Name: Un protocolo para adquirir la Tenocyte degenerativa de los seres humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a aislar tenocitos degenerativos humanos durante cirugía de epicondilitis sin daño adicional al paciente. Este protocolo detallado incluye cultivo celular, análisis inmunocitoquímico e histológico para estudiar tendinopatías.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por una donación de Corea salud tecnología R & D proyectos a través de la Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), que fue financiado por el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI16C1559).

El protocolo se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y el protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el centro médico de CHA Bundang.
1. cosecha de tejido degenerativa del tendón del paciente
<ol><li>Diagnosticar la epicondilitis lateral por tomar una historia médica y el uso de hallazgos del examen físico: sensibilidad sobre el origen tendinoso cerca del epicóndilo lateral; dolor evocado por la extensión resistida de la articulación de la muñeca.</li>
	<li>Utilice los siguientes criterios de inclusión: mayores de 18 años de edad; una historia de la epicondilitis lateral por un mínimo de seis meses; recalcitrantes para tratamiento no quirúrgico; al menos tres meses han transcurrido desde la inyección de corticosteroides, plasma rico en plaquetas o toxina botulínica</li>
	<li>Excluir los siguientes: mujeres embarazadas; pacientes con antecedentes de enfermedad de la columna cervical, artritis de codo, enfermedades reumatológicas, cirugía en el codo y el síndrome de atrapamiento del nervio; negarse a donar tejidos de pacientes.</li>
	<li>
Técnica quirúrgica Nota: Ver figura 124.<ol>
<li>Después de la anestesia general por intubación endotraqueal e isoflurano, poner el brazo sobre la mesa y aplicar un torniquete. Luego aplique a betadine agente en el brazo entero y cubra con una hoja quirúrgica aséptica.</li>
		<li>Exponga el codo lateral mediante una incisión de 3 a 5 cm con Nº 15 bisturí hoja sólo anteromedial del epicóndilo lateral y proximal al nivel de la articulación.</li>
		<li>Visualmente identificar la interfaz de aponeurosis del extensor y del extensor carpi radialis longus (ECRL) y haga una incisión División 2-3 mm en profundidad entre la aponeurosis ECRL y extensor con una hoja de bisturí Nº 15 en la interfaz identificada.</li>
		<li>Extraiga el ECRL anterior, que traerá el origen patológico del extensor carpi radialis longus brevis (ECRB) debajo en visión directa.</li>
		<li>Identificar visualmente el tejido patológico degenerativo por su característico color grisáceo opaco y el tejido generalmente edematoso y friable.</li>
		<li>Después de la identificación, cuidadosamente resecar todo el tejido degenerativo agudamente con bisturí Nº 15 y hojas de mini.</li>
		<li>Incrustar el tejido resecado (alrededor de 1 cm3) en tampón fosfato salino (PBS) inmediatamente y eliminar todo el tejido circundante excepto tejido de tendón con cuidado en unos 10 mL de PBS tan pronto como sea posible.</li>
		<li>En casos con exostosis ósea en el epicóndilo lateral, eliminar la exostosis con una gubia y alisar con una escofina. Hacer varios agujeros (diámetro 1,6 mm, aproximadamente 6-8 agujeros) en el cóndilo anterolateral para mejorar suministro vascular. Esto es opcional.</li>
		<li>Cerrar la herida capa por capa utilizando material de sutura no absorbible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Control sano tenocyte
	<ol>
<li>Obtener tenocytes sanos el tendón restante del auto-tendón de la corva o auto-rótula tendón durante la reconstrucción del ligamento cruzado anterior y usarlo como control para el siguiente experimento25. Nota: El número de muestras utilizadas en este estudio fueron tres en cada grupo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. histología
<ol><li>Almacenar cerca de la mitad del tejido recolectado en formalina 10% tamponada neutra en una campana química o equivalente.</li>
	<li>Incrustar el tejido en un bloque de parafina (4 – 5 mL) y sección en secciones de 4 – 5 μm coronal.</li>
	<li>
Mancha de las secciones de control y degenerativo tendón con tinción de hematoxilina y eosina (H & E) y la mancha azul de Alcian en pH 2.5. Realizar tinción H & E en un aparato de tinción automatizado como sigue.
	<ol>
<li>Desparafinizar usando xileno (3 veces, 5 min, respectivamente).</li>
		<li>Hidratación de alcoholes graduales al agua (100% de alcohol, 4 min 100% de alcohol, 3 min alcohol de 95%, 2 min; 70% de alcohol, 1 min; agua, 2 min).</li>
		<li>Mancha en hematoxilina por 5 min lavar bien en agua durante 2 minutos.</li>
		<li>Diferenciar en alcohol ácido al 1% (1% ácido clorhídrico en alcohol al 70%) para 3 s. lavar bien en agua durante 3 minutos.</li>
		<li>Neutralizar el HCl por inmersión en un amoníaco 0.5% por 10 s, seguido de un lavado con agua 3 minutos.</li>
		<li>La mancha en Eosion durante 5 minutos.</li>
		<li>Deshidratar con alcoholes (alcohol al 80%, 30 s, alcohol al 95%, 1 min, 100% alcohol 1 min, 100% alcohol 2min).</li>
		<li>Claro en el xileno (3 veces, 2 min, 2 min y 3 min, respectivamente).</li>
		<li>Monte con una diapositiva de cubierta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar immunohistochemitry (IHC) utilizando el kit de detección de refinar de polímero de bonos según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores.
	<ol>
<li>Después de la parafina con xileno, realizar un procedimiento de recuperación de antígeno mediante enlace solución de recuperación del epítopo durante 30 min a 100 ° C. La solución de recuperación del epítopo Bond contiene un tampón citrato basa y surfactante (1 L, pH 5.9 – 6.1).</li>
		<li>Quench peroxidasas endógenas por incuba el tejido con agua oxigenada por 5 min.</li>
