp 250-1000. Evaluar la gRNA dirigidos a eficiencia como sigue:<ol>
<li>GRNAs clon identificado en un plásmido de Cas9 activa (ver paso 3) y transitoriamente transfectar en células 293T (ver paso 4)11.</li>
		<li>Cultivar células de 2-3 d en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (strep de pluma), cosecha y extracción de ADN genómico12.</li>
		<li>Amplificar regiones específicas por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Ejecutar los productos en gel de agarosa al 1.5% y purificar bandas adecuadas.</li>
		<li>Realizar un análisis de endonucleasa de T7 como se describe en el Guschin, et al. Protocolo13,14. Nota: Guías eficientes son los determinados para cortar el ADN en el sitio de destino.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultivo celular
<ol><li>Mantener las células sanas y dividiendo activamente el estado.<ol>
<li>Para K562s, cultura en medios de comunicación Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 10% de SBF y el 1% pluma de strep.<ol>
<li>Crecer K562s en un matraz de cuello inclinado de 25 cm2 para el mantenimiento y ajuste de la densidad celular a 400.000 células por mL cada día.</li>
			<li>Después de K562s han sido transduced con CLOuD9 construye, añadir 2 puromicina μg/mL y 100 de μg/mL Higromicina a los medios de mantenimiento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para 293Ts, cultura en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 10% de SBF y el 1% pluma de strep.<ol>
<li>Crecen 293Ts en placas de 10 cm2 y dividir al confluente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. el plásmido preparación y gRNA inserción15
Nota: Mapas de plásmidos están disponibles en el apéndice y cartillas utilizadas en los experimentos de ejemplo están disponibles en la tabla adicional 1.
<ol><li>Mezcla 5 μg de plásmido CRISPR lentivirales con 3 μl de BsmBI, 3 μl de fosfatasa alcalina, 6 μl de 10 x Buffer y 0,6 μl de recién preparada 100 mM TDT. El volumen total a 60 μL con ddH2O e incubar a 37 ° C por 30 minutos digerir y dephosphorylate el plásmido.</li>
	<li>Gel purifican el plásmido digerido y eluir en ddH2O.</li>
	<li>Mezclar 1 μl de cada una de las guías sincronizadas de 100 μm con 1 μl de 10 x Buffer de ligadura de T4, 6,5 μl del ddH2O y 0,5 μl PNK T4, para alcanzar el volumen total de 10 μl. Incubar a 37 ° C durante 30 min, luego de 95 ° C por 5 min, luego la rampa hasta 25 ° C a 5 ° C por minuto. Nota: Esto recuece el par de guías.</li>
	<li>Diluir el recocido guías (paso 3.3) 1: 200 en ddH2O.</li>
	<li>Mezclar 1 μl del plásmido digerido del paso 3.2 con 0,5 μl de las guías ligadas diluidas del paso 3.4, 2.5 μl de 2 x de Buffer, 1 μl de ddH2O y 0,5 μl de ligasa, para hacer una reacción total 5.5 μl. Esto incubar a temperatura ambiente durante 10 min a ligar a las guías para el plásmido digerido BsmBI.</li>
	<li>Transformar el plásmido recientemente ligado de paso 3.5 en bacterias Stbl3 y amplificar usando cualquier método de preparación de plásmido.</li>
</ol>4. lentivirus producción
<ol><li>Cuenta 750.000 293T células por pozo para un pozo de seis placa usando un hemocitómetro y les semilla en DMEM con 10% de SBF y el 1% pluma de strep. Utilice un pocillo para cada construcción.</li>
	<li>24 h después de la siembra, cambiar los medios de comunicación a fresco sin antibióticos DMEM con 10% FBS.</li>
	<li>En un tubo, diluir 11 μl de reactivo de transfección basada en lípidos con 150 μL del medio OptiMEM, por reacción11.</li>
	<li>En un tubo aparte, diluya 2 μg de plásmido vector lentivirales CLOuD9 de paso 3.6 0.35 μg pMDLg/pRRE, 1 μg de pRSV-Rev y 0,65 μg de pMD2.G con 150 μL del medio OptiMEM, por reacción11.</li>
	<li>Para cada reacción, añadir las mezclas diluidas plásmido lentivirales para el reactivo de transfección basada en lípidos diluidos en una proporción 1:1 e incubar durante 5 minutos11.</li>
	<li>Agregar todo el volumen de cada complejo mixto de paso 4.5 en los pocillos respectivos de las células 293T sin antibióticos en el paso 4.2.</li>
	<li>48 h más tarde, recoger los medios de producción viral por pipetear en un tubo de fresco y vuelta abajo a 300 x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, pasar el sobrenadante a un tubo nuevo para eliminar restos de células residuales.</li>
	<li>Los medios de producción viral inmediatamente para la transducción de las células diana o congelar a-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol>5. lentivirus Transduction de las células
<ol><li>Añadir 250 μl de cada construcción viral de interés (compuesto por plásmidos de CLOuD9 complementarios) a un tubo cónico de 15 mL que contiene células de 80.000 para la aplicación de CLOuD9.</li>
