Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los polímeros de ADN, la fidelidad y la reparación del ADN, como los métodos de corrección y análisis, y en la definición del parche de reparación del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que es muy específica, sencilla, rápida y fácil de realizar. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a que aún se encuentran en la replicación del ADN y el campo de reparación pueden no estar familiarizados con la instrumentación de espectrometría de masas y la interpretación de datos.

Creo que lo más importante es que la demostración visual es muy importante, ya que podemos mostrar cómo nuestra espectrometría de masas desarrollada comercialmente para aplicaciones clínicas, como la mutación y la diputación, se puede adaptar convenientemente para la corrección de pruebas de ADN y el estudio de reparación. Los estudiantes graduados de Rong-Syuan y Kuei-Ching de mi laboratorio demostrarán el procedimiento. Comience este procedimiento con la preparación del cebador y la plantilla como se describe en el protocolo de texto.

A modo de ejemplo, utilice un desajuste TG del sustrato P21 con T28 para la corrección. Diluir la imprimación P21 y la plantilla T28 a 12,5 picomoles por microlitro con agua. A continuación, transfiera 12 microlitros del cebador diluido y 12 microlitros de la plantilla diluida a un tubo de microcentrífuga esterilizado de 1,5 mililitros.

Después de cerrar herméticamente el tubo, incube el tubo durante 30 minutos en un baño de agua cubierto a 65 grados centígrados. Luego, incube durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Y, por último, coloque el tubo sobre hielo para asegurar un recocido adecuado.

A un tubo de microcentrífuga esterilizado de 1,5 mililitros, agregue ocho microlitros de mezcla de cebador y plantilla, dos microlitros de tampón de reacción de revisión 10x, cuatro microlitros de mezcla 4ddNTP y agua hasta 18 microlitros. Mueve el tubo para mezclar. Diluya la ADN polimerasa en un tampón de reacción de corrección 1x helado hasta la concentración deseada.

Guarde la enzima diluida en hielo en todo momento. Precaliente el tubo de microcentrífuga con la mezcla de sustrato a la temperatura de reacción deseada. A continuación, transfiera dos microlitros de la ADN polimerasa diluida a la mezcla de sustrato precalentada y agite el tubo para mezclar su contenido.

Centrifugar los tubos con enzima y sustrato durante unos segundos a 3200 veces la gravedad a temperatura ambiente para reducir los componentes de las reacciones. Transfiera inmediatamente la reacción a un bloque calefactor o a un baño de agua a la temperatura de incubación deseada. Para finalizar la reacción, agregue un volumen igual de fenol tamponado y mezcle la reacción mediante vórtice durante unos segundos.

Luego, centrifuga la reacción en una microcentrífuga a 3200 veces la gravedad a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y agregue un volumen igual de cloroformo. Después de mezclarlo por vórtice durante unos segundos, centrifugar la muestra en una microcentrífuga a 3200 veces la gravedad a temperatura ambiente durante tres minutos.

Transfiera la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio. Después de incubar la reacción a 95 grados centígrados durante cinco minutos, coloque el tubo sobre hielo. A continuación, realice la adición de resina para eliminar la contaminación por sal en una placa de 384 pocillos como se detalla en el protocolo de texto.

Coloque las placas de muestra en el dispensador de nanolitros. Coloque el chip de matriz y la placa de 384 pocillos preparada en la bandeja correspondiente. Opere el nano-dispensador para detectar los productos de reacción en el chip.

Presione el botón de ejecución en la pantalla táctil del nanodispensador para comenzar. Verifique la imagen capturada automáticamente de los puntos de muestra que contienen información de saturación en la pantalla para asegurarse de que el volumen total manchado en el chip sea de alrededor de cinco a 10 nanolitros. Repita el rastreo de muestras si el volumen es insuficiente.

Prepare un archivo en formato Excel que contenga la información de señal anticipada para la importación. Cree y defina un nuevo ensayo en el programa de aplicación haciendo clic con el botón derecho del ratón en importar grupo de ensayos en formato de diseñador y seleccione el archivo de Excel. Establezca la placa de ensayo objetivo a través del árbol de opciones de placa del proyecto del cliente en el lado izquierdo de la pantalla haciendo clic con el botón derecho en la parte superior del árbol y asignándole un nombre de archivo.

