Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos
1 de septiembre de 2018
Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.
El glioblastoma multiforme sigue siendo el tumor cerebral primario más frecuente y agresivo en adultos. A pesar de los tratamientos agresivos basados en cirugía seguida de radio y quimioterapia, el GBM se asocia con un pronóstico extremadamente malo y una mediana de supervivencia inferior a 15 meses. Dado que se han realizado pocos avances terapéuticos en la última década, actualmente se exploran las inmunoterapias celulares para eliminar las células GBM altamente invasivas y resistentes que probablemente estén involucradas en la recaída tumoral rápida.
La administración de factores inmunológicos citotóxicos reactivos a GBM seleccionados en las proximidades del tumor podría representar una oportunidad única para administrar inmunoterapia celular concentrada, directamente en el sitio de la neoplasia maligna residual. Nuestro grupo demostró recientemente que los ratones NSG inmunodeficientes portadores de xenoinjerto de GBM humano primario ortotópico recapitulan el GBM a un mayor desarrollo en los pacientes. Estos modelos de GBM se utilizaron para evaluar la eficacia de los efectores inmunitarios citotóxicos en las inyecciones intratumorales.
Este protocolo describe nuestro proceso terapéutico basado en primer lugar en el aislamiento y amplificación de células efectoras inmunitarias reactivas a GBM. En segundo lugar, la propagación de estas células efectoras para inyección intercraneal. Y tercero, su inyección estereotáctica en el sitio del tumor dentro del cerebro del ratón.
También se investigó el comportamiento del efector inmune después de la inyección ortotópica. Tres semanas después de la estimulación del feto con PHA, las células efectoras, que forman un grupo de células en el fondo del matraz, deberían haber vuelto al estado de reposo y estar listas para ser utilizadas. Después de verificar el recuento de células efectoras, vuelva a suspender y recoja las células en un tubo de 115 mililitros y centrifugarlas.
Retire con cuidado y por completo un sobrenadante. Y resuspender las células en PBS estériles y centrifugar para lavarlas. Retire con cuidado y por completo el sobrenadante.
Y luego resuspender las células en un mililitro de PBS estéril. Células de transferencia en un microtubo para centrifugación. De nuevo, retire con cuidado y por completo el sobrenadante pipeteando lentamente.
El siguiente paso es crítico, resuspender las células en la mitad del volumen final de PBS estéril y homogeneizar suave y cuidadosamente. Verifique el volumen final con micropipeta, el volumen final por ratón tiene que estar entre 15 y 20 microlitros para 20 millones de células. Asegúrese de que no exceda los 20 microlitros por mouse.
Mantenga las células en hielo hasta la inyección. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado con un pellizco en los dedos de los pies y luego retire el pelo del sitio quirúrgico, entre las dos orejas y hasta la nariz. Vuelva a suspender las células lentamente para evitar la aglomeración de células y cargue la suspensión de las células en la jeringa con mucho cuidado para evitar la presencia de burbujas.
A continuación, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada. Desinfecte el sitio quirúrgico con sal y povidona yodada al 5% y coloque una pomada oftálmica lubricante en los ojos del ratón para evitar que se seque la córnea. A continuación, coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico de un bloque caliente.
Coloque correctamente la nariz y los dientes del ratón por encima de la barra de dientes. Apriete las barras de los oídos firmemente en las orejas del ratón para inmovilizar la cabeza. Tenga cuidado de no dañar los tímpanos, comprometer la respiración y asegúrese de que la cabeza esté bien inmovilizada.
Haga una incisión en la piel sagital de la línea media con tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo para exponer el cráneo. Identifique la intersección de las estructuras sagital y coronal para que sirvan como puntos de referencia para la localización estereotáctica y coloque la jeringa por encima de este punto. Mueva la jeringa en coordenadas predeterminadas.
Dos milímetros lateral derecho, y 0,5 milímetros anterior de la Usando un microtaladro, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca estéril. Tenga cuidado de permanecer superficial para evitar lesiones cerebrales. Inserte la jeringa con cuidado en el orificio perforado.
Mueva lentamente la aguja hacia adelante tres milímetros hacia abajo en la duramadre, y luego retroceda 0,5 milímetros hasta una profundidad final de inyección de células de 2,5 milímetros. Ejecute la inyección celular a dos o tres microlitros por minuto y controle a los ratones durante todo el tiempo de inyección. Una vez completada la inyección, retire la aguja solo un milímetro y mantenga la jeringa en su lugar durante un minuto adicional antes de retirar lentamente la jeringa por completo para evitar cualquier fuga del sitio de infusión.
Retire con cuidado al animal del marco estereotáctico. Cierre la piel con una sutura quirúrgica adecuada y aplique gel de lidocaína al 2% directamente sobre la herida. Transfiera el ratón anestesiado a su jaula respectiva sobre la almohadilla térmica ajustada a 37 grados Celsius para mantener la temperatura corporal adecuada del ratón hasta la recuperación completa de la anestesia.
Como la suspensión es muy concentrada, se comprobó la viabilidad y reactividad de la célula. Las células efectoras se cargaron en jeringa para imitar la inyección in vivo. Las células se recolectaron inmediatamente o 10 minutos después y se analizaron por citometría de flujo para la tinción con yoduro de propidio.
Como se puede ver, la preparación y la carga no afectaron a la viabilidad de las células efectoras a las 24 horas. La reactividad frente a las células tumorales de glioblastoma también se comprobó utilizando células no preparadas o efectores preparados y permanecieron tres horas en los ojos. La reactividad se monitoriza mediante la tinción positiva del marcador de activación CD107A.