	<li>Llevar el volumen total de los medios de comunicación en cada uno cónico de 1 mL con medio libre de antibiótico y añadir polibreno a una concentración final de entre 1-8 μg/mL (la concentración máxima de polibreno tolerado por el tipo de célula utilizado tendrá que ser determinado experimentalmente).</li>
	<li>Girar las células a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente, luego resuspender mediante pipeteo sin retirar el sobrenadante viral. Pasar la suspensión de toda la célula a una placa de cultivo celular.</li>
	<li>24 h post-transducción de señales, las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire viral sobrenadante y resuspender las células en medios de cultivo celular regular.</li>
	<li>Al día siguiente, añadir puromicina (1 μg/mL para las células 293T) e Higromicina (25 μg/mL para las células 293T) al medio de cultivo celular para seleccionar células transduced doblemente. Determinar experimentalmente las concentraciones apropiadas de puromicina e Higromicina para un tipo celular determinado antes de comenzar los experimentos.</li>
	<li>Mantener las células en medios de selección de al menos 3 d antes de cualquier posteriores experimentos y mantener en los medios de selección para la duración de todos los experimentos.</li>
</ol>6. dimerización y lavado hacia fuera de la célula
<ol><li>Añadir 1 mM de ácido abscísico (ABA) o un volumen equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO) para controles de cultivo celular que dimerizan la CLOuD9 seleccionado y transduced las células. Usar ABA dentro de 6 meses de la fecha de recepción, mantener frío y proteger de la luz a lo largo de uso. 2 mM ABA puede utilizarse si es necesario.<ol>
<li>Cambiar diariamente los medios de comunicación fresco ABA (o DMSO para los controles) para la duración de los experimentos. Nota: No hay límite en la longitud de la dimerización se ha observado todavía.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revertir la dimerización a través de la eliminación de los medios de comunicación que contiene ABA y lavar las células con suficiente tamponada fosfato salina (PBS) para cubrir la superficie de la placa, dos veces. Después de eso, células en cultivo en medios libres de ABA para mantener un estado sin dimerized.</li>
</ol>7. inmunoprecipitación y Co-immunoprecipitations
Nota: Hacer todas las memorias intermedias fresco e inmediatamente antes de su uso.
<ol><li>Tras la realización de experimentos de dimerización, recoger y girar por las células, luego aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Reticulación y congelación de células<ol>
<li>Hacer un caldo fresco de formaldehído al 1% en PBS a temperatura ambiente utilizando materiales frescos. Por cada 2 millones de células, resuspender suavemente con 1 mL de formaldehído al 1% a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos, mientras gira. Nota: Utilizar un volumen mínimo de 10 mL para la reticulación células menos de 10 millones.</li>
		<li>Saciar el entrecruzamiento con la adición de glicina a una concentración final de 0,125 M, seguido por la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente, mientras gira.</li>
		<li>Desactivación de las células y lavar x 1-2 con PBS helado. Gránulos de la célula pueden ser complemento congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C o utilizados inmediatamente. Nota: Calor invertirá reticulaciones de formaldehído. Si prisa, las células pueden almacenarse directamente en-80 ° C sin congelar el cierre.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el conjugado de anticuerpo/grano Nota: Optimizando las condiciones para el anticuerpo elegido (es decir, pruebas de buffers diferentes lisis lisis celular y la realización de IP) pueden ser que vale la pena. Dos tampones comunes, tampón de lisis de Farnham y almacenador intermediario de RIPA modificado, pueden tener un efecto significativo sobre la IP eficiencia y eficacia de sonicación. Todas las composiciones de búfer pueden encontrarse en la Tabla de materiales. Además, tenga en cuenta que la cromatina sonicación puede tomar varias horas para completar.<ol>
<li>Resuspender los granos con un vórtex brevemente como apropiado para el anticuerpo solicitado.</li>
		<li>Transferir una cantidad apropiada de granos para el experimento a un tubo de 1,5 mL. Como punto de partida, utilice 20 μl de granos para cada 1 μg de anticuerpo. No añadir anticuerpo aún. Nota: Use 10 de μg de anticuerpo con 200 μL de granos para 1 mg de total lisado como punto de partida, a menos que se sabe que el anticuerpo es más o menos eficiente que esto implicaría. Para las proteínas de baja abundancia, esta relación puede necesitar ajustarse.</li>
