Name: Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a evaluar la función respiratoria en ratones conscientes mediante pletismografía de doble cámara. Este método no invasivo permite medir patrones de respiración y resistencia de las vías aéreas sin anestesia.

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SML es apoyado por una beca de los institutos canadienses de investigación en salud, MG es apoyado por una beca de la red de salud respiratoria de la FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) y YB es becario de investigación del FRQS.
CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES Todos los autores contribuyeron a la concepción del manuscrito o el video. SML y LD recopilaron los datos. SML, LD, YB, DM, DB y AR contribuyen al análisis de datos, la generación de figuras y escritura de manuscrito. YB, AR, KL y MG estuvieron implicados en la preparación de la escritura de la video. La obra fue realizada por YB, KL y MG.

Los procedimientos fueron aprobados por el corazón de Quebec y el Comité de cuidado del Animal Instituto de pulmón según las directrices del Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal (CCAC).
1. preparación
<ol><li>Estudio
	<ol>
<li>(Crítica) Antes de realizar cualquier experimento, obtener las aprobaciones apropiadas (por ejemplo, IACUC) y entrenamientos (p. ej., manejo de animales).</li>
		<li>Familiarizarse con el equipo y el software operativo. Manuales de instrucciones del usuario y, si es necesario, crear un archivo de configuración para definir el número de sitios, señales, analizadores y los parámetros de entrada. Nota: Asegúrese de seleccionar una frecuencia de muestreo alta (2 KHz).</li>
		<li>Configurar las opciones de analizadores para los parámetros de interés.<ol>
<li>Seleccione ajuste de la barra de herramientas y luego analizadores.</li>
			<li>Ajustar el umbral de flujo a un valor que separa correctamente las respiraciones (ratón: 0,5 mL/s) y optar por Ti + Te calcular la tasa de respiración.</li>
			<li>Defina un valor para la presión barométrica (760 mm Hg) y especifique la desviación máxima del volumen inspiratorio/espiratorio de un aliento para ser considerado válido (ratón: 20%).</li>
			<li>Haga clic en configuración en el campo de los parámetros calculados para ajustar los límites de aceptación. Nota: Los siguientes parámetros se utilizaron para los experimentos de ratón descrito: tiempo de inspiración, ms de 50 a 170; tiempo de expiración, ms de 40 a 180; frecuencia de la respiración, bpm de 30 a 450; resistencia de vía aérea específica, 0 a 15 cmH2O·s; flujo midexpiratory con una precisión de al menos 3 decimales.</li>
			<li>Una vez completado, seleccione aplicar y cerrar para salir de la ventana de diálogo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Desde el menú de barra de herramientas, ir a Tuning otra vez y luego almacenamiento de información para establecer una tasa de almacenamiento de datos deseados. Haga clic en aplicar y cerrar para salir de la ventana. Nota: Un promedio en cada 10 s se utiliza normalmente.</li>
		<li>Crear un protocolo en el software operativo para definir una secuencia de comandos y el momento deseado para cada uno. Un ejemplo se muestra en la figura 1.</li>
		<li>Si el experimento consiste en la administración de una sustancia por aerosol, preparar diluciones según las concentraciones a ensayar las soluciones adecuadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Animal
	<ol>
<li>Trabajo en una zona tranquila alejada de la habitación de la vivienda. Permitir a los animales ajustar al cambio del medio ambiente.</li>
		<li>Pesan los animales y seleccionar el tamaño del alojamiento apropiado.</li>
		<li>(Crítica) Aclimatar a los animales para el limitador y procedimientos antes del inicio del experimento. Dependiendo del diseño experimental, varias sesiones de aclimatación de aumento de la duración (por ejemplo, 5-30 min) puede ser necesaria. Nota: Animales que no adapte deben retirarse del estudio.<ol>
<li>En cada sesión de aclimatación, introducir el animal en el limitador, procede la abertura hacia atrás; sostener verticalmente el dispositivo puede ser útil.</li>
			<li>Una vez que el animal está en posición, inserte el émbolo posterior y suavemente bloquearlo sin aplicar una fuerza excesiva.</li>
			<li>(Crítica) Verifique visualmente que el animal respira normalmente. Si es necesario, ajustar su posición al mover el mecanismo de bloqueo. Asegúrese de que nares del animal son que sobresalen fuera del cono de nariz con su hocico apoyado contra las paredes internas del limitador.</li>
			<li>Separar la parte trasera de la cámara torácica, inserte el limitador que contiene el animal a través de la goma en la cámara torácica y cerrar la cámara.</li>
