Name: Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda a crear heridas crónicas en ratones diabéticos db/db-/- mediante inducción de estrés oxidativo y biofilm. Este modelo reproduce características clave de las heridas humanas crónicas para investigar mecanismos de cicatrización y probar terapias.

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Los autores no tienen reconocimientos.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una vez que se crean heridas crónicas en ratones, el modelo se puede utilizar para estudiar los procesos de cicatrización de heridas deteriorados involucrados en el inicio de la cronicidad. El modelo también se puede utilizar para probar la eficacia de una amplia gama de productos químicos y medicamentos que pueden revertir el desarrollo de heridas crónicas y la cicatrización deteriorada y conducir al cierre y la cicatrización de la herida. Se pueden estudiar diferentes puntos de tiempo después de la aparición de la cron...

La cicatrización de heridas implica procesos celulares y moleculares complejos que están regulados temporal y espacialmente, organizados en etapas secuenciales y superpuestas que involucran muchos tipos de células diferentes, incluyendo pero no limitado a la respuesta inmune y la sistema1. Inmediatamente después de que la piel sufre una lesión, los factores y las células sanguíneas se agregan al sitio de la herida e inician la cascada de coagulación para formar un coágulo. Después de que se logra la homeostasis, los vasos sanguíneos se dilatan para dejar entrar en el sitio de la herida oxígeno, nutrientes, enzimas, anticuerpos y factores quimiotácticos que quimioaparalan polimorproucleocitos para limpiar el lecho de la herida de desechos extraños y secretar enzimas proteolíticas 2.Las plaquetas activadas secretan una variedad de factores de crecimiento para estimular los queratinocitos en el borde de la herida para reepitelizar la zona herida. Los monocitos reclutados en el sitio de la herida diferencian en macrófagos que las bacterias fagocitosas y los neutrófilos muertos y secretan factores adicionales para mantener las señales proliferativas y pro-migratorias de queratinocitos. En la fase de proliferación, mientras continúa la reepitelización, el proceso de reconstrucción de nuevos tejidos de granulación compuestos de fibroblastos, monocitos/macrofagos, linfocitos y células endoteliales continúan el proceso de reconstrucción2. La angiogénesis se estimula promoviendo la proliferación y migración de células endoteliales, lo que resulta en el desarrollo de nuevos vasos. La epitelización y remodelación de la matriz extracelular construyen una barrera contra el medio ambiente. A medida que la herida se cura y el tejido de granulación evoluciona hacia una cicatriz, la apoptosis elimina las células inflamatorias, los fibroblastos y las células endoteliales sin causar daño adicional en los tejidos. La resistencia a la tracción del tejido se ve reforzada por la remodelación de fibroblastos de varios componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, por lo que el tejido recién formado es casi tan fuerte y flexible como la piel no herida2.
Cualquier desviación de esta progresión altamente concertada hacia el cierre de la herida conduce a heridas deterioradas y/o crónicas3. Las heridas crónicas se caracterizan por un aumento del estrés oxidativo, inflamación crónica, microvasculatura dañada y matriz de colágeno anormal en la herida4. El estrés oxidativo, especialmente en la herida, puede retrasar el cierre de la herida2,5. Cuando, en la primera etapa de la cicatrización de heridas, la fase inflamatoria se vuelve no regulada, el tejido huésped asume un daño extenso debido a una continua afluencia de células inflamatorias5 que liberan enzimas citotóxicas, un aumento de los radicales de oxígeno libre, y mediadores inflamatorios no regulados, resultando en la muerte celular6,7.
En este microambiente destructivo, las bacterias formadoras de biopelículas aprovechan los nutrientes del huésped y contribuyen al daño del tejido huésped2. Estas biopelículas son difíciles de controlar y eliminar porque las sustancias poliméricas extracelulares hidratadas compuestas de proteínas, ADN, ARN y polisacáridos permiten que las bacterias que se encuentran en su interior sean tolerantes a las terapias antibióticas convencionales y evadan la respuesta inmune innata y adaptativa del huésped2,8,9.
El estudio de las heridas crónicas es crucial porque afectan a 6,5 millones de personas y cuestan 40.000 millones de dólares al año solo en los Estados Unidos10. Los pacientes con diabetes tienen mayores riesgos de desarrollar heridas crónicas que requieren amputación para contener la propagación de la infección. Estos pacientes tienen un riesgo de mortalidad del 50% dentro de los 5 años siguientes a la amputación que se atribuye al mecanismo de fisiopatología de la diabetes11. La relación entre el sistema inmunitario del huésped y el microbioma en la cicatrización de heridas es un tema vital de la investigación en curso porque las consecuencias de las heridas crónicas, si no se resuelven, incluyen la amputación y la muerte12.
Aunque se ha invertido un esfuerzo significativo en la comprensión de cómo se desarrollan las heridas crónicas en los seres humanos, todavía no está claro cómo y por qué se forman heridas crónicas. Los experimentos para estudiar los mecanismos de curación deteriorada son difíciles de llevar a cabo en seres humanos, y los especialistas en curación de heridas solo ven pacientes con heridas crónicas que ya han alcanzado la cronicidad durante semanas o meses. Por lo tanto, los especialistas son incapaces de estudiar qué procesos salieron mal que llevan a que la herida se desarrolle para convertirse en crónica2. Hay una falta de modelos animales que recapitulen la complejidad de las heridas crónicas humanas. Hasta que nuestro modelo fue desarrollado, no existía ningún modelo para estudios crónicos de heridas.
El modelo de herida crónica se desarrolló en ratones que tienen una mutación en el receptor de leptina (db/db-/-)13. Estos ratones son obesos, diabéticos y tienen deterioro de la cicatrización, pero no desarrollan heridas crónicas14. Niveles de glucosa en sangre en promedio alrededor de 200 mg/dL, pero puede ser tan alto como 400 mg/dL15. Cuando se inducen altos niveles de estrés oxidativo (SA) en el tejido de la herida inmediatamente después de la herida, la herida se vuelve crónica16. Las heridas db/db-/- se consideran crónicas por 20 días y permanecen abiertas durante 60 días o más. Biofilm producido por bacterias se puede ver desarrollándose a partir de tres días después de la herida; una biopelícula madura se puede ver 20 días después de la herida y persiste hasta el cierre de la herida. Las bacterias formadoras de biopelículas que encontramos en estos ratones también se encuentran en heridas crónicas diabéticas humanas.
El estrés oxidativo es inducido por el tratamiento de las heridas con dos inhibidores de enzimas antioxidantes, catalasa y glutatión peroxidasa, dos enzimas con la capacidad de descomponer el peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es una especie reactiva de oxígeno y puede causar daño celular a través de la oxidación de proteínas, lípidos y ADN. La catalasa cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en sustancias químicas menos dañinas oxígeno y agua. 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) inhibe la catalasa uniéndose específicamente y covalentemente al centro activo de la enzima, inactivando17,18,19. ATZ se ha utilizado para estudiar los efectos del estrés oxidativo in vitro e in vivo a través de la inhibición de la catalasa20,21,22,23,24. Glutathione peroxidase cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno a través del antioxidante, glutatión, y es una enzima importante que protege la célula contra el estrés oxidativo25. El ácido mercaptosuccinico (MSA) inhibe la glutatión peroxidasa uniéndose al sitio activo de selenocisteína de la enzima con tiol, inactivando26. MSA se ha utilizado para estudiar los efectos del estrés oxidativo in vitro e in vivo así20,27,28.
Este novedoso modelo de heridas crónicas es un modelo poderoso para estudiar porque comparte muchas de las mismas características observadas en las heridas crónicas diabéticas humanas, incluyendo la inflamación prolongada por el aumento del sistema operativo y la formación de biopelícula natural a partir del microbioma de la piel. Las heridas han deteriorado la interacción dérmica-epidérmica, la deposición anormal de la matriz, la mala angiogénesis y la vasculatura dañada. Las heridas crónicas se desarrollarán tanto en ratones masculinos como femeninos, por lo que ambos sexos se pueden utilizar para estudiar heridas crónicas. Por lo tanto, el modelo de herida crónica puede contribuir significativamente a avanzar en la comprensión fundamental de cómo comienzan tales heridas. El uso de este modelo de herida crónica puede proporcionar respuestas a preguntas fundamentales sobre cómo se inicia / logra la cronicidad a través de contribuciones de la fisiología de la cicatrización de heridas deterioradas y el microbioma del huésped.