Estos resultados demuestran que la reactividad de las células efectoras no se vio afectada por la preparación. Siete días después de la inyección de las células efectoras, se recolectaron cerebros de ratones, se seccionaron y se tiñeron para determinar la coloración hemática y permitir la identificación de la estructura tumoral. Luego, la tinción anti-CD3 humana permitió la localización de las células efectoras.
Curiosamente, se encontraron células efectoras alrededor del tumor y en el núcleo tumoral, pero también en el hemisferio contralateral. Las células T efectoras humanas aisladas del cerebro de ratón 48 horas después de la inyección representan el 2% de las células cerebrales. Todavía eran capaces de proliferar en presencia de PHA, alimentadores y estimulación de IL2, con una pureza del 99% después de la amplificación.
Gracias a este protocolo, las células efectoras humanas en reposo pueden sobrevivir y patrullar con un parénquima cerebral de ratón durante varios días después de la inyección estereotáxica. En conclusión, la transferencia adoptiva de células efectoras humanas mediante inyecciones estereotácticas representa enfoques prometedores para tratar eficazmente los tumores cerebrales malignos infiltrantes con efectos deletéreos limitados en las células sanas. Esta vía de administración aprovecha que las células humanas se entregan cerca del sitio del tumor, limitando su dilución dentro de los tejidos y el organismo.
Aquí describimos el procedimiento después de la administración de una gran cantidad de células inmunitarias dentro del tumor cerebral sin efectos nocivos sobre las células efectoras y, lo que es más importante, sin ningún efecto deletéreo visible en los ratones. Además, las células inmunitarias inyectadas localmente en el cerebro del ratón no solo son capaces de sobrevivir y mantener su capacidad de ser activadas y amplificadas ex vivo, sino también de eliminar las células tumorales diseminadas en el tejido cerebral circundante. En conjunto, estas características son esenciales para permitir la eliminación de las células tumorales infiltrativas fuertes que caracterizan a los tumores GBM.
Este protocolo abre una nueva oportunidad para el establecimiento de un procedimiento de transferencia adoptiva en ratones con modelos de tumor cerebral. Paso esencial antes de plantearse la EC clínica.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este estudio presenta un protocolo para la preparación y administración estereotáxica de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con tumores cerebrales primarios humanos ortotópicos. Demuestra la viabilidad y la eficacia antitumoral de las inmunoterapias celulares administradas intracerebralmente.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Inmunoterapia
Antecedentes
- El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor cerebral primario más agresivo en adultos.
- Los tratamientos actuales ofrecen un pronóstico deficiente, con una supervivencia mediana de menos de 15 meses.
- Se están explorando inmunoterapias celulares para atacar las células de GBM resistentes.
- Se utilizan modelos de ratones inmunodeficientes NSG para estudiar el GBM y probar estrategias terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficacia de los efectores inmunitarios citotóxicos administrados intratumoralmente.
- Establecer un protocolo para la administración de linfocitos humanos en un modelo preclínico.
- Proporcionar una prueba de concepto para la inmunoterapia celular en el tratamiento del GBM.
Métodos Utilizados
- Preparación de linfocitos humanos alogénicos.
- Administración estereotáxica en ratones inmunodeficientes.
- Evaluación de la eficacia antitumoral en modelos ortotópicos humanos de GBM.
- Evaluación de la viabilidad del tratamiento y sus resultados.
Resultados principales
- Preparación y administración exitosas de linfocitos humanos.
- Efectos antitumorales demostrados en el modelo de ratón con GBM.
- Factibilidad de administrar inmunoterapias celulares directamente en el sitio del tumor.
- Potencial para mejorar las estrategias de tratamiento contra el GBM.
Conclusiones
- La administración intracerebral de inmunoterapias celulares es factible.
- El estudio respalda el uso de linfocitos humanos en el tratamiento del GBM.
- Se justifica realizar más investigaciones para optimizar los enfoques terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transferencia adoptiva estereotáxica de células inmunitarias citotóxicas permite una administración precisa de inmunoterapia celular a xenoinjertos ortotópicos de glioblastoma, abordando el desafío de dirigirse a células tumorales invasivas y resistentes a la quimio y radioterapia en el parénquima cerebral. Este enfoque preclínico facilita la reducción mecanicista de riesgos de candidatos inmunoterapéuticos al demostrar supervivencia, localización y actividad antitumoral de linfocitos humanos infundidos in vivo. El método proporciona una plataforma trasladable para evaluar la persistencia, reactividad y biodistribución de células inmunitarias antes del avance clínico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el seguimiento de la infiltración y localización de células efectoras dentro del núcleo tumoral y el hemisferio contralateral.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de células inmunitarias reactivas frente al GBM mediante ensayos de reactivación y proliferación ex vivo tras la inyección.
- Valor predictivo: Proporciona evidencia temprana de actividad biológica y unión al objetivo en un modelo de xenoinjerto ortotópico relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de biodistribución mediante tinción con anticuerpo anti-CD3 humano para medir el engraftamiento de células inmunitarias en tejido cerebral.
- Valor operativo: Establece protocolos estandarizados de preparación e inyección celular (volumen de 15–20 µL, velocidad de flujo de 2–3 µL/min) para una administración dosis reproducible.
- Preparación del ensayo: Permite el monitoreo de viabilidad y reactividad mediante citometría de flujo (tinción con PI y CD107A) para evaluar la función de las células efectoras antes y después de la administración.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la supervivencia y vigilancia de células efectoras