			<li>Conecte la cámara principal y proporcionan un flujo diagonal. Utilizar un flujo de 0.5 L/min para un ratón.</li>
			<li>Permite al animal descansar por 5 minutos.</li>
			<li>Una vez que el animal está tranquilo, iniciar la grabación de las señales de flujo nasal y torácica. Verificar en la pantalla del ordenador que los rastros son lisos y que muestran un patrón de respiración regular; ver ejemplo en figura 2. Nota: Si el protocolo consiste en la administración de aerosoles de una sustancia, un desafío solución salino puede incluirse en el procedimiento de aclimatación.</li>
			<li>Al final de cada sesión, sacar el animal de la cámara torácica y el limitador y devolverlo a su jaula de alojamiento y habitación.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Equipo
	<ol>
<li>En el día del experimento, iniciar una sesión experimental y cargar el archivo de configuración apropiada. Nota: Verificar que contenga el protocolo deseado para el experimento.</li>
		<li>Vaya a Ejecutar en el menú de la barra de herramientas. Entrar en el experimento y la información del animal. Una vez hecho esto, haga clic en el botón Ejecutar en la parte inferior de la ventana.</li>
		<li>Proceder con la calibración del sistema. Calibrar cada sitio y entrada de señal por separado.<ol>
<li>Encienda el generador de flujo diagonal, conectarlo a la cámara principal a través de un pedazo de tubo y ajustar el flujo.</li>
			<li>Cerrar la abertura superior de la cámara de cabeza con un gorro.</li>
			<li>Quitar la parte trasera de la cámara torácica, Inserte firmemente la herramienta de calibración dentro del caucho entre la cabeza y la cámara de cuerpo para crear un sello hermético. Luego cierre y vuelva a colocar el panel posterior de la cámara torácica.</li>
			<li>Verificar que el puerto lateral de la cámara torácica es un tope.</li>
			<li>Desde el menú de barra de herramientas de software, ir a Tuning y luego calibrar.</li>
			<li>Ir a la entrada 1 (torácica) y seleccione calibrar para lanzar el cuadro de diálogo de calibración para la señal de flujo torácica.</li>
			<li>(Crítica) Verificar que los parámetros listados en la ventana de diálogo de calibración muestran los ajustes correspondientes, es decir, estrés físico aplicado bajo valor: 0; Estrés físico aplicado alto valor:-20 mL/s; Muestras: integrar. Una vez hecho esto, haga clic en baja en la ventana de muestras .</li>
			<li>Verificar que la señal generada es constante a través de la ventana de visualización y haga clic en cerrar.</li>
			<li>Conecte una jeringa de 20 mL a través del puerto lateral de la cámara torácica usando un conector de plástico y un trozo de tubería.</li>
			<li>(Crítica) Seleccione el alta en la ventana de muestras e inmediatamente inyectar 20 mL de aire en la cámara durante 2 s con un caudal lo más constante posible.</li>
			<li>Compruebe que la señal generada aparece completamente dentro de la ventana de visualización. Utilice el icono de flecha para comprobar si la señal es centrada y simétrica alrededor de la línea de cero. Luego, haga clic en cerrar. Retire cualquier desplazamiento de cero haciendo clic en eliminar AC offset en la ventana de muestras Nota: La calibración de alto valor se puede rehacer, si es necesario.</li>
			<li>Verificar que la resultante Gama de escalado de entrada esté dentro del intervalo recomendado (ratón: ±280 a ±420 mL/s). (Crítica) Repita los pasos de calibración si los valores están fuera del rango aceptable.</li>
			<li>Calibrar la cámara principal de una manera similar como la cámara torácica (paso 1.3.3.6). Esta vez, seleccione la entrada 2 (nasal). Nota: (Importante) El valor de estrés físico aplicado alto valor debe establecerse en + 20 mL/seg. Esto va a cambiar la polaridad de la corriente en la cámara frontal en relación con la cámara posterior. Por lo tanto, cuando el animal respira, las señales de dos flujo casi estén en fase, aparte de la demora para calcular sRaw.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. mediciones de función pulmonar
<ol><li>Pesan los animales y tenga en cuenta su peso corporal.</li>
	<li>Inserte el animal en el limitador y coloque dentro de la cámara de pletismografía torácica (pasos 1.2.3.1 a 1.2.3.5).</li>
	<li>Permite al animal descansar por al menos 5 minutos.</li>
	<li>Para empezar el protocolo de comandos, seleccione el primer paso y a continuación, haga clic en Ejecutar.</li>
	<li>Compruebe en la pantalla del ordenador que la respiración del animal señales son regular y liso (figura 2). El software automáticamente muestra los parámetros calculados sobre una base de respiración por respiración. Verificar que los parámetros del animal son estables.</li>