		<li>Incubar las secciones durante 15 min a una temperatura ambiente (21-22 ° C) con anticuerpos primarios contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) o mohawk (1: 200).</li>
		<li>Realizar el anticuerpo secundario marcado con un sistema de rábano poliméricas libres de biotina peroxidasa-linker anticuerpo conjugado.<ol>
<li>Uso secundario conejo anti ratón IgG en suero animal, 10% (v/v) en solución 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one Tris-buffer saline/0.09% localizar anticuerpos de ratón.</li>
			<li>Uso de anti-conejo polímero poli-HRP-IgG (< 25 μg/mL) con suero animal 10% (v/v) en tampón Tris saline/0.09% localizar anticuerpos de conejo.</li>
			<li>Uso 3, 3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride hidrato en una solución de estabilizador para visualizar el complejo a través de un precipitado marrón.</li>
			<li>Contratinción con < 0.1% hematoxilina (azul) para visualizar los núcleos celulares.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observe los portaobjetos teñidos con H & E, Alcian azul manchas e IHC para VEGF, tenomodulin y mohawk bajo microscopio de luz y obtener imágenes microscópicas representativas de cada diapositiva en el campo de un gran aumento (400 X).</li>
</ol>3. Tenocyte cultura
<ol><li>
Preparación de tejido
	<ol>
<li>Preparar la muestra de tendón eliminando todo el tejido circundante con micro-tijeras y pinzas.</li>
		<li>Lavar con PBS y pique en trozos pequeños (de 1 mm3 o menos).</li>
		<li>Digerir tejido para 1 h en 30 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 30 mg/mL de colagenasa II a 37 ° C.</li>
		<li>Pasar las células a través de un tamiz celular de 100 μm.</li>
		<li>Desactivar colagenasa II agregando 1 mL de suero bovino fetal (FBS).</li>
		<li>Centrifugue a 196 x g durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultivo de células
	<ol>
<li>3 x 105 células de semillas en un plato de 100 mm y de la cultura con DMEM suplementado con 10% FBS y solución antibiótico-antimicótico 1% a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 para 1 semana.</li>
		<li>Cambiar el medio de cultivo cada tres días hasta que se produce el 80% de confluencia. Cultura saludable control y muestras de células degenerativas hasta paso cuatro y use para el experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inmunocitoquímica (ICC)
<ol><li>Transfiera 200 μL de cultivo de células (2 x 105 células) en los ocho pocillos de un portaobjetos de la cámara y hacer crecer las células a la confluencia con la adición de medio fresco por 1 día.</li>
	<li>Lavar las células con PBS y se fijan con 500 μl de formaldehído al 4% por pozo.</li>
	<li>Incube los portaobjetos con 0.5% Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos para la permeabilización de las membranas.</li>
	<li>Bloque en PBS con 1% albúmina de suero bovino y 0.05% TWEEN-20 mohawk y tenomodulin, respectivamente.</li>
	<li>Incubar en la oscuridad con anticuerpo monoclonal de ratón anti-mohawk (dilución 1: 100) y el anticuerpo del anti-tenomodulin de cabra (dilución 1: 100) a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Incubar los anticuerpos secundarios (Alexa 555-anti cabra (1: 200) para tenomodulin; Ratón de 488-anti Alexa (1: 200) para mohawk) en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte con 0,5 μl de un medio de montaje de fluorescencia.</li>
	<li>Analizar utilizando un microscopio de fluorescencia (400 X).</li>
</ol>5. proliferación ensayo
<ol><li>
Viabilidades de la célula de medida utilizando tetrazolio soluble en agua (WST) -1.
	<ol>
<li>Semilla sanas y degenerativas de las células en 96 placas pozos a una densidad de 2 x 103 células por pozo para 24, 72 y 120 h.</li>
		<li>Después de la incubación, añadir 10 μl de la solución de WST-1 de 10% a cada pocillo.</li>
		<li>Incubar las placas durante 3 h a 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Medir la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Tomar lecturas de al menos tres veces en todos los puntos de tiempo para cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medir celular ADN la cantidad usando el ensayo de BrdU.
	<ol>
<li>Semilla tanto saludable y células degenerativas en 96 placas bien con una densidad de 2 x 103 células por pozo para 24, 72 y 120 h.</li>
		<li>Después de la incubación, añadir 10 μl de solución de BrdU de 10% a cada pocillo.</li>
		<li>Incubar las placas durante 3 h a 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Añadir 100 μL/pocillo de la solución de fijación/desnaturalizar (60 – 70% de etanol, 0.1 – 0.5% de hidróxido de sodio) y mantener la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
		<li>Añadir 100 μL/pocillo preparado 1 x solución de detección de anticuerpos y mantener la placa a temperatura ambiente durante 1 hora.</li>
		<li>Eliminar la solución y lave la placa tres veces con el 1 x de tampón de lavado.</li>
		<li>Añadir 100 μL/pocillo preparado 1 x solución de anticuerpo secundario conjugado con HRP y mantenga la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
		<li>Retire la placa de la solución y lavar tres veces con el 1 x de tampón de lavado.</li>
		<li>Añada 100 μl de sustrato TMB de 50%.</li>
		<li>Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añada 100 μl de solución de parada.</li>
		<li>Medir la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Nota: Tomar lecturas al menos tres veces en todo momento puntos para cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. estadístico análisis
<ol><li>Recopilar y analizar datos utilizando SPSS.</li>
	<li>Describa los datos por la media ± error estándar de la media.</li>
	<li>Prueba de Mann Whitney U uso.</li>
	<li>Considerar las diferencias estadísticamente significativas cuando el valor p es menor que 0.05 (p < 0,05).</li>
</ol>

