Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

El glioblastoma multiforme sigue siendo el tumor cerebral primario más frecuente y agresivo en adultos. A pesar de los tratamientos agresivos basados en cirugía seguida de radio y quimioterapia, el GBM se asocia con un pronóstico extremadamente malo y una mediana de supervivencia inferior a 15 meses. Dado que se han realizado pocos avances terapéuticos en la última década, actualmente se exploran las inmunoterapias celulares para eliminar las células GBM altamente invasivas y resistentes que probablemente estén involucradas en la recaída tumoral rápida.

La administración de factores inmunológicos citotóxicos reactivos a GBM seleccionados en las proximidades del tumor podría representar una oportunidad única para administrar inmunoterapia celular concentrada, directamente en el sitio de la neoplasia maligna residual. Nuestro grupo demostró recientemente que los ratones NSG inmunodeficientes portadores de xenoinjerto de GBM humano primario ortotópico recapitulan el GBM a un mayor desarrollo en los pacientes. Estos modelos de GBM se utilizaron para evaluar la eficacia de los efectores inmunitarios citotóxicos en las inyecciones intratumorales.

Este protocolo describe nuestro proceso terapéutico basado en primer lugar en el aislamiento y amplificación de células efectoras inmunitarias reactivas a GBM. En segundo lugar, la propagación de estas células efectoras para inyección intercraneal. Y tercero, su inyección estereotáctica en el sitio del tumor dentro del cerebro del ratón.

También se investigó el comportamiento del efector inmune después de la inyección ortotópica. Tres semanas después de la estimulación del feto con PHA, las células efectoras, que forman un grupo de células en el fondo del matraz, deberían haber vuelto al estado de reposo y estar listas para ser utilizadas. Después de verificar el recuento de células efectoras, vuelva a suspender y recoja las células en un tubo de 115 mililitros y centrifugarlas.

Retire con cuidado y por completo un sobrenadante. Y resuspender las células en PBS estériles y centrifugar para lavarlas. Retire con cuidado y por completo el sobrenadante.

Y luego resuspender las células en un mililitro de PBS estéril. Células de transferencia en un microtubo para centrifugación. De nuevo, retire con cuidado y por completo el sobrenadante pipeteando lentamente.

El siguiente paso es crítico, resuspender las células en la mitad del volumen final de PBS estéril y homogeneizar suave y cuidadosamente. Verifique el volumen final con micropipeta, el volumen final por ratón tiene que estar entre 15 y 20 microlitros para 20 millones de células. Asegúrese de que no exceda los 20 microlitros por mouse.

Mantenga las células en hielo hasta la inyección. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado con un pellizco en los dedos de los pies y luego retire el pelo del sitio quirúrgico, entre las dos orejas y hasta la nariz. Vuelva a suspender las células lentamente para evitar la aglomeración de células y cargue la suspensión de las células en la jeringa con mucho cuidado para evitar la presencia de burbujas.

A continuación, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada. Desinfecte el sitio quirúrgico con sal y povidona yodada al 5% y coloque una pomada oftálmica lubricante en los ojos del ratón para evitar que se seque la córnea. A continuación, coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico de un bloque caliente.

Coloque correctamente la nariz y los dientes del ratón por encima de la barra de dientes. Apriete las barras de los oídos firmemente en las orejas del ratón para inmovilizar la cabeza. Tenga cuidado de no dañar los tímpanos, comprometer la respiración y asegúrese de que la cabeza esté bien inmovilizada.

Haga una incisión en la piel sagital de la línea media con tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo para exponer el cráneo. Identifique la intersección de las estructuras sagital y coronal para que sirvan como puntos de referencia para la localización estereotáctica y coloque la jeringa por encima de este punto. Mueva la jeringa en coordenadas predeterminadas.

Dos milímetros lateral derecho, y 0,5 milímetros anterior de la Usando un microtaladro, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca estéril. Tenga cuidado de permanecer superficial para evitar lesiones cerebrales. Inserte la jeringa con cuidado en el orificio perforado.

Mueva lentamente la aguja hacia adelante tres milímetros hacia abajo en la duramadre, y luego retroceda 0,5 milímetros hasta una profundidad final de inyección de células de 2,5 milímetros. Ejecute la inyección celular a dos o tres microlitros por minuto y controle a los ratones durante todo el tiempo de inyección. Una vez completada la inyección, retire la aguja solo un milímetro y mantenga la jeringa en su lugar durante un minuto adicional antes de retirar lentamente la jeringa por completo para evitar cualquier fuga del sitio de infusión.

Retire con cuidado al animal del marco estereotáctico. Cierre la piel con una sutura quirúrgica adecuada y aplique gel de lidocaína al 2% directamente sobre la herida. Transfiera el ratón anestesiado a su jaula respectiva sobre la almohadilla térmica ajustada a 37 grados Celsius para mantener la temperatura corporal adecuada del ratón hasta la recuperación completa de la anestesia.

Como la suspensión es muy concentrada, se comprobó la viabilidad y reactividad de la célula. Las células efectoras se cargaron en jeringa para imitar la inyección in vivo. Las células se recolectaron inmediatamente o 10 minutos después y se analizaron por citometría de flujo para la tinción con yoduro de propidio.

Como se puede ver, la preparación y la carga no afectaron a la viabilidad de las células efectoras a las 24 horas. La reactividad frente a las células tumorales de glioblastoma también se comprobó utilizando células no preparadas o efectores preparados y permanecieron tres horas en los ojos. La reactividad se monitoriza mediante la tinción positiva del marcador de activación CD107A.

Estos resultados demuestran que la reactividad de las células efectoras no se vio afectada por la preparación. Siete días después de la inyección de las células efectoras, se recolectaron cerebros de ratones, se seccionaron y se tiñeron para determinar la coloración hemática y permitir la identificación de la estructura tumoral. Luego, la tinción anti-CD3 humana permitió la localización de las células efectoras.

Curiosamente, se encontraron células efectoras alrededor del tumor y en el núcleo tumoral, pero también en el hemisferio contralateral. Las células T efectoras humanas aisladas del cerebro de ratón 48 horas después de la inyección representan el 2% de las células cerebrales. Todavía eran capaces de proliferar en presencia de PHA, alimentadores y estimulación de IL2, con una pureza del 99% después de la amplificación.

Gracias a este protocolo, las células efectoras humanas en reposo pueden sobrevivir y patrullar con un parénquima cerebral de ratón durante varios días después de la inyección estereotáxica. En conclusión, la transferencia adoptiva de células efectoras humanas mediante inyecciones estereotácticas representa enfoques prometedores para tratar eficazmente los tumores cerebrales malignos infiltrantes con efectos deletéreos limitados en las células sanas. Esta vía de administración aprovecha que las células humanas se entregan cerca del sitio del tumor, limitando su dilución dentro de los tejidos y el organismo.

Aquí describimos el procedimiento después de la administración de una gran cantidad de células inmunitarias dentro del tumor cerebral sin efectos nocivos sobre las células efectoras y, lo que es más importante, sin ningún efecto deletéreo visible en los ratones. Además, las células inmunitarias inyectadas localmente en el cerebro del ratón no solo son capaces de sobrevivir y mantener su capacidad de ser activadas y amplificadas ex vivo, sino también de eliminar las células tumorales diseminadas en el tejido cerebral circundante. En conjunto, estas características son esenciales para permitir la eliminación de las células tumorales infiltrativas fuertes que caracterizan a los tumores GBM.

Este protocolo abre una nueva oportunidad para el establecimiento de un procedimiento de transferencia adoptiva en ratones con modelos de tumor cerebral. Paso esencial antes de plantearse la EC clínica.