	<li>Grabar el patrón de respiración bajo las condiciones iniciales hasta 10 minutos.</li>
	<li>Para los protocolos que implican la administración de una sustancia por aerosol, haga lo siguiente:<ol>
<li>Ajusta el ciclo de tiempo y obligación de nebulizador, como sea necesario. Nota: En los ejemplos en este artículo, el nebulizador fue funcionado en un ciclo de trabajo de 5% durante 10 s.</li>
		<li>Realizar un reto de vehículo (por ejemplo, solución salina) y registrar la respuesta.</li>
		<li>Si es necesario, exponer el animal al aumento de las concentraciones de la sustancia al cambiar la concentración en el nebulizador en escalada de pasos (por ejemplo, duplicar las concentraciones). Registro de la respuesta después de cada administración.</li>
		<li>Al final de la sesión experimental, si no se hace automáticamente, detener la grabación y devolver el animal a su jaula de alojamiento y habitación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si es necesario, seleccione Ejecutar desde el menú de la barra de herramientas para ejecutar otra sesión experimental.<ol>
<li>Entre sesiones, limpiar las cámaras de pletismógrafo y enjuague el nebulizador con agua. Nota: El consumo de alcohol puede causar daños irreversibles en el pletismógrafo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si el estudio implica evaluaciones repetidas en el tiempo, repetir la secuencia de medición entero en cada punto elegido. Nota: Sabiamente se recomienda complementar el estudio con algunas mediciones precisas de la mecánica respiratoria o pulmonar volúmenes1,15.</li>
</ol>3. Análisis de los datos
Nota: El software automáticamente guarda el archivo experimental y exporta los parámetros registrados cuando la sesión experimental.
<ol><li>Calcular un promedio de referencia para los parámetros de interés para cada grupo animal y experimental. Nota: la tabla 1 enumera una serie de parámetros típicos, categorizados según el tipo de información que proporcionan.</li>
	<li>Cuando proceda, evaluar el efecto de la sustancia aerosolizada estudiada sobre los parámetros de interés en cada concentración con un punto específico (por ejemplo, valor máximo o mínimo), un promedio o el curso de tiempo completo; también se puede considerar una normalización a línea de fondo.</li>
	<li>Informar de los resultados con el grupo medios y errores en una tabla o formato gráfico. Analizar estadísticamente los resultados. Nota: En el presente estudio, ANOVAs de dos vías con repitieron medidas se utilizaron para evaluar el efecto de metacolina, alérgenos, ácaros de polvo de la casa (HDM) – y su interacción en diferentes lecturas de la DCP (sRaw y EF50), así como en diferentes lecturas FOT (RN, G y H), en ambas cepas de ratones. Pruebas de comparación múltiples de Sidak entonces fueron utilizadas para determinar las concentraciones de metacolina en el cual los ratones alérgicos difieren de los ratones de control. Se utilizaron las mismas pruebas para evaluar el efecto de días, HDM y su interacción en línea de base (es decir, antes del methacholine) en lecturas de obstrucción de vía aérea (sRaw y EF50) y del patrón de ventilación (BF, TV, MV y EIP). Correlaciones de Pearson se utilizaron para evaluar las correlaciones entre sRaw obtenidos con la DCP y RN obtenidas con el FOT. Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con estándar estadístico software alternativo (p. ej., GraphPad Prism). p ≤ 0.05 se consideró suficiente para rechazar la hipótesis nula.</li>
</ol>

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Investigación respiratoria claramente está garantizada la capacidad para medir la función pulmonar en animales conscientes. En general, el DCP es un enfoque interesante para evaluar la función de ventilación del sistema respiratorio en consciente y en respiración espontánea animales26. Más específicamente, el DCP, o su variante de cabeza-hacia fuera, a menudo golpea un equilibrio correcto entre la calidad de la información suministrada y el nivel deseado de invasividad3 (tabla 2). La técnica puede adaptarse a diferentes especies (e.g., ratón, rata, conejillo de Indias) o animales tamaños y puede ser utilizada en muchas aplicaciones de investigación. Es particularmente útil evaluar numerosos animales a la vez en un diseño de estudio paralelo, para controlar la función respiratoria de manera repetida y capturar la cinética de la respuesta en el tiempo. Además, la técnica es sencilla y puede ser aprendida en forma relativamente oportuna. En el documento, un protocolo que emplea medidas de DCP en ratones fue utilizado como un ejemplo para describir los aspectos prácticos de esta restringida técnica de pletismografía, así como para discutir los pasos críticos y relacionados con los resultados.