<ol><li>Ackermann, P. W., Renstrom, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23016086">Tendinopathy in sport.</a> Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).</li>
<li>Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+epidemiology+of+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Types and epidemiology of tendinopathy.</a> Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).</li>
<li>Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+sensory+neuropeptides+in+tendon+is+associated+with+failed+healing+and+activity-related+tendon+pain+in+collagenase-induced+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury.</a> American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).</li>
<li>Han, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+corticosteroid+on+the+expressions+of+neuropeptide+and+cytokine+mRNA+and+on+tenocyte+viability+in+lateral+epicondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis.</a> Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40(2012).</li>
<li>Uchio, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuropeptides+and+cytokines+at+the+extensor+carpi+radialis+brevis+muscle+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Shoulder+and+Elbow+Surgery%22%5BJournal%5D)">Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin.</a> Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).</li>
<li>Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+human+wrist+extensor+muscle+sarcomere+length+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).</li>
<li>Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+histopathology+of+chronic+refractory+lateral+epicondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis.</a> American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).</li>
<li>Sharma, P., Maffulli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+injury+and+tendinopathy%3A+healing+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+American+volume%22%5BJournal%5D)">Tendon injury and tendinopathy: healing and repair.</a> Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).</li>
<li>Lui, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+technology+for+tendon+regeneration%3A+current+status%2C+challenges%2C+and+future+research+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions.</a> Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).</li>
<li>Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+improves+cellular+and+molecular+aspects+of+healing+in+a+collagenase-induced+model+of+flexor+tendinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis.</a> Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).</li>
<li>Schnabel, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+insulin-like+growth+factor-I+gene-enhanced+mesenchymal+stem+cells+improve+structural+aspects+of+healing+in+equine+flexor+digitorum+superficialis+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons.</a> Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).</li>
<li>Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon-derived+progenitor+cells+improve+healing+of+collagenase-induced+flexor+tendinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis.</a> Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).</li>
<li>Titan, A., Andarawis-Puri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendinopathy%3A+Investigating+the+Intersection+of+Clinical+and+Animal+Research+to+Identify+Progress+and+Hurdles+in+the+Field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+Review%22%5BJournal%5D)">Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field.</a> Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).</li>
<li>Dirks, R. C., Warden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+study+of+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+Neuronal+Interaction%22%5BJournal%5D)">Models for the study of tendinopathy.</a> Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>de Mos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+platelet-rich+plasma+enhance+tendon+repair%3F+A+cell+culture+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study.</a> American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).</li>
<li>Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bupivacaine+on+cultured+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Effect of bupivacaine on cultured tenocytes.</a> Orthopedics. 32 (1), 26(2009).</li>
<li>Wong, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+on+cultured+human+tenocytes+and+its+reversibility+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+American+Volume%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor.</a> Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).</li>
<li>Tempfer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crystalline+glucocorticoid+triamcinolone+acetonide+on+cultered+human+supraspinatus+tendon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells.</a> Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).</li>
<li>Menon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+in+extracellular+matrix+remodeling+and+collagen+turnover+related+pathways+in+cultured+human+tenocytes+after+ciprofloxacin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Muscles+Ligaments+Tendons+J%22%5BJournal%5D)">New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration.</a> Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).</li>
<li>Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+is+a+mechanoresponsive%2C+autocrine+regulator+of+human+tenocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (11), 27209(2011).</li>
<li>Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+reduces+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+human+tenocytes+through+NK-1+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Britich+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation.</a> Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).</li>
<li>Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+proliferation+and+associated+expression+of+PDGFRbeta+causing+hypercellularity+in+patellar+tendinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis.</a> Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).</li>
<li>Hoppe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenocytes+of+chronic+rotator+cuff+tendon+tears+can+be+stimulated+by+platelet-released+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Shoulder+and+Elbow+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors.</a> Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).</li>
<li>Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nirschl+surgical+technique+for+concomitant+lateral+and+medial+elbow+tendinosis%3A+a+retrospective+review+of+53+elbows+with+a+mean+follow-up+of+11.7+years%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years.</a> American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).</li>
<li>Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tenocyte+morphology+is+more+prevalent+than+collagen+disruption+in+asymptomatic+athletes%27+patellar+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons.</a> Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).</li>
<li>Yuan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+an+Animal+Model+of+Tendinopathy+by+Inducing+Chondrogenic+Differentiation+with+Kartogenin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin.</a> PLoS One. 11 (2), 0148557(2016).</li>
<li>Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+validated+animal+models+for+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medical+Scientific+Sports%22%5BJournal%5D)">What are the validated animal models for tendinopathy.</a> Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).</li>
<li>Wilhelm, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19700079">Lateral epicondylitis review and current concepts.</a> Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varios estudios anteriores han reportado cómo crear modelos animales de tendinopathic crónica con diferentes procedimientos como la colagenasa o inyección kartogenin, caminadora funcionando y más26,27. Aunque numerosos estudios mostraron efectos terapéuticos prometedores basados en estos modelos animales, experimentos con la tenocyte degenerativa humana sería cruciales en el campo de la Tendinopatía para reproducir la eficacia del tratamiento. En este artículo, s...