		<li>Si se utiliza el tampón de lisis de Farnham, lavar 3 x en tampón de dilución de la propiedad intelectual. Si se utiliza el tampón de lisis RIPA, lavar 3 x en tampón de lisis RIPA.</li>
		<li>Resuspender los granos en un volumen final del mismo buffer de paso 7.3.3 (dilución de IP o almacenador intermediario RIPA) que es > 1 x y < 5 veces el volumen inicial. es decir Para el volumen de grano inicial μl 100, utilizar entre 100 y el volumen de resuspensión final de 500 μl.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo para granos lavados en una concentración adecuada. Para un buen anticuerpo HA o bandera al IP CLOuD9 construcciones, uso de anticuerpos a 1:50 (μg proteína: μg proteína lisada) e incubar entre 8 + h y durante la noche a 4 ° C, mientras gira. Por otra parte, incuban durante 2-4 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire el sobrenadante de granos y deseche.</li>
		<li>De perlas de lavado 3 veces con el tampón de lavado.</li>
		<li>Vuelva a suspender en un volumen mínimo de la memoria intermedia utilizada para la incubación con el anticuerpo (dilución de IP o almacenador intermediario RIPA). Mantener fría hasta combinar con lisado de proteínas.</li>
	</ol></li>
	<li>Someter a ultrasonidos cromatina<ol>
<li>Primero lyse las células con la adición de tampón al Pellet celular en hielo durante 10 minutos la hinchazón, sacudiendo las células cada pocos minutos para evitar colocar. Nota: Generalmente, 500 μl de tampón de la hinchazón se añade a células 25 millones y escala a partir de ahí, pero no uso a menos de 500 μl tampón para < 25 millones de células.</li>
		<li>Dounce manualmente hacia la derecha y hacia la izquierda, 13 cada uno.</li>
		<li>Núcleos de vuelta abajo a 4 ° C por 5 min a 1.500 x g. aspiración el sobrenadante totalmente y repita el procedimiento para retirar el sobrenadante restante a continuación, pesan el precipitado de células en mg.</li>
		<li>Agregar inhibidor de la proteasa al tampón de lisis de núcleos (Farnham buffer o RIPA buffer, por encima, elegir una).</li>
		<li>Añadir 10 cantidad de x de tampón de lisis de núcleos núcleos concentrados para suspender de nuevo (por ejemplo, añadir 1 mL de tampón de lisis de núcleos a una pelotilla de 0,100 g). Brevemente vortex y lyse durante 10 min en hielo. Nota: Tenga en cuenta el tamaño del tubo de sonicación. Volumen ideal a menudo es < 1 mL, las muestras pueden necesitar dividir si los gránulos son muy grandes.<ol>
<li>Para Co-IP, someter a ultrasonidos para solubilizar el material y saciar SDS a un nivel que permite la inmunoprecipitación con 2-3 volúmenes de tampón de dilución de los núcleos y, a continuación, proceda al paso 7.4.6. Anticuerpos muy sensibles, añadiendo más tampón de dilución para reducir la concentración de SDS. Nota: Sonicación de parada cuando borra lisado; cambia de un opaco, translúcido blanco a transparente. Mantener las muestras tan frío como sea posible y no sobre someter a ultrasonidos.</li>
			<li>Fondo para ChIP, someter a ultrasonidos ADN para obtener fragmentos de ADN de 150-1000 bp, luego proceda al paso 7.4.6.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugar material insoluble a la máxima velocidad durante 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferencia de material soluble a un tubo nuevo.</li>
		<li>Para Co-IP, medir la concentración de proteína y proceder a la desconexión en el paso 7.5.</li>
		<li>Para ChIP, sacar una alícuota de 10 μl de despejó lisado y agregar 40 μl de tampón de elución IP y 6 μl 5 M NaCl para que de un total de 56ul. Hervir durante 15 min a 95 ° C, añadir 5-10 μl de 3 M NaOAc pH 5 y limpiar en una columna de purificación de la polimerización en cadena. Medir la concentración de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm y estandarizar en las muestras. Luego proceder a la desconexión en el paso 7.5. Nota: Extra lisado puede snap congelado a-80 ° C y utilizar en un momento posterior, pero los mejores resultados se obtienen de la fresca lisada. Si la congelación, no congelar/descongelar más lisado de una vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Telecine<ol>
<li>Transferir una cantidad apropiada de proteína lisada a un tubo nuevo. Si se utiliza el tampón de lisis de Farnham, diluir en 2,1 volúmenes de tampón de dilución de la propiedad intelectual (arriba).</li>
		<li>Reservar 100 μl del sobrenadante para control de entrada y almacenar a 4 ° C hasta el día siguiente.</li>