Cuando se trabaja con animales conscientes, es esencial para el control de las condiciones del entorno (por ejemplo, habitación tranquila con un número limitado de personas o actividad) con el fin de generar resultados reproducibles. Puesto que el restrainers vienen en varias dimensiones, es importante empezar con el tamaño adecuado para que los movimientos de respiración son imperturbable. También es útil y a menudo necesario para aclimatar a los animales para el montaje experimental y los procedimientos, como está bien establecido en ratones que la restricción afecta a la respiración frecuencia12. Dependiendo del diseño experimental o las condiciones, pueden necesitarse varias sesiones de duraciones incrementales. Por último, dejando tiempo al comienzo de un experimento para que ajustar al cambio de habitación y manejo necesario de los animales es una consideración simple que resultó eficaz para asegurarse de que el patrón de respiración es siempre regular y relajado al inicio del estudio. Trabajar en condiciones donde los animales son confortables, bien adaptado y tranquilo también será beneficioso en términos de calidad y variabilidad del resultado. También limita cualquier liberación inducida por el estrés de las catecolaminas, que pueden aumentar el calibre de las vías respiratorias y atenuar una broncoconstricción inducida.
Es importante entender que hay una necesidad de separar tan herméticamente como sea posible el flujo nasal y torácica. Dependiendo del sistema o especies estudiadas, el mecanismo de cierre puede variar en forma, así como en eficacia. En el DCP que describimos en este documento, se crea el sello entre el hocico del animal y el dispositivo de restricción. Al evaluar la función respiratoria por DCP, también es esencial para proporcionar un flujo de polarización suficiente y continuado, como una disminución en el nivel de oxígeno disponible para el animal producirá efectos significativos. Teniendo en cuenta el bienestar del animal en el limitador limita la propensión para fugas de aire por agitación y así maximiza la calidad de los datos. En contraste, una ruptura en el sello resultará en conjuntos de datos rechazados o una subestimación de algunos parámetros.
Además para permitir la grabación separada de la señal de flujo nasal, la cámara principal se utiliza normalmente para exponer al animal a sustancias aerosolized. Como se ilustra en este artículo, esto puede ser utilizado para realizar una prueba de bronchoprovocation para demostrar diferentes grados de capacidad de respuesta. En dichos experimentos, ajustar el rango de concentraciones probadas puede ser necesaria dependiendo de la especie, cepa o sexo de los animales estudiados. Como demostrado anteriormente8,9,10,27, los resultados muestran que los cambios inducidos por la metacolina en sRaw correlacionaron bien con medidas invasivas de FOT de resistencia de vía aérea. Los resultados también demuestran que la técnica DCP no es tan sensible como el FOT para que su capacidad para detectar disfunción respiratoria y para identificar una respuesta alterada dentro de los compartimientos más bajos del pulmón (tejido del pulmón o las vías aéreas periféricas pequeñas) . Puesto que las vías respiratorias del animal intactas, la presencia de las vías aéreas superiores, que representa la mayor parte de la resistencia respiratoria total al flujo de aire28, puede afectar la distribución del aerosol y deposición además de humedecer la contribución de las vías aéreas más bajas para una medición. La tabla 3 resume otras diferencias entre la técnica DCP y el FOT. Por último, si bien sería teóricamente posible estimar la resistencia de vía aérea total del animal (incluyendo las vías respiratorias superiores) de una medida de funcionamiento a pajar, se recomienda generalmente para complementar la evaluación DCP con una técnica de medición invasiva tales como el FOT29 para obtener mediciones directas de la detallada mecánica respiratoria. Dependiendo de los objetivos del estudio, las mediciones de resistencia de vía aérea superior también se pueden considerar30,31,32.