Tendinopatía es una condición músculo-esquelética degenerativa crónica que se desarrolla en varias partes del cuerpo. Recientemente, el número de casos de tendinopathy ha aumentado considerablemente en el mundo desarrollado debido a la creciente participación en los deportes recreativos y mayor esperanza de vida1,2. La causa de la Tendinopatía es considerada multifactorial y estas causas incluyen la isquemia, lesiones de radicales libres de oxígeno, un desequilibrio entre inervaciones vasoconstrictor y vasodilatador, interno micro-se rasga y los cambios neuro-regulación3 ,4,5,6,7,8. Mayoría de los tratamientos para tendinopathy sólo aliviar sus síntomas. Además, tratamientos sin regeneración de los tejidos requieren mucho tiempo para la rehabilitación y logran una respuesta limitada de tendones lesionados, que impone un desafío clínico para los médicos9.
La incompetencia de las opciones actuales de tratamiento junto con la falta de capacidad de tendón degenerativo de self-heal tiene investigadores a tomar interés en explorar estrategias alternativas del tratamiento. Recientemente, nuevos estudios registrados muchos resultados prometedores para la mejora de la eficacia curativa de los tendones Tendinopatía mediante factores de crecimiento, células madre terapia y terapia de gene10,11,12.
A través de una revisión de la literatura, encontramos que los estudios implicados pueden dividirse en dos categorías basadas en sus análisis de materiales: modelos animales como una rata, un ratón o un conejo; y modelos humanos. En relación con el modelo animal, actualmente existen dos técnicas populares para generar tendinopathy: inducción química de lesión o sobrecarga del modelo mecánico. Sin embargo, cada modelo animal fue limitado en la reproducción de la Tendinopatía humana compleja patología13,14.
Mayoría de los papeles con muestras humanas se analizaron histológicamente o realiza el en vitro experimento basado en un tenocyte humano sano en lugar de una tenocyte degenerativa15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. sólo unos pocos trabajos registrados que usaron una tenocyte degenerativa humana, pero no describió en detalle el protocolo usado para obtener la tenocyte degenerativa de la humana22,23. En este contexto, cabe señalar que resultados exitosos en el modelo animal o el tejido sano/tenocyte no pueden necesariamente predecir eficacia humana o dosificación eficaz debido a la degeneración del tendón es un proceso complicado y la patogenesia es aún no completamente entendido.
En conjunto, es necesario describir el protocolo estándar para la obtención de la tenocyte degenerativa del tejido humano sin causar efectos adversos al donante. Este artículo describe un protocolo sobre cómo adquirir la tenocyte degenerativa humana. Para validar el protocolo, los tejidos cosechados fueron analizados histológicamente. Entonces, el cultivo de células fue confirmado como la tenocyte degenerativa por usar inmunocitoquímica (ICC), una reacción en cadena de polimerasa de tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y un análisis de viabilidad.

