Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara
10 de julio de 2018
El objetivo del presente artículo es proporcionar una descripción detallada de los procedimientos recomendados para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara.
Esta técnica ayudará a abordar cuestiones clave en varios campos, como la investigación respiratoria, la seguridad, la farmacología y el desarrollo de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona lecturas en las que se puede confiar para evaluar la función respiratoria en animales conscientes, tanto al inicio como durante las pruebas. La técnica es especialmente útil cuando el protocolo experimental requiere poca desviación del estado fisiológico normal de los animales.
El animal está inmovilizado, pero por lo demás respira normalmente, lo que permite evaluar el patrón de respiración, además de la obstrucción de las vías respiratorias. El día del experimento, inicie una sesión experimental y cargue el archivo de configuración adecuado. Introduce el experimento y la información del animal.
Una vez hecho esto, haga clic en el botón ejecutar en la parte inferior de la ventana. Proceda con la calibración del sistema. Calibre cada sitio y señal de entrada por separado.
Encienda el generador de flujo de polarización conectado a la cámara principal a través de un trozo de tubería y ajuste el caudal. Cierre la abertura superior de la cámara principal con una tapa. Separe el panel posterior de la cámara torácica.
A continuación, inserte firmemente la herramienta de calibración dentro de la abertura de goma entre el cabezal y la cámara del cuerpo para crear un sello hermético. Cierre y vuelva a colocar el panel posterior de la cámara torácica. En el menú de la barra de herramientas del software, vaya a Ajuste y, a continuación, a Calibrar.
Vaya a Entrada uno y seleccione calibrar para iniciar el cuadro de diálogo de calibración para la señal de flujo torácico. Verifique que los parámetros enumerados en la ventana de diálogo de calibración muestren la configuración adecuada. El valor bajo de la tensión física aplicada debe ser cero.
El valor alto de tensión física aplicado debe ser de menos 20 mililitros por segundo y las muestras deben configurarse para integrarse. Una vez hecho esto, haga clic en bajo en la ventana de muestras. Verifique que la señal generada sea constante en toda la ventana de visualización y luego haga clic en cerrar.
Conecte una jeringa de 20 mililitros a través del puerto lateral de la cámara torácica mediante un conector de plástico en un trozo de tubo. Seleccione alto en la ventana de muestras e inyecte inmediatamente 20 mililitros de aire en la cámara durante un período de dos segundos a un caudal lo más constante posible. Verifique que la señal generada aparezca completamente dentro de la ventana de visualización.
Utilice el icono de flecha para verificar si la señal está centrada y es simétrica alrededor de la línea cero. A continuación, haga clic en cerrar. Elimine cualquier desplazamiento de cero haciendo clic en Eliminar desplazamiento de CA en la ventana de muestras.
Calibre la cámara principal de manera similar a la cámara torácica seleccionando la entrada número dos. Esta vez, establezca el valor alto en más 20 mililitros por segundo en lugar de menos 20. Trabaje en un área tranquila alejada de la habitación de la vivienda.
Aclimatar a los animales al sistema de retención y a los procedimientos antes del inicio del experimento. Debido a que no es invasivo y no requiere anestesia, trabajar en condiciones en las que el animal esté cómodo, bien adaptado y tranquilo limitará la propensión a las fugas de pelo entre las cámaras y, por lo tanto, maximizará la calidad de los datos. Pesar a los animales.
Seleccione el sistema de retención adecuado para el animal. Inserte el animal dentro del sujetador procediendo de la abertura trasera. Sostener el dispositivo verticalmente puede ser útil.
Una vez que el animal esté en posición, inserte el émbolo trasero y asegúrelo suavemente en su lugar sin aplicar una fuerza excesiva. Comprobar visualmente que el animal respira con normalidad. Si es necesario, ajuste su posición moviendo el mecanismo de bloqueo.
Asegúrese de que las narinas del animal sobresalgan fuera del cono de la nariz con su hocico apoyado contra las paredes internas del sujetador. Separe el panel posterior de la cámara torácica. Inserte el sujetador que contiene el animal a través de la abertura de goma en la cámara torácica y cierre la cámara.
Coloque la cámara de la cabeza, proporcione un flujo de polarización y permita que el animal se relaje durante al menos cinco minutos. Una vez que el animal esté tranquilo, inicie el protocolo de comandos seleccionando el primer paso y luego haga clic en Ejecutar. Compruebe en la pantalla del ordenador que las señales respiratorias del animal son regulares y suaves.
El software muestra automáticamente los parámetros calculados respiración por respiración. Verifica que los parámetros del animal sean estables. Registre el patrón de respiración en condiciones de referencia durante un máximo de 10 minutos.
En el caso de los protocolos que impliquen la administración de una sustancia problema por aerosol, en primer lugar, ajuste el nebulizador a tiempo y ciclo de trabajo según sea necesario. Realice un desafío de vehículos y registre la respuesta. Si es necesario, exponga al animal a concentraciones crecientes de la sustancia problema cambiando la concentración en el nebulizador y escalando las etapas.
Registre la respuesta después de cada administración. En este ejemplo se prueban 15 miligramos por mililitro de metacolina. El aumento máximo en la resistencia específica de las vías respiratorias se registra un momento después y luego se observa que vuelve lentamente al valor basal.
Al final de la sesión experimental, devuelva al animal a su habitación y jaula de alojamiento. Entre sesiones, limpie las cámaras del pletismógrafo y enjuague el nebulizador con agua. Proceda al análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.
Aquí se muestra el resultado de una evaluación repetida de la función respiratoria al inicio del estudio durante tres días consecutivos en dos grupos de ratones BALB/c. Un control y otro con inflamación alérgica pulmonar. Se obtuvieron valores estables y comparables para una selección de parámetros proporcionados por la pletismografía bicameral.