Conclusión  Debido a su limitado grado de invasividad, el DCP es una técnica que puede satisfacer una necesidad importante en la investigación respiratoria. Es capaz de proporcionar lecturas exactas del modelo ventilación en animales conscientes simultáneamente con algunos índices indiscutibles de la obstrucción del flujo de aire. La información obtenida complementa también verdaderamente de más invasivos.

El uso cada vez mayor de pequeños animales a enfermedades respiratorio humano modelo ha impulsado el desarrollo de técnicas para evaluar cuantitativamente las funciones del sistema respiratorio en los animales. Actualmente, la técnica de oscilación forzada (FOT) es reconocida como el método más preciso para evaluar la mecánica respiratoria en pequeños animales1,2. Sin embargo, como afirma el principio de incertidumbre de phenotyping, lo que se gana en precisión de la medida con el FOT cotiza apagado contra una pérdida de noninvasiveness3. De hecho, las mediciones de la FOT se adquieren bajo condiciones experimentales altamente controladas que requieren anestesia, traqueotomía o intubación por vía oral, así como ventilación mecánica; un escenario muy lejos de la vida real.
En situaciones donde los requerimientos experimentales proscriben el uso de agentes anestésicos o convocatoria de poca o ninguna desviación del estado fisiológico natural del animal, puede considerarse doble cámara Pletismografía (DCP). Como su nombre indica, una configuración DCP consiste en dos compartimientos rígidos conectados construidos para aislar herméticamente como sea posible la cabeza del animal (o nariz), en la cámara frontal, su tórax, en la cámara posterior. Dentro de la configuración, el animal está consciente y respira espontáneamente mientras que siendo refrenado. Porque las paredes de las cámaras no se pueden expandir o retraer, el movimiento del aire de entrada y salida del animal genera una correspondiente pero opuesto forma de onda dentro de la cámara posterior, como resultado de la compresión/descompresión de aire circundante. La forma de onda debido al flujo nasal en la cámara frontal y se relaciona con el movimiento torácico en la cámara posterior puede así separado y capturado al mismo tiempo. Dependiendo del diseño de la instalación DCP, estas formas de onda pueden ser adquiridas mediante un conjunto de transductores de presión o pneumotachographs respectivamente, grabar los cambios en presión o flujo de entrada y salida de las cámaras de aire en función del tiempo. Este último enfoque es más común hoy en día.
Mientras que la frecuencia de respiración del animal puede determinarse con precisión cualquier tipo de técnicas de la pletismografía, la situación no es la misma para la determinación del volumen de marea y sus parámetros de ventilación relacionados (p. ej., ventilación minuto, volumen espiratorio, etc.). A diferencia de la técnica de pletismógrafo de cuerpo entero (WBP), donde se estima el volumen tidal del animal desde la caja de4,señal5, la técnica DCP proporciona evaluaciones precisas del volumen tidal. Esto está relacionado con la adquisición directa del movimiento torácica del animal en la cámara posterior, que son proporcionales a los cambios en el volumen pulmonar durante la respiración.
Además de estos parámetros ventilatorios precisos (por ejemplo, el volumen tidal, frecuencia respiratoria y ventilación minuto), algunos disturbios en la forma del ciclo respiratorio también pueden utilizarse para investigar aspectos neuronales que gobiernan el respiratoria o reflejos respiratorios. Un ejemplo concreto de que la aplicación sería la evaluación del potencial de irritación de sustancias inhaladas en las neuronas sensoriales de vía aérea superior6. Aquí, la duración de una pausa en el inicio de la caducidad se determina mediante un parámetro llamado pausa inspiratoria final (EIP), también conocida como duración del frenado6. La prolongación de esta pausa por una sustancia irritante es asociada con el cierre de la glotis del animal, provocando un período mensurable de frenada en la primera parte de la caducidad6,7.