		<li>Añadir grano/anticuerpo conjugado de paso 7.3.8 a muestras ahora.</li>
		<li>Rotar las muestras a 4 ° C durante la noche y asegurar que hay suficiente volumen de movimiento de líquidos en tubos de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar y eluir<ol>
<li>Después de la rotación durante la noche, guarde el sobrenadante como la fracción no vinculante. Luego lavar granos 3-5 veces en tampón de dilución de la propiedad intelectual.</li>
		<li>Preparar el tampón de elución de IP a temperatura ambiente, sin inhibidores.</li>
		<li>Complejos de eluir con 50 μl de tampón de elución agita en el vortex a 67 ° C mín. 15 transferencia de elución a un tubo nuevo y repita con el otro 50 μl. combinar ambos para una elución de 100 μl total. Nota: Si hay demasiado fondo de este procedimiento de elución, calor puede reducirse o eliminado durante la agitación/incubación. Esto generalmente reduce la producción de la proteína diana pero significativamente disminuir el fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Revertir vínculos cruzados por calefacción a 67 º C durante > 4 h. Nota: Esto no es estrictamente necesario para la IPs pero puede ser útil.<ol>
<li>Para Co-IP, para asegurar el completo dimerización entre los objetivos de interés, ejecutar eluatos en un gel de SDS-page y sonda con anticuerpos específicos contra la HA tag o etiqueta de la bandera, como se indica, todo en 1: 1.000. Luego continúe con el paso 8.</li>
		<li>ChIP-qPCR, para garantizar la correcta localización y focalización de cada componente CRISPR-dCas9, limpiar producto de elución en una columna y eluir en 10 μl. realizar en tiempo real cuantitativo reacción en cadena polimerasa (qPCR) de DNA purificado. Iniciadores utilizados en los datos presentados están disponibles en la tabla adicional 1. Luego continúe con el paso 8.</li>
	</ol></li>
</ol>8. ARN extracción y PCR cuantitativa
<ol><li>Para investigar los cambios inducidos por la CLOuD9 en la expresión génica, en primer lugar, aislar y purificar RNA total de control celular pellets y pellets dimerized celular.</li>
	<li>ADN complementario (cDNA) desde el RNA purificado por transcripción inversa17 y realizar análisis de qPCR. Cartillas están disponibles en la tabla adicional 1.</li>
</ol>9. ensayo de captura de conformación de cromosoma
<ol><li>Observar los cambios en la frecuencia de los contactos de los loci genómicos inducida por CLOuD9, realizar captura de conformación del cromosoma (3C) ensayos de8.</li>
	<li>Cuantificar los productos de 3C ligadura en dos conjuntos de duplicados para cada una de las tres réplicas biológicas por PCR cuantitativa en tiempo real. Normalizar las muestras a las señales de 3C de lo locus de tubulina. Cartillas están disponibles en la tabla adicional 1.</li>
</ol>

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<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

The Most son pasos críticos en bucles de cromatina de CLOuD9: 1) el diseño o utilizando el correcto gRNAs, 2) cambiante media diaria en las células transduced CLOuD9, incluyendo ABA o DMSO, 3) mantener la frescura de la ABA y 4) realizar evaluaciones precisas y cuidadosas de conformación de la cromatina.
Los límites de CLOuD9 residen principalmente en la habilidad de diseñar guías de la región de destino de elección. RNAs guía realizan la importante tarea de localizar los componentes de la dCas9 a regiones de ADN blanco para ser dimerized y la eficacia de las guías se basan en su sitio de destino específico. Sin los componentes de gRNA adecuada, CLOuD9 sistema no será capaz de formar reversible inducida por bucles. Así, al diseño de guías múltiples para cada región de interés y difusión de las guías en una región de 250-1000 bp, se garantizará al menos una guía acertada. Guía de ubicación también es esencial para resultados precisos. Es importante evitar guías situadas en sitios de unión del factor de transcripción u otras regiones críticas para evitar efectos de fondo tales como arriba o abajo la regulación de la transcripción. Además, la ubicación precisa de la construcción de CLOuD9 puede afectar ligeramente transcripción del gene blanco. Esto pone de relieve la importancia de probar múltiples pares de guías para cada región de destino, para identificar al par más robusto para los propósitos experimentales. Además, en cada par de regiones de destino, la construcción de la CSA debe estar dirigida con gRNAs para S. aureus, y el constructo CSP debe estar dirigido con gRNAs para S. pyogenes para apuntar la especificidad.