<table><tbody><tr><td>B6. BKS(D)-Leprdb/J&nbsp;</td><td>El laboratorio Jackson&nbsp;</td><td>00697</td><td>Homocigotos y heterocigotos disponibles&nbsp;</td></tr><tr><td>Loción depilatoria Nair con aloe calmante y lanolina</td><td>Nair</td><td></td><td>un depilatorio químico</td></tr><tr><td>Buprenex (buprenorfina HCl)</td><td>Henry Stein Animal Health</td><td>059122</td><td>0,3 mg/ml, clase 3</td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazol (ATZ)</td><td>TCI</td><td>A0432</td><td></td></tr><tr><td>Ácido mercatusuccínico (MSA)</td><td>Aldrich</td><td>88460</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>autoclave estéril</td></tr><tr>El tanque de <td></td> oxígeno<td></td><td></td><td></td> de isoflurano Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2</tr><tr><td></td><td>debe ser compatible con el sistema de vaporización</td>Vaporizador de isoflurano JA Baulch &<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Asociados&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortapelos</td><td>Wahl Wahl</td><td></td><td>Lithium Ion Pro</td></tr><tr><td>Acu Punch Punzones de biopsia de piel de 7 mm Acuderm</td><td>Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>3M</td><td>Ref: 1624W</td><td>Apósito de película transparente (6 cm x 7 cm)</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Conair</td><td></td><td>Moist Dry Thermal Thermal</td></tr><tr><td>Siringas de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td>al 70%</tr><tr><td>Pinzas Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quirúrgicas</td> <td>afiladas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td><td></td>de metal delgada</tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cono</td><td></td><td></td><td></td>de nariz de ratón</tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes</td><td></td><td></td><td></td> de plástico pequeños</tr></tbody></table>

protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Las heridas crónicas se desarrollan como resultado de una regulación defectuosa en uno o más procesos celulares y moleculares complejos involucrados en la curación adecuada. Afectan a 6,5 millones de personas y cuestan 40 millones de euros al año solo en los EE. UU. Aunque se ha invertido un esfuerzo significativo en entender cómo se desarrollan las heridas crónicas en los seres humanos, las preguntas fundamentales siguen sin respuesta. Recientemente, desarrollamos un novedoso modelo de ratón para heridas crónicas diabéticas que tienen muchas características de heridas crónicas humanas. Usando ratones db/db-/-, podemos generar heridas crónicas induciendo altos niveles de estrés oxidativo (OS) en el tejido de la herida inmediatamente después de la herida, utilizando un tratamiento único con inhibidores específicos de las enzimas antioxidantes catalasa y glutatión peroxidasa. Estas heridas tienen altos niveles de Sistema Operativo, desarrollan biofilm de forma natural, se vuelven completamente crónicas dentro de los 20 días después del tratamiento y pueden permanecer abiertas durante más de 60 días. Este nuevo modelo tiene muchas características de las heridas crónicas diabéticas en los seres humanos y por lo tanto puede contribuir significativamente a avanzar en la comprensión fundamental de cómo las heridas se vuelven crónicas. Este es un gran avance porque las heridas crónicas en los seres humanos causan dolor significativo y angustia a los pacientes y resultan en la amputación si no se resuelven. Además, estas heridas son muy costosas y requieren mucho tiempo de tratar, y conducen a una pérdida significativa de ingresos personales para los pacientes. Los avances en este campo de estudio a través del uso de nuestro modelo de heridas crónicas pueden mejorar significativamente la atención médica para millones de personas que sufren bajo esta condición debilitante. En este protocolo, describimos con gran detalle el procedimiento para hacer que las heridas agudas se vuelvan crónicas, lo que no se ha hecho antes.

La Figura 5 muestra un ejemplo de una herida sin tratamiento de inhibidores que progresan hacia el cierre de la herida y una herida con tratamiento de inhibidores que progresan hacia la cronicidad. El apósito transparente se ha dejado en su lugar en la herida crónica para que se pueda ver la biopelícula y la acumulación de líquido.
El inicio crónico de la herida tiene lugar en menos de 6 horas y el ...

Las heridas crónicas se desarrollan a partir de heridas agudas en un modelo de ratón diabético induciendo altos niveles de estrés oxidativo después de una herida cutánea de espesor completo. La herida se trata con inhibidores de la catalasa y glutatión peroxidasa, lo que resulta en un deterioro de la cicatrización y el desarrollo de biopelículas por bacterias presentes en el microbioma de la piel.

Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Este modelo de ratón puede ayudar a responder preguntas en el campo médico de la cronicidad de la herida. La principal ventaja de este modelo es que las heridas crónicas en ratones imitan muchos aspectos de las heridas crónicas en los seres humanos. Para comenzar, coloque el ratón sobre una superficie limpia y sosténjelo en su lugar pellizcando la base de su cola.A continuación, preparar los cortapelos y estar listo para tirar rápidamente de ellos lejos si el ratón hace algún movimiento repentino. Afeitar toda la espalda desde el cuello hasta la cola, incluso alrededor de la cola. Ejecuta ligeramente la hoja contra la dirección del crecimiento del cabello para obtener el corte más eficiente.No presione las pinzas profundamente en la piel, ya que esto puede tenertusiones o cortar. A continuación, preparar la piel para una aplicación de loción depilatoria. Humedezca la piel con una toalla de papel empapada en agua para evitar quemaduras químicas.Presione ligeramente con suficiente presión para mojar el cabello cortado contra la piel. Luego, mientras la piel está húmeda, frota una pequeña dollop de loción depilatoria en la región afeitada durante 15 a 20 segundos. Una vez aplicada, deja que la loción reaccione con la piel durante 20 a 45 segundos.Antes de enjuagar la loción, limpie ligeramente algunas lociones en varios lugares para comprobar la reacción. Si la piel es rosada y sin pelo, la reacción es completa. A continuación, agarre el ratón para lavarlo.Usando la mano nonteminante con el pulgar presione hacia abajo la base de su cola contra la palma y cierre los otros dedos. Luego, con la nariz del ratón hacia arriba y lejos del agua, deje que el agua corra sobre la espalda del animal. Luego rápidamente, pero suavemente, frota la parte posterior del ratón con la otra mano para lavar la loción.Después de retirar toda la crema depilatoria, seque la piel con una toalla de papel. Es importante no aplicar loción en las orejas, la cola o en cualquier lugar cerca de la cara. Si esto sucede, limpie inmediatamente la loción con una toalla húmeda y luego corra agua sobre el ratón para evitar daños en estas áreas.Si se observa algún parche oscuro después de usar la crema, vuelva a aplicar la crema a esas áreas. Los parches oscuros de la piel crecerán el cabello más rápido durante toda la duración del experimento. Así que corta el cabello cada tres a cinco días cuando sea necesario.Un parche o dos que no están sobre el sitio de la herida es aceptable, pero si la parte posterior del ratón tiene más parches oscuros, no lo utilice para el modelo de herida crónica. Después de quitar el cabello, alberga el ratón solo durante al menos un día antes de herir porque la piel será demasiado sensible de la loción depilatoria. 30 minutos antes de la cirugía, inyectar el ratón con 120 microlitros de buprenorfina intraperitonealmente en PBS estéril.Todos los volúmenes de este procedimiento suponen un ratón de 60 gramos. 20 minutos antes de la cirugía, inyectar el ratón con 480 microlitros de ATZ intraperitonealmente en PBS estéril. Divida el volumen a ambos lados del abdomen.Después de administrar el ATZ, coloque el ratón en un pequeño recipiente de plástico encima de una almohadilla de calentamiento caliente hasta que comience la cirugía. Cubra el recipiente pequeño con una toalla de papel para ayudar a contener el calor. El ratón debe calmarse mientras se calienta.Después de confirmar un estado anestesiado, proceda con la herida. Para comenzar el procedimiento de hirción, rocíe una toallita con 70% de etanol para limpiar la parte posterior del ratón para limpiar el sitio de la herida y la superficie de la piel. No limpie en exceso o habrá riesgo de matar las bacterias presentes en la piel.El éxito del modelo de herida crónica se basa en condiciones no estériles. Estos ratones no están libres de gérmenes y están alojados en un vivario convencional. El microbioma bacteriano que reside en la piel es crucial para la posterior iniciación y desarrollo de heridas crónicas tras el tratamiento con inhibidores de enzimas antioxidantes.Ahora considere dónde está el lugar de la herida. Idealmente, utilice el lado dorsal del ratón centrado y lejos de manchas oscuras de la piel. Ahora realice el procedimiento de hiriendo al apósito en 30 a 45 segundos.Primero presione ligeramente un puñetazo de biopsia de piel de siete milímetros en el sitio de la herida deseado y gire el punzón lo suficientemente profundo como para dejar una impresión del puñetazo. A continuación, excediendo la piel delineada tirando hacia arriba del centro del punzón con pinzas y cortando a lo largo del contorno con tijeras quirúrgicas. Una vez completada, cubra la herida firmemente con media pieza de apósito de película transparente.Dentro de los 10 minutos de la herida, aplicar una alícuota de 60 microlitros de MSA en PBS estéril y depositar MSA tópicamente sobre la herida. Más tarde, seis horas después de la cirugía, administrar otro hace de buprenorfina. Se pueden administrar dosis adicionales según sea necesario.El inicio crónico de la herida tiene lugar en menos de seis horas y el margen de la herida se altera visiblemente por el estrés oxidativo. Una herida crónica es una herida que permanece abierta, agrandada en comparación con la herida inicial y contiene biopelícula. Después de 20 días, la herida está en plena cronicidad.Las bacterias que forman biopelículas que dominan el sitio de la herida incluyen Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, y varias especies de Staphylococcus y Corynebacterium. Estas bacterias también se encuentran en heridas crónicas humanas. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo crear heridas crónicas en ratones.Una vez que haya establecido estas heridas crónicas, puede usarlas para investigar muchos de los mecanismos moleculares celulares involucrados en el inicio de la cronicidad de la herida.

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Medicina

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