Otra ventaja importante de la DCP es que proporciona dos parámetros validados e indiscutibles que son sensibles a la obstrucción del flujo de aire. Uno se llama el flujo en volumen espiratorio mediados-de marea y es abreviado EF508,9,10. Es el flujo de aire en el volumen medio de cada respiración de marea durante la expiración. EF50 se extrae del rastro de flujo torácica y por lo tanto puede ser medido sin la cámara frontal (es decir, en una configuración de salida de la cabeza). El otro se llama resistencia de vía aérea específica y abreviada sRaw11,12,13. La determinación de sRaw requiere la grabación simultánea del flujo nasal y torácica del animal como se computa desde el tiempo de retardo entre estos rastros respiratorios separados en el punto de flujo cero en el final de la inspiración. La razón que describe la base por la que este retraso se refiere a sRaw se expatiated previamente11. En pocas palabras, los cambios en el volumen pulmonar preceden el movimiento del aire desde un gradiente de presión tiene que desarrollar en orden al flujo de aire de impulsión. En un animal sano respirar tranquilamente, este retraso es típicamente muy pequeña. Sin embargo, el gradiente de presión que se requiere para acomodar un flujo determinado (por ejemplo, un flujo suficiente para proporcionar una ventilación adecuada) está influenciado por el grado de resistencia de vía aérea. Durante la broncoconstricción, por ejemplo, el gradiente de presión necesario para un flujo dado es mayor, lo que implica que el animal tiene que trabajar más duro para respirar. Un mayor gradiente de presión en el tórax del animal también implica que una mayor parte del flujo de entrada y salida de la cámara posterior es debido a la descompresión y compresión de aire dentro del tórax, que es la parte de la total expansión/retracción torácica que es fuera de fase con el flujo nasal. El aumento de la resistencia debido a la broncoconstricción así aumentará el retraso entre la parte trasera y las cámaras frontales y aumenta de tal modo sRaw. El gradiente de presión que impulsa la circulación de aire entrada y salida del pulmón también se ve influido por el volumen inicial de gas torácico (TGV). En un TGV mayor por ejemplo, la expansión/contracción del tórax es necesario generar un determinado gradiente de presión es mayor (simplemente porque el desplazamiento de volumen que se requiere para generar un determinado gradiente de presión es mayor), que también implica que el animal tiene que trabajar más duro para respirar. Una vez más, estos desplazamientos extra torácicas son las requeridas para descomprimir/comprimir aire en el tórax y son así fuera de fase con el flujo nasal. Por lo tanto, una mayor TGV también aumentará el retraso entre las cámaras y aumenta de tal modo sRaw. Como puede verse, broncoconstricción y aumento de TGV como resultado de un esfuerzo más importante de entrada y salida del pulmón el aire. Esto es, en esencia, el significado fisiológico de funcionamiento a pajar. Representa el trabajo necesario para respirar5,14.
Por lo tanto es importante entender que dos distintos factores influyen en la sRaw: resistencia de vía aérea y TGV. De hecho, sRaw puede expresarse como el producto de la resistencia de las vías respiratorias y TGV11. Animales conscientes pueden modificar su TGV en la voluntad, en cuanto a adaptar su ventilación a un entorno determinado. En estas condiciones, donde el estado fisiológico natural del animal es inalterado, así es imposible discernir si un cambio en sRaw surge de una alteración en la resistencia de vía aérea, de un cambio en el TGV o de una mezcla de los dos. Por lo tanto, se recomienda complementar la evaluación DCP con más mediciones invasivas de la mecánica respiratoria o volúmenes pulmonares, tales como los proporcionados por el FOT1,15.
Hasta la fecha, el DCP se ha utilizado en diversas aplicaciones de la investigación. La técnica puede utilizarse con o sin la cámara cabeza cuantitativamente y evaluar con precisión el efecto de diversas sustancias, tales como agentes farmacéuticos, alergenos, irritantes u otros mediadores, en la función respiratoria en los animales pequeños conscientes 1617,de,18. La cámara frontal también puede utilizarse como una cámara de exposición a sustancias aerosolized o diferentes gases concentraciones (hipoxia, hipercapnia, etc.)19. Convenientemente, permite medir concomitante los efectos agudos de estas exposiciones. De hecho, uno de los usos comunes del DCP es evaluar el grado de sensibilidad a la metacolina aerosolizada en diferentes modelos de enfermedades respiratorias20,21,22,23, 24 , 25.