Seleccione el tipo de placa de 384 pocillos y presione OK. Aparecerá una placa en blanco. Seleccione el ensayo adecuado en el lado izquierdo de la pantalla. Asigne el ensayo seleccionado para cada posición de muestra manchada en el chip resaltando el pocillo y haciendo clic con el botón derecho para seleccionar agregar plex.

A continuación, prepare una lista de trabajo de todas las pruebas en el chip en formato Excel sin encabezado. Importe la lista de trabajo a través de la opción Añadir nuevo proyecto de muestra. Asigne la prueba y la lista de trabajo a cada posición del ensayo P21T28 y elija haciendo clic con el botón derecho.

Conecte el espectrómetro de masas al chip mediante el programa de aplicación. Seleccione la configuración predeterminada en el lado derecho de la pantalla. Rellene el nombre del ensayo y el ID del chip en la esquina del chip.

Guarde la configuración e inicie el programa de control MS. Presione el botón de entrada / salida y saque la placa de exploración. Coloque el chip manchado en la placa de exploración y presione el botón de entrada / salida para que el chip manchado ingrese al espectrómetro de masas.

Haga clic en el botón Adquirir del programa de aplicación para iniciar la espectrometría de masas y adquirir los datos. Abra el programa para el análisis de datos. Navegue por el árbol de la base de datos en la esquina superior izquierda y seleccione el ID del chip.Abra el archivo de datos en el lado derecho de la pantalla.

Haga clic en el icono de espectro para mostrar el espectro de masas. Para recortar un rango específico de masa de sobrecarga, haga clic con el botón derecho para seleccionar el cuadro de diálogo de personalización. En la nueva ventana, haga clic en el eje x y establezca el límite superior e inferior deseado y presione OK para mostrar el rango especificado del espectro.

Exporte el espectro para el mantenimiento de registros haciendo clic con el botón derecho en exportar. Seleccione el tipo de archivo JPEG, haga clic en destino, seleccione examinar disco, escriba el nombre del archivo y luego haga clic en exportar. Para la cuantificación de datos, utilice el cursor y haga clic en el pico para mostrar la altura del pico en la esquina superior izquierda.

En MALDI-TOF MS existe una relación inversa entre la intensidad máxima y la masa de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos de 17 a 24 nucleótidos se sometieron a un análisis de MS. Se calcularon las intensidades relativas de la señal y se pudieron utilizar para la cuantificación del ensayo de corrección o reparación.

Tanto las señales de molde como las de cebador se pueden encontrar en el espectro de masas. Debido a las diferencias de tamaño, las señales de las plantillas y sus productos de degradación parcial no específicos estaban bien separadas de los cebadores y productos de revisión que no coincidían. Aquí se muestra una revisión de un terminal de tres TG.At cinco minutos, el producto corregido fue del 23% frente al 17% del producto de escisión.

Esta diferencia siguió aumentando hasta el 69% frente al 14% a los 20 minutos. Obsérvese la alta resolución de la EM que separa claramente las señales subrectas y de producto con una diferencia de sobrecarga de masa de sólo 32. También se podían resolver fácilmente dos tipos de productos de escisión para la revisión de un bolígrafo Ultimate TG.

Los productos intermedios de escisión de un nucleótido y dos productos de escisión de nucleótidos. La revisión de los desajustes internos mostró una clara tendencia en la eficiencia de la corrección. Como lo demuestra un gran lenguaje de producto corregido, se observó una mayor eficiencia cuando las subrectas tenían desajustes en el último, penúltimo, tercer y cuarto nucleótidos de los tres extremos principales, en comparación con los desajustes en otras posiciones.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras aplicaciones, como el cribado pesado de corrección polimérica, para descubrir e inventar nuevos fármacos para la investigación farmacéutica. Esta técnica también allana el camino para que los investigadores en el campo de la replicación y reparación del ADN obtengan más información sobre la medicina del gnomo y su reproducción fiel para todos los organismos vivos.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la revisión de ADN y el ensayo de reparación mediante el análisis de espectrometría de masas MADI-TOF. No olvide que trabajar con esfenocloroformo puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, mientras se realiza el procedimiento. El protocolo alternativo que figura en el texto podría considerarse un sustituto más seguro.