Para asegurar resultados exactos y dimerización correcto, también es importante mantener la frescura de los ambientes celulares después de la transducción de las construcciones de CLOuD9. Cambio de media diaria y la adición de dimerizer fresca (o control) garantiza que las construcciones complementarias quedarán en proximidad y preservar la conformación de la cromatina alterada. Además, garantizar el ABA es fresco y se ha almacenado adecuadamente según protocolo del fabricante (abierto plazo de 6 meses, mantenidos frío, protegidos de la luz) es esencial para obtener resultados auténticos.
En particular, el dimerizer ABA de CLOuD9 fue utilizado con las proteínas de dimerización de ABI y PYL, en lugar de los más comúnmente utilizaron sistema FRB y FKBP. La necesidad de un rapalog para el sistema FRB/FKBP habría limitado la aplicabilidad de CLOuD9, debido a la toxicidad para las células cancerosas. El sistema alternativo de ABI/PYL eludido esta limitación, con eficacia permitiendo CLOuD9 ser más ampliamente utilizable.
Colectivamente, hemos desarrollado CLOuD9, una tecnología única y robusta que puede a la fuerza pero reversible crear contactos entre los lugares geométricos genomic objetivo a largo plazo. A través de la inducción de bucles de cromatina, también demostramos que CLOuD9 pueden ser utilizados para modificar la expresión génica en el apropiado contexto celular. La adaptabilidad de la tecnología permite el estudio libre de las interacciones entre cualquier dos loci genómicos, sin necesidad de conocimiento previo de la colocación de regiones o mecanismos de colocación. Además, exclusiva reversibilidad demostrada de CLOuD9 permite más análisis de los mecanismos de colocación en la enfermedad y el desarrollo. Mientras que los efectos en el blanco de bucles de cromatina han demostrado claramente, hay todavía datos que ofrece información sobre los efectos del objetivo de colocación y el posterior impacto en los lazos en blanco.
Nuestros datos muestra sólo algunas aplicaciones de esta herramienta sino que implica la importante idea subyacente que arreglo de cromatina es indicativo de la expresión génica. Nuestra tecnología puede utilizarse para estudiar y revelar los matices de la estructura de la cromatina en la regulación de los genes, mejorando así la comprensión general del papel de la cromatina plegable en la transcripción de genes. Una mejor comprensión de las sutilezas de dinámicas transcripcionales puede liderar el camino en la investigación y tratamiento del cáncer, enfermedades hereditarias y enfermedades congénitas, en que la cromatina distinta Asamblea altera sin duda gene expresión20, 21,22,23. Trabajos posteriores utilizando la tecnología de CLOuD9 iluminarán aún más detalles sobre el arreglo y la dinámica de los dominios de la cromatina y cómo conducen plegable para sustentar la expresión génica estable en el desarrollo y la enfermedad.

La relación entre cromatina plegable en el núcleo y la organización específica del genoma ha cosechado gran interés en los últimos años, como se ha demostrado para ser asociado de cerca a gene expression1,2. Mientras que la relación precisa entre la actividad de los genes y la modulación de la estructura de la cromatina sigue siendo confusa, se ha planteado la hipótesis que las interacciones entre los contactos cromosómicas como resultado de la organización de la cromatina tridimensional dinámica servir un gen función normativa3. De hecho, tal efecto ha sido bien demostrada en el locus del gen de globina humana, donde la región de control del locus (LCR) regula la actividad de los genes de la globina de forma específica al desarrollo mediante la creación de un bucle de cromatina entre las dos regiones4. Sin embargo, en esta y en otras regiones, no está claro si la cromatina bucles es una causa o la consecuencia de alteraciones en la expresión génica.
Hasta ahora, los retos en el estudio de este fenómeno seguía siendo sin resolver. Por ejemplo, otros intentos de inducir bucles de cromatina implicó modificar la secuencia de ADN lineal o procedimientos complicados que requieren una gran cantidad de conocimientos sobre los elementos específicos que facilitan la colocación de5,6, 7,8. Además, mientras que el trabajo anterior ha sugerido que la cromatina bucles de expresión génica de unidad en un contexto específico y restringido de7,8, el nivel en que la cromatina bucle afecta la transcripción a nivel mundial es incierto. Aunque el interés en el impacto de bucle largo alcance sobre la expresión génica ha crecido continuamente en los últimos años, persisten interrogantes sobre establecer y mantener contactos de cromatina para cambiar la actividad de los genes.