<table><tbody><tr><td>Bisturí</td><td>Kisanbio</td><td>KS-Q0306-15</td><td>Nº 15</td></tr><tr><td>Minicuchilla</td><td>Castor</td><td>374769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Engineer's medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995065</td> PBS Gibco 14190250 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>50 mM de ácido ascórbico-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4% formaldehído</td><td>Bio-solución</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Rdtech</td><td>C0082</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>MKX (C-5)</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-515878</td><td></td></tr><tr><td>Tenomodulin (N-14)</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-49325</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de fluorescencia</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>BrdU Kit de ensayo de proliferación celular</td> Tecnología <td>de señalización celular</td><td>#6813</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Mezcla Maestra de Expresión Génica</td><td>Biosystems Aplicados</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Hs02786624_g1 <td></td></tr><tr><td>COL3A1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTA2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00426835_g1</td><td></td></tr><tr><td>TAC1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>Hs00243225_m1</tr><tr><td>TACR1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00185530_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00153133_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999903_m1</td><td></td></tr><tr><td>Filtros celulares (100 &micro; m)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8188207</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara de 8 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos transparente de fondo plano de poliestireno tratado con TC Microplacas Corning</td><td></td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 50i&nbsp;</td><td>Lector de microplacas Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSA max&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Parafinas</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801340</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>90303-2185</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>DAKO</td><td>CS70030-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>DAKO</td><td>CS70130-2</td><td></td></tr><tr><td>Azul alcián</td><td>DAKO</td><td>AR16011-2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>25165-0430</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasas endógenas&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S200380-2</td><td></td></tr><tr><td>bálsamo de Canadá</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>23255-1210</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo</td><td>FEATHER</td><td>A35</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio deslizante</td><td>SUPERIOR 1000612</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-7269</td><td></td></tr><tr><td>SPSS Software</td><td>IBM</td><td></td><td>Ver. 18.0</td></tr><tr><td>Centrífuga multipropósito</td><td>LABOGENE</td><td>1248R</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para adquirir la tenocyte degenerativa de los seres humanos