Aunque la técnica DCP es aparentemente sencilla, algunos desafíos prácticos pueden disuadir a los usuarios inexpertos o afectar a la exactitud y reproducibilidad de los resultados. El presente trabajo proporciona una descripción detallada de los procedimientos recomendados para grabar con éxito de la función respiratoria por DCP en ratones conscientes, sobrio y respirando espontáneamente. La descripción es específica para el equipo indicado (consulte la Tabla de materiales). La utilidad y el valor del DCP también se demuestra en un modelo común de la inflamación alérgica en dos cepas de ratones probados en condiciones basales y en respuesta a la metacolina aerosolized.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de acetil-&beta;-metilcolina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>Fosfato de metacolina</td></tr><tr><td>solución salina tamponada</td><td>Multicell</td><td>311-506-CL</td><td>PBS 10X</td>Extracto de</tr><tr><td>ácaros del polvo doméstico</td><td>GREER 290902</td><td></td><td>HDM&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema completo DCP</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iox software</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizador Aerogen Aeroneb</td> <td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema completo flexiVent FX</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por pletismografía de doble cámara

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Cambios de volumen de aire creadas por un sujeto consciente respiración espontáneamente dentro de una caja de cuerpo están en la base de la pletismografía es una técnica no invasiva evaluar algunas características de la función respiratoria en los seres humanos, así como en animales de laboratorio. El presente artículo se centra en la aplicación de la pletismografía de doble cámara (DCP) en pequeños animales. Proporciona información sobre la metodología, así como un procedimiento paso a paso detallado para evaluar con éxito la función respiratoria en consciente, respiración espontánea animales de una manera no invasiva. El DCP puede utilizarse para monitorear la función respiratoria de animales múltiples en paralelo, así como identificar los cambios inducidos por sustancias aerosolizadas durante un período de tiempo escogido y de manera repetida. Experimentos en ratones alérgicos y control se utilizan aquí para demostrar la utilidad de la técnica, explicar los parámetros de resultado asociado, así como para discutir los relacionados con ventajas y deficiencias. En general, el DCP proporciona lecturas válidas y teóricamente sano que se pueden confiables para evaluar la función respiratoria de animales pequeños conscientes al inicio y después de problemas con sustancias aerosolized.

El objetivo del presente artículo es proporcionar una descripción detallada de los procedimientos recomendados para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara.

Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Esta técnica ayudará a abordar cuestiones clave en varios campos, como la investigación respiratoria, la seguridad, la farmacología y el desarrollo de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona lecturas en las que se puede confiar para evaluar la función respiratoria en animales conscientes, tanto al inicio como durante las pruebas. La técnica es especialmente útil cuando el protocolo experimental requiere poca desviación del estado fisiológico normal de los animales.El animal está inmovilizado, pero por lo demás respira normalmente, lo que permite evaluar el patrón de respiración, además de la obstrucción de las vías respiratorias. El día del experimento, inicie una sesión experimental y cargue el archivo de configuración adecuado. Introduce el experimento y la información del animal.Una vez hecho esto, haga clic en el botón ejecutar en la parte inferior de la ventana. Proceda con la calibración del sistema. Calibre cada sitio y señal de entrada por separado.Encienda el generador de flujo de polarización conectado a la cámara principal a través de un trozo de tubería y ajuste el caudal. Cierre la abertura superior de la cámara principal con una tapa. Separe el panel posterior de la cámara torácica.A continuación, inserte firmemente la herramienta de calibración dentro de la abertura de goma entre el cabezal y la cámara del cuerpo para crear un sello hermético. Cierre y vuelva a colocar el panel posterior de la cámara torácica. En el menú de la barra de herramientas del software, vaya a Ajuste y, a continuación, a Calibrar.Vaya a Entrada uno y seleccione calibrar para iniciar el cuadro de diálogo de calibración para la señal de flujo torácico. Verifique que los parámetros enumerados en la ventana de diálogo de calibración muestren la configuración adecuada. El valor bajo de la tensión física aplicada debe ser cero.El valor alto de tensión física aplicado debe ser de menos 20 mililitros por segundo y las muestras deben configurarse para integrarse. Una vez hecho esto, haga clic en bajo en la ventana de muestras. Verifique que la señal generada sea constante en toda la ventana de visualización y luego haga clic en cerrar.Conecte una jeringa de 20 mililitros a través del puerto lateral de la cámara torácica mediante un conector de plástico en un trozo de tubo. Seleccione alto en la ventana de muestras e inyecte inmediatamente 20 mililitros de aire en la cámara durante un período de dos segundos a un caudal lo más constante posible. Verifique que la señal generada aparezca completamente dentro de la ventana de