La tecnología que hemos diseñado emplea la proteína regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) - CRISPR - asociadas Cluster deficiente de nucleasa 9 (dCas9), para permitir el targeting ampliamente aplicable de cualquier loci genómicos9. Esta tecnología elimina las complejas cuestiones relacionadas con modificaciones de la secuencia lineal de ADN y es accesible sin conocimiento previo importante de colocación de los componentes. En particular, la herramienta es universal y ampliamente aplicable a los bucles de cromatina en desarrollo así como en una variedad de enfermedades como el cáncer. El poder de CLOuD9 demuestra alteración reversible de la estructura de bucles para efectivamente modular la expresión génica.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; medios</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Para el cultivo celular K562</td></tr><tr><td>DMEM medios</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, para cultivo celular 293T</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Plásmido Addgene</td><td>#52961</td><td>Para el desarrollo de plásmidos CLOuD9</td></tr><tr><td>PRSV-Rev</td><td>Plásmido Addgene</td><td>#12253</td><td>Para la producción de lentivirus</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Plásmido</td> <td>Addgene#12259</td><td>Para la producción de lentivirus</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Plásmido Addgene</td><td>#12251</td><td>Para la producción de lentivirus</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>Para la producción de lentivirus</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-HA</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>Para inmunoprecipitación</td></tr><tr><td>anti-Flag anticuerpo</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Para kit</td></tr> de <tr><td>sangre y tejido DNeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>para ADNc&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>para análisis de qPCR</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>Para análisis de qPCR</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-H3K4me3</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>para ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-ARN Pol-II</td><td>Motivo activo</td><td>61083</td><td>para ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasa libre de EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>para proteínas extracción</td></tr><tr><td>4-12% Tris Gel de glicina</td><td>Biorad</td><td></td><td>Cualquier tamaño, Para western blot</td></tr><tr><td>anti-Conejo Anticuerpo HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>anti-ratón Anticuerpo HRP</td><td>Señalización celular</td><td>7076S</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>K562 y H3K293 Datos ChIP-Seq</td><td>Codificación</td><td>ENCSR000AKU</td><td>Para análisis ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 y H3K293 Datos ChIP-Seq</td><td>Codificación</td><td>ENCSR000APE</td><td>para el análisis ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 y H3K293 Datos ChIP-Seq</td><td>Codificación</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>Para el análisis ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 y H3K293 Datos ChIP-Seq</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>para el análisis ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A para inmunoprecipitación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>para inmunoprecipitación</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G para Inmunoprecipitación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>Para inmunoprecipitación</td></tr><tr><td>ARN Clean & Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>para la purificación de ARN</td></tr><tr><td>Pierce 16% de formaldehído sin metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>para reticulación</td></tr><tr><td>PX458 Plásmido</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Se sugiere un plásmido Cas9 activo para la clonación de ARNg, pero cualquier plásmido Cas9 activo lo hará</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>para la purificación de</td></tr> <tr>PCR<td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Para clonación de ARN guía</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Para clonación de ARN</td></tr> guía <tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Para clonación de ARN guía</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Para clonación de ARN</td></tr> guía <tr><td>10X T4 Tampón de ligadura</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Para clonación de ARN guía</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Para clonación de ARN</td></tr> guía <tr><td>2X Tampón de ligasa rápida</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Para clonación de ARN</td></tr><tr><td>guía Quick Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Para clonación de ARN</td></tr> <tr><td>guía <tampones > fuertes<</td>/tampón de lisis > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham</td><td></td><td></td><td>Tris-Cl al 1 % pH 8,0, SDS al 1 %, solución acuosa inhibidora de la proteasa al 1 % (sin EDTA) y 1 mM de EDTA en agua</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> RIPA modificado <td>1 % NP40/Igepal, 0,5 % desoxicolato de sodio, 0,1 % de SDS, 1 mM de EDTA y solución de agua inhibidora de la proteasa al 1 % (sin EDTA) en PBS Tampón</td></tr><tr><td></td><td></td><td>de dilución de</td> pH 7,8 o 7,4 IP <td>0,01 % SDS, 1,1 % Triton-X 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, 0,1x inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lavado <td>100 mM Tris pH 9, 100 mM de LiCl, 1% de NP-40 y 1% de desoxicolato de sodio</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de hinchamiento <td>0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM acetato de potasio, 15 mM de acetato de magnesio, 1% NP-40</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de dilución <td>0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 y 167 mM de NaCl</td></tr><tr><td>Tampón de elución IP</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