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Tendinopatía, una condición dolorosa que se desarrolla en respuesta a la degeneración del tendón, va en aumento en los países desarrollados debido al aumento de la actividad física y mayor esperanza de vida. A pesar de su creciente prevalencia, la patogenia subyacente sigue siendo confusa, y el tratamiento es generalmente sintomático. Recientemente, se investigaron numerosas opciones terapéuticas, incluyendo factores de crecimiento, células madre y terapia génica, con la esperanza de mejorar la potencia curativa del tendón degenerativo. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se llevaron a cabo sólo en modelos animales o tenocytes humana saludable. A pesar de algunos estudios utilizando tenocytes patológica, al mejor de nuestro conocimiento no existe ningún protocolo que describe cómo obtener tenocytes degenerativa humana. El objetivo de este estudio es describir un protocolo estándar para la adquisición de tenocytes degenerativa humana. Inicialmente, el tejido del tendón fue cosechado de un paciente con epicondilitis lateral durante la cirugía. Luego se tomaron muestras de biopsia del tendón extensor carpi radialis brevis correspondiente a los cambios estructurales observados en el momento de la cirugía. Todos los tendones cosechados parecen opaco, gris, friable y edematosa, que hacía visualmente distinta de los sanos. Tenocytes eran cultivados y utilizados para experimentos. Mientras tanto, la mitad de los tejidos cosechados fueron analizada histológicamente, y se ha demostrado que compartían las mismas características claves de Tendinopatía (angiofibroblastic displasia o hiperplasia). Un análisis secundario por immunocytochemistry confirmó que las células cultivadas tenocytes con la mayoría de las células que tienen las manchas positivas para mohawk y tenomodulin las proteínas. Luego se determinaron las cualidades de la naturaleza degenerativa de tenocytes comparando las células con el control sano con un ensayo de proliferación o qRT-PCR. La tenocyte degenerativa muestra una mayor tasa de proliferación y similares patrones de expresión de gene de la Tendinopatía que coincidió con los informes anteriores. En general, este nuevo protocolo podría proporcionar una herramienta útil para futuros estudios de Tendinopatía.

Análisis histológicos revelaron que el tejido recolectado de epicondilitis lateral tenía las características de un tendón de tendinopathic. Sección H &amp; E de Tendinopatía degenerativa del tendón reveló un paquete de colágeno desorganizado con pérdida de polaridad y estructuras bien recto, fuertemente lleno de fibra paralela. Signos histológicos sugestivos de degeneración como mayor celularidad y núcleos agrandados sin la forma típica del huso eran comunes en las muestras. Además, los p...