Estos valores se graficaron para la frecuencia respiratoria, el volumen del título, la ventilación por minuto, la pausa inspiratoria final, el flujo al volumen espiratorio medio del título y la resistencia específica de la vía aérea. Los cambios en la función respiratoria y la respuesta al aumento de las dosis de metacolina inhalada también se realizaron en días sucesivos para evaluar el grado de respuesta en ratones control y alérgicos C57BL/6. Los resultados muestran el aumento progresivo esperado en la resistencia específica de las vías respiratorias con dosis crecientes de metacolina con un grado exagerado de respuesta en los ratones alérgicos en el segundo y en el tercer día.
Al día siguiente se midió la resistencia newtoniana con la técnica de oscilación forzada. Los cambios en este parámetro reflejan principalmente variaciones en la resistencia de las grandes vías respiratorias conductoras. La resistencia newtoniana medida al inicio y en respuesta a la metacolina se correlacionó bien con la resistencia específica de la vía aérea medida obtenida el día anterior en los mismos animales.
Esta técnica es conveniente para evaluar a numerosos animales a la vez, para capturar la cinética de una respuesta aguda, así como para medir la función respiratoria de manera repetida durante un experimento que duró varios días. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la técnica de asociación forzada para complementar la evaluación con mediciones directas de la mecánica respiratoria como la resistencia de la vía aérea. La pletismografía de doble cámara proporciona un enfoque realmente interesante para evaluar el patrón de respiración y la geografía de la obstrucción de las vías respiratorias, especialmente cuando el protocolo experimental requería que los animales estuvieran conscientes.
Visión general
Este artículo detalla los procedimientos para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes utilizando pletismografía de doble cámara. Esta técnica es crucial para la investigación respiratoria y el desarrollo de medicamentos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Investigación respiratoria
- Farmacología de seguridad
- Desarrollo de medicamentos
Antecedentes
- La pletismografía de doble cámara permite la evaluación de la función respiratoria sin anestesia.
- La técnica mantiene el estado fisiológico normal del animal.
- Proporciona datos confiables sobre los patrones de respiración y la obstrucción de las vías respiratorias.
- La aclimatación de los animales es esencial para la calidad de los datos.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la evaluación de la función respiratoria en ratones.
- Mejorar la comprensión de las respuestas respiratorias en varias condiciones.
- Facilitar las pruebas de medicamentos y las evaluaciones de seguridad.
Métodos utilizados
- Calibración del sistema de pletismografía.
- Restricción de los animales de manera cómoda.
- Registro de patrones de respiración basales.
- Administración de sustancias de prueba por aerosol.
Principales resultados
- Se registraron parámetros respiratorios estables durante días consecutivos.
- Se evaluaron las respuestas a la metacolina en ratones control y alérgicos.
- Se observó un aumento en la resistencia de las vías respiratorias con dosis crecientes de metacolina.
- Los datos mostraron diferencias significativas en la capacidad de respuesta entre los grupos.
Conclusiones
- La pletismografía de doble cámara es efectiva para la evaluación de la función respiratoria.
- El método proporciona datos confiables tanto para estados basales como desafiados.
- Es adecuado para evaluar los efectos de los medicamentos en la investigación respiratoria.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Assessing respiratory function in conscious animals is critical for preclinical safety pharmacology and respiratory drug development, where maintaining physiological relevance improves translational confidence. Double-chamber plethysmography enables non-invasive, repeated measurements of breathing patterns and airway resistance in unrestrained, spontaneously breathing mice, supporting mechanistic de-risking of inhaled therapeutics. The technique provides quantitative, reproducible readouts that align with early discovery to lead optimization workflows by delivering reliable baseline and challenge-response data without anesthetic confounders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to airway reactivity and bronchoconstriction pathways in disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by measuring physiological outputs in conscious animals under baseline and challenged conditions.
- Predictive Value: Provides respiratory function readouts that help de-risk target engagement and mechanism of action in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative parameters such as specific airway resistance, tidal volume, and minute ventilation for compound screening.
- Reproducibility: Enables parallel monitoring of multiple animals and repeated assessments over days, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with aerosolized substance administration, supporting dose-response profiling in safety pharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated utility in allergic inflammation models, enabling evaluation of genotype-phenotype correlations in respiratory disease.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase respiratory phenotypes to preclinical validation through consistent, anesthesia-free measurements.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go assessments by quantifying responsiveness to bronchoconstrictive agents like methacholine across experimental groups.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for respiratory and inhaled therapeutic programs requiring functional respiratory endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of airway obstruction mechanisms and pathway modulation in genetic or disease models.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantification of respiratory parameters for compound effect assessment.
- Analytics: Provides breathe-by-breathe calculated parameters including specific airway resistance and flow metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains physiological continuity from in vivo discovery to preclinical studies by avoiding anesthetic artifacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for longitudinal respiratory monitoring across multiple studies and compound series.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by delivering physiologically relevant respiratory data in conscious, unrestrained animals.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and minimal procedural bias through acclimatization and bias flow control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing false positives from anesthetic or stress-induced respiratory artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of respiratory compounds based on validated, repeatable airway resistance measurements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, restrainer use, and plethysmograph system operation.
- Depends on calibrated instrumentation, bias flow generators, and nebulizer systems for aerosol delivery.
- Necessitates cross-team standardization of acclimatization protocols and environmental controls to minimize data variability.
- Involves adaptation considerations across mouse strains and disease models, as demonstrated in BALB/c and C57BL/6 backgrounds.
- Limited by potential hair leaks and chamber seal integrity, which can be mitigated through proper animal acclimatization and quiet experimental conditions.