mediada por crispr reorganización de la estructura de bucles de cromatina

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Estudios recientes han demostrado claramente a largo plazo, tridimensional cromatina bucle juego de interacciones sigue siendo un papel importante en la regulación de la expresión génica, pero si es responsable de la colocación o el resultado de alteraciones en la expresión génica desconocido. Hasta hace poco, como bucles de cromatina afectan la regulación de la actividad de los genes y función celular ha sido relativamente ambigua, y limitaciones en los métodos existentes para manipular estas estructuras impidieron la exploración en profundidad de estas interacciones. Para resolver esta incertidumbre, hemos diseñado un método para la reorganización de bucles de cromatina selectiva y reversible mediante CRISPR-dCas9 (CLOuD9). El dinamismo del sistema CLOuD9 ha demostrado acertada localización de construcciones CLOuD9 a loci genómicos para modular la conformación local de cromatina. Lo importante es la capacidad de revertir el contacto inducido y restaurar la conformación de la cromatina endógeno también se ha confirmado. Modulación de la expresión génica con este método establece la capacidad de regular la expresión génica celular y pone de relieve el gran potencial de aplicaciones de esta tecnología en la creación estable de novo bucles de cromatina que afectan marcadamente gene expresión en los contextos de desarrollo y cáncer.

Bucles de cromatina juega un papel importante en la regulación de los genes; sin embargo, ha habido no hay avances tecnológicos que permiten la modificación selectiva y reversible de los bucles de cromatina. Aquí describimos un sistema de gran alcance para la reorganización de bucles de cromatina usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demostró de forma selectiva y reversible modular la expresión génica en blanco loci.

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Este método podría ayudarnos a responder preguntas clave relacionadas con la expresión génica, mostrándonos exactamente cómo la estructura de la cromatina afecta la expresión génica y cómo la organización de la cromatina regula la dinámica transcripcional. Desarrollamos esta tecnología porque queríamos ser capaces de alterar la arquitectura cromosómica para permitir la creación de bucles de cromatina de largo alcance. Mientras que al mismo tiempo tienen la capacidad de invertir el contexto de la cromatina para restaurar la estructura cromosómica endógena.Este método fue diseñado para facilitar el uso y una amplia aplicabilidad. Aprovechamos un dimerizer no tóxico, así como especies ortogonales de dcas9 con el fin de permitir que el sistema se utilice más ampliamente. Desarrollamos este método porque queríamos ser capaces de responder a la pregunta de pollo y huevo de larga data de si la expresión génica engendra arquitectura cromosómica o si la estructura cromosómica conduce a cambios en la expresión génica.El diseño de las secuencias de ARN de guía CRISPR y el mantenimiento de los cultivos celulares se describen en el protocolo de texto. Los mapas de plásmido y las imprimaciones utilizadas se enumeran allí. Comience la preparación del plásmido mezclando cinco microgramos del plásmido LENTR lentiviral con tres microlitros de BsmB1 tres microlitros de fosfatasa alcalina seis microlitros de tampón de digestión 10x y 0,6 microlitros de 100 milivolarios recién preparados de TDT.Lleve el volumen total a 60 microlitros de agua doble destilada e incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos para digerir y desforsforlazar el plásmido. A continuación, el gel purifica el plásmido digerido en el plásmido del lazo y el agua doble destilada. A continuación, prepare las reacciones de recocido para los pares de ARN guía.Combine un microlitro de cada ARN guía a 100 micromolares con un microlitro de 10x T4 buffer 6.5 microlitros de agua destilada doble y 0,5 microlitros de T4 PNK para un volumen de reacción total de 10 microlitros. Para recocido los pares de ARN guía a sus secuencias de destino incuban las mezclas a 37 grados centígrados a los 30 minutos seguidos de una incubación a 95 grados centígrados durante 5 minutos y luego reducen gradualmente la temperatura a 25 grados centígrados disminuyendo en cinco grados centígrados por minuto. A continuación, diluir los ARN guía recocidos en uno a doscientos en agua doble destilada.Ahora, prepara las dos reacciones de ligadura. Mezclar un microlitro del plásmido digerido con 0,5 microlitros de una guía perivaneal diluida RNAse 2,5 microlitros de 2x ligadura amortiguan un microlitro de agua