In vitro uso de tenocytes degenerativa es indispensable la investigación de la eficacia del novedoso tratamiento de la Tendinopatía. Sin embargo, la mayoría estudios utilizan solamente el modelo animal o una tenocyte saludable. Proponemos el siguiente protocolo para aislar tenocytes degenerativa humana durante la cirugía.

Un protocolo para adquirir la Tenocyte degenerativa de los seres humanos

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología de los tenocitos degenerativos humanos, ya que solo unos pocos estudios han descrito en detalle el aislamiento y el cultivo de tenocitos degenerativos humanos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener tenocitos degenerativos humanos sin lesiones adicionales para el paciente, ya que el tejido degenerativo se adquiere durante la cirugía estándar de epicondilitis. Demostrando el procedimiento estarán el Dr. Soo-Hong Han, Minjung Baek y Hyung Kyung Kim de mi Nivel Tres.Para adquirir una muestra de tejido de tendocitos degenerativo, use un bisturí quirúrgico número 15 para hacer una incisión en la piel de tres a cinco centímetros justo antes medial al epicóndilo lateral, y proximal al nivel de la articulación para exponer el codo lateral y ubicar visualmente el extensor radial largo del carpo en la interfaz de la aponeurosis extensora. Utilice el bisturí para hacer una incisión de dos a tres milímetros de profundidad entre el extensor radial largo del carpo y la aponeurosis extensora en la interfaz. Después de la retracción anterior del extensor radial largo del carpo, localice el tejido degenerati

a-protocol-to-acquire-the-degenerative-tenocyte-from-humans

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aquí presentamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos embrionarios murinos en células madre trofoblásticas completamente funcionales y estables mediante la sobreexpresión de diez días de Tfap2c, Gata3, Eomes y Ets2.

Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Presentamos aquí un protocolo para la diferenciación de células madre humanas pluripotentes inducidas en cada derivado del somite (miotoma sclerotome, dermatoma y syndetome) en condiciones químicamente definidas, que tiene aplicaciones en modelos futuros de la enfermedad y terapias basadas en células en cirugía ortopédica.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.

Aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de células madre derivadas del tendón

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Aquí, describimos un protocolo para el trasplante y seguimiento de células neuronales marcadas en organoides cerebrales humanos.

Un modelo de organoide cerebral humano de trasplante de células neurales

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

Aquí, presentamos un sistema modelo ensamblado para imitar la diafonía celular del tendón entre el tejido central del tendón que soporta la carga y un compartimento extrínseco que contiene poblaciones celulares activadas por enfermedades y lesiones. Como caso de uso importante, demostramos cómo se puede implementar el sistema para investigar la activación relevante de la enfermedad de las células endoteliales extrínsecas.

Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

Aquí, demostramos un modelo de organoide de tres pasos (expansión bidimensional [2D], estimulación 2D, maduración tridimensional [3D]) que ofrece una herramienta prometedora para la investigación fundamental de tendones y un posible método sin andamios para la ingeniería de tejidos tendinosos.

Demostración de cultivo de láminas celulares autoensambladas y generación manual de un organoide similar a un tendón/ligamento en 3D mediante el uso de fibroblastos dérmicos humanos

Presentamos un protocolo optimizado para el procesamiento de riñones humanos completos para aislar y cultivar células epiteliales primarias del túbulo proximal renal y la aplicación de estas células en una plataforma tridimensional, microfluídica y microfisiológica para recapitular el túbulo proximal renal.

Aislamiento de células epiteliales primarias del túbulo proximal humano y su uso en la creación de un modelo microfisiológico del túbulo proximal renal

Aprende a aislar tenocitos degenerativos humanos durante cirugía de epicondilitis sin daño adicional al paciente. Este protocolo detallado incluye cultivo celular, análisis inmunocitoquímico e histológico para estudiar tendinopatías.

Un protocolo para adquirir la Tenocyte degenerativa de los seres humanos

Explorar más videos