Un protocolo para adquirir la Tenocyte degenerativa de los seres humanos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología de los tenocitos degenerativos humanos, ya que solo unos pocos estudios han descrito en detalle el aislamiento y el cultivo de tenocitos degenerativos humanos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener tenocitos degenerativos humanos sin lesiones adicionales para el paciente, ya que el tejido degenerativo se adquiere durante la cirugía estándar de epicondilitis. Demostrando el procedimiento estarán el Dr. Soo-Hong Han, Minjung Baek y Hyung Kyung Kim de mi Nivel Tres.

Para adquirir una muestra de tejido de tendocitos degenerativo, use un bisturí quirúrgico número 15 para hacer una incisión en la piel de tres a cinco centímetros justo antes medial al epicóndilo lateral, y proximal al nivel de la articulación para exponer el codo lateral y ubicar visualmente el extensor radial largo del carpo en la interfaz de la aponeurosis extensora. Utilice el bisturí para hacer una incisión de dos a tres milímetros de profundidad entre el extensor radial largo del carpo y la aponeurosis extensora en la interfaz. Después de la retracción anterior del extensor radial largo del carpo, localice el tejido degenerativo patológico por su característico color grisáceo opaco y su tejido típicamente edematoso y friable, y use el bisturí y las mini cuchillas para resecar cuidadosamente, pero con precisión, todo el tejido degenerativo.

Cuando se haya extraído todo el tejido, cierre la herida con material de sutura no absorbible de acuerdo con los protocolos estándar y extraiga con cuidado todo el tejido circundante de una muestra de tejido de aproximadamente un centímetro cúbico, colocando el tejido tendinoso limpio en 10 mililitros de PBS tan pronto como se haya recortado. A continuación, fije aproximadamente la mitad del tejido recolectado en formalina neutra tamponada al 10% en una campana de gases químicos durante 12 horas. Para establecer un cultivo de tenocitos, transfiera la otra mitad de las muestras de tejido de control y degenerado recolectadas a placas individuales de cultivo de tejidos que contengan PBS fresco y pique los tejidos en trozos de un metro cúbico o más pequeños, digiera los fragmentos de tejido en 30 mililitros de DMEM suplementado con 30 miligramos por mililitro de colagenasa, dos por grupo de tejido a 37 grados Celsius durante una hora.

Al final de la digestión, filtre las soluciones celulares a través de filtros celulares individuales de 100 micras y desactive la colagenasa con un mililitro de FBS por tubo. Recoja los tenocitos por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos a tres veces 10 a la quinta celda por cada 10 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de concentración de solución antimicótica y antibiótica. A continuación, se siembran las células en una placa de cultivo de 100 centímetros por condición, y se cultivan los tenocitos en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante una semana, cambiando el medio de cultivo cada tres días hasta que se haya alcanzado una confluencia del 80%.

Para el análisis inmunocitoquímico, transfiera dos veces 10 a la quinta celda en 200 microlitros de medio fresco a cada pocillo de un portaobjetos de cámara de ocho pocillos por grupo experimental y cultive las células hasta la confluencia durante 24 horas. Al día siguiente, lavar las células con PBS, seguido de fijación con 500 microlitros de 4% de formaldehído por pocillo, y permeabilización con 0,5% de tritón X 100 en PBS durante 10 minutos. Para bloquear cualquier unión inespecífica, incubar las células con 1% de albúmina sérica bovina y 0,05% Tween 20 en PBS, según sea apropiado experimentalmente, seguido de una incubación con los anticuerpos primarios de interés marcados con harina a cuatro grados Celsius durante la noche protegidos de la luz.

A la mañana siguiente, etiquete las células con los anticuerpos secundarios apropiados durante una hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz, y monte las muestras con 0,5 microlitros de un medio de montaje de fluorescencia apropiado por cámara. A continuación, obtenga imágenes de las muestras en un microscopio de fluorescencia con un objetivo de 400 veces. Para el análisis patológico del tejido, incruste las muestras de tejido tendinoso de control formal y fijo y degenerado en cuatro a cinco mililitros de parafina y adquiera secciones de cuatro a cinco micras de cada bloque de parafina.

Para la hematoxilina en eosina, o tinción con H&E, desparafinar las muestras con tres inmersiones de cinco minutos en xileno, seguidas de hidratación con inmersiones graduadas en etanol y un lavado con agua del grifo de dos minutos. A continuación, etiquete las muestras con hematoxilina durante cinco minutos, seguido de otro lavado con agua de dos minutos. Sumerja las muestras enjuagadas en ácido clorhídrico al 1 % y etanol al 70 % durante tres segundos, seguido de un lavado con agua de tres minutos.

Neutralice el ácido con una inmersión de 10 segundos en amoníaco al 0,5%, seguida de otro lavado con agua de tres minutos. Etiquete las muestras neutralizadas con la eosina durante cinco minutos y deshidrate las muestras teñidas con H&E con inmersiones de etanol graduadas. Después de tres inmersiones de xileno, monte las muestras con un medio de montaje adecuado y un portaobjetos de cubierta.

Para realizar el análisis inmunohistoquímico de las muestras de tejido, utilice el kit de detección refinado de polímero de unión de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones menores. Después de la desparafinación con xileno como se ha demostrado, sumerja las muestras en una solución de recuperación de epítopos de enlace durante 30 minutos a 100 grados Celsius para la recuperación del antígeno, seguido de una incubación de cinco minutos en peróxido de hidrógeno para apagar cualquier peroxidasa endógena. A continuación, etiquete las secciones durante quince minutos a temperatura ambiente con los anticuerpos primarios de interés.

Al final de la incubación, etiquete las muestras con el sistema conjugado de anticuerpos secundarios enlazador de rábano picante polimérico sin biotina adecuado durante 50 minutos a temperatura ambiente. A continuación, monte las secciones con un cubreobjetos en el medio de montaje adecuado y obtenga imágenes de las muestras en un microscopio óptico con un aumento de 400 veces. Los análisis de H&E revelan que el tejido extraído de la epicondilitis lateral degenerada muestra haces de colágeno desorganizados con pérdida de polaridad y estructuras de fibras paralelas finas, rectas y fuertemente empaquetadas.

De hecho, los haces de colágeno son positivos para la tinción de azul alcián en las secciones de tejido degenerado, lo que indica una mayor presencia de proteoglicanos y glicosaminoglicanos dentro del tejido dañado. El análisis inmunohistoquímico de los tendones degenerados también indica una reacción positiva granular citoplasmática al factor de crecimiento endotelial vascular que no se observa en muestras de tejido tendinoso sano de control. Ambos tipos de células de muestra de tejido cultivado pueden confirmarse como tenocitos mediante inmunofluoraquímica, y la mayoría de las células cultivadas expresan marcadores representativos de tenocitos, como las proteínas mohawk y tenomodulina, y demuestran una apariencia alargada.

Cabe destacar que los tenocitos degenerativos también demuestran una mayor tasa de proliferación en cultivo en comparación con los tenocitos recolectados de controles sanos, así como una mayor expresión de múltiples genes que se sabe que están relacionados con el desarrollo de la tendinopatía. En conclusión, este protocolo validado con tenocitos degenerativos allana el camino para futuras investigaciones en biología tendinosa y para probar nuevas intervenciones.