doble destilada y 0,5 microlitros de ligasa. Incubar las reacciones a temperatura ambiente durante 10 minutos para ligar el plásmido digerido BsmB1.A continuación, transformar el plásmido recién ligado en tres bacterias estables y amplificar las bacterias utilizando cualquier método de preparación de plásmido. En una placa de seis pozos, por pozo, semilla 750, 000 2n3 Tcells en DMEM con 10%FBS y 1%pen strep. Use un pozo para cada construcción e incubar las células durante 24 horas.Al día siguiente, cambie el medio a antibiótico fresco libre-DMEM con 10%FBS. Justo después de cambiar el medio para cada pozo de células chapadas preparar un tubo de mezcla de producción de Lentivirus. Por cada reacción, diluir 11 microlitros de reactivo de transfección de base lipídica con 150 microlitros del medio Opti-MEM para cada reacción.Luego, en tubos separados, prepare el ADN. Combine dos microgramos del plásmido vectorial lentiviral CLOud9 con dos microgramos de los otros componentes de embalaje lentiviral. Diluir esta mezcla en 150 microlitros del medio Opti-MEM.A continuación, combine volúmenes iguales de la mezcla de plásmido lentiviral diluido en el reactivo de transfección diluido a base de lípidos e incubar las mezclas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego a cada pocólo de células añadir un tubo de las mezclas preparadas y continuar la incubación. 48 horas más tarde, transfiera los medios de producción virales de los pozos de la placa a los cónicos y gítelos a 300 g durante cinco minutos.A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos frescos para desechar los desechos peletados. Ahora, utilice inmediatamente los medios de producción virales para transducir las células objetivo o congelarlas a 80 grados centígrados para su uso futuro. Comience con la adición de 250 microlitros de cada construcción viral de interés, que en este caso, se compone de plásmidos CLOud9 complementarios a un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 80.000 células.A continuación, agregue suficiente polybrene para que esté entre uno y ocho microgramos por mililitro en solución. A continuación, ajuste el volumen total de cada tubo a un mililitro utilizando medios libres de antibióticos. Ahora para aumentar el contacto entre las partículas del virus y las células giran las células a 800 g durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego vuelva a suspender las celdas en el sobrenadante por pipeteo. A continuación, cargue la suspensión de las células sobre las placas de cultivo e i incubarlas durante 24 horas. Al día siguiente, recoja las células.Centrifugarlos a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y volver a suspenderlos en medio normal. Al día siguiente, añadir puromicina e higromicina al medio para seleccionar para las células doblemente transducidas. La concentración adecuada de antibióticos debe determinarse con antelación para cada tipo de célula.Luego, incubar las células en el medio de selección durante al menos tres días antes de proceder con las aplicaciones posteriores y continuar manteniendo las celdas y los medios de selección. Para dimerizar las células seleccionadas y transducidas CLOud9 añaden un ABA mililolar al plato de cultivo. Para los controles, agregue DMSO y, a continuación, mantenga las celdas con ABA o DMSO durante el experimento.Para invertir la dimerización, lave las células con suficiente PBS para cubrir la superficie de la placa dos veces. A partir de entonces, las células de cultivo en medios libres de ABA para mantenerlas en un estado no dimerizado. El uso adecuado del sistema CLOud9 induce el contacto reversible de las construcciones complementarias CSA y CSP CLOud9 mediante la adición o eliminación de ABA a medios de cultivo celular.Las construcciones CSA y CSP se localizan en regiones genómicas apropiadas utilizando la guía estándar DE CRISPR RNAse. Se utilizó la inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR cuantitativa para garantizar la localización precisa en la focalización de cada componente CLOud9. Además coimmunoprecipation con y sin ABA verificado CSA y cetirización CSP en presencia del ligando, así como la reversibilidad en ausencia del ligando.Después de la dimerización de la ABA, se midió un mayor contacto entre la betaglobina y la LCR mediante la captura de confirmación del cromosoma. Sin embargo, esto no se observó en los controles que contienen sólo la CSA o sólo la construcción CSP. La creación de la interacción beta-globina de LCR no eliminó por completo el contacto endógeno de la globina LCR.Solo se añadió al contacto original. El aumento de los contactos LCR de beta-globina se observó a través de 72 horas de dimerización, independientemente de la región exacta dentro de la LCR objetivo o de la región promotora de la beta-globina. Por último, la reversibilidad del sistema se confirmó con la captura de confirmación del cromosoma después de eliminar ABA.Esto dio lugar a la renovación completa de la confirmación endógena. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cambiar los medios y agregar células transducidas CLOud9 frescas todos los días. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso y todas las precauciones utilizadas en BSL 2 siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.

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Investigación

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