visualización.Utilice el icono de flecha para verificar si la señal está centrada y es simétrica alrededor de la línea cero. A continuación, haga clic en cerrar. Elimine cualquier desplazamiento de cero haciendo clic en Eliminar desplazamiento de CA en la ventana de muestras.Calibre la cámara principal de manera similar a la cámara torácica seleccionando la entrada número dos. Esta vez, establezca el valor alto en más 20 mililitros por segundo en lugar de menos 20. Trabaje en un área tranquila alejada de la habitación de la vivienda.Aclimatar a los animales al sistema de retención y a los procedimientos antes del inicio del experimento. Debido a que no es invasivo y no requiere anestesia, trabajar en condiciones en las que el animal esté cómodo, bien adaptado y tranquilo limitará la propensión a las fugas de pelo entre las cámaras y, por lo tanto, maximizará la calidad de los datos. Pesar a los animales.Seleccione el sistema de retención adecuado para el animal. Inserte el animal dentro del sujetador procediendo de la abertura trasera. Sostener el dispositivo verticalmente puede ser útil.Una vez que el animal esté en posición, inserte el émbolo trasero y asegúrelo suavemente en su lugar sin aplicar una fuerza excesiva. Comprobar visualmente que el animal respira con normalidad. Si es necesario, ajuste su posición moviendo el mecanismo de bloqueo.Asegúrese de que las narinas del animal sobresalgan fuera del cono de la nariz con su hocico apoyado contra las paredes internas del sujetador. Separe el panel posterior de la cámara torácica. Inserte el sujetador que contiene el animal a través de la abertura de goma en la cámara torácica y cierre la cámara.Coloque la cámara de la cabeza, proporcione un flujo de polarización y permita que el animal se relaje durante al menos cinco minutos. Una vez que el animal esté tranquilo, inicie el protocolo de comandos seleccionando el primer paso y luego haga clic en Ejecutar. Compruebe en la pantalla del ordenador que las señales respiratorias del animal son regulares y suaves.El software muestra automáticamente los parámetros calculados respiración por respiración. Verifica que los parámetros del animal sean estables. Registre el patrón de respiración en condiciones de referencia durante un máximo de 10 minutos.En el caso de los protocolos que impliquen la administración de una sustancia problema por aerosol, en primer lugar, ajuste el nebulizador a tiempo y ciclo de trabajo según sea necesario. Realice un desafío de vehículos y registre la respuesta. Si es necesario, exponga al animal a concentraciones crecientes de la sustancia problema cambiando la concentración en el nebulizador y escalando las etapas.Registre la respuesta después de cada administración. En este ejemplo se prueban 15 miligramos por mililitro de metacolina. El aumento máximo en la resistencia específica de las vías respiratorias se registra un momento después y luego se observa que vuelve lentamente al valor basal.Al final de la sesión experimental, devuelva al animal a su habitación y jaula de alojamiento. Entre sesiones, limpie las cámaras del pletismógrafo y enjuague el nebulizador con agua. Proceda al análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.Aquí se muestra el resultado de una evaluación repetida de la función respiratoria al inicio del estudio durante tres días consecutivos en dos grupos de ratones BALB/c. Un control y otro con inflamación alérgica pulmonar. Se obtuvieron valores estables y comparables para una selección de parámetros proporcionados por la pletismografía bicameral.Estos valores se graficaron para la frecuencia respiratoria, el volumen del título, la ventilación por minuto, la pausa inspiratoria final, el flujo al volumen espiratorio medio del título y la resistencia específica de la vía aérea. Los cambios en la función respiratoria y la respuesta al aumento de las dosis de metacolina inhalada también se realizaron en días sucesivos para evaluar el grado de respuesta en ratones control y alérgicos C57BL/6. Los resultados muestran el aumento progresivo esperado en la resistencia específica de las vías respiratorias con dosis crecientes de metacolina con un grado exagerado de respuesta en los ratones alérgicos en el segundo y en el tercer día.Al día siguiente se midió la resistencia newtoniana con la técnica de oscilación forzada. Los cambios en este parámetro reflejan principalmente variaciones en la resistencia de las grandes vías respiratorias conductoras. La resistencia newtoniana medida al inicio y en respuesta a la metacolina se correlacionó bien con la resistencia específica de la vía aérea medida obtenida el día anterior en los mismos animales.Esta técnica es conveniente para evaluar a numerosos animales a la vez, para capturar la cinética de una respuesta aguda, así como para medir la función respiratoria de manera repetida durante un experimento que duró varios días. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la técnica de asociación forzada para complementar la evaluación con mediciones directas de la mecánica respiratoria como la resistencia de la vía aérea. La pletismografía de doble cámara proporciona un enfoque realmente interesante para evaluar el patrón de respiración y la geografía de la obstrucción de las vías respiratorias, especialmente cuando el protocolo experimental requería que los animales estuvieran conscientes.

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Investigación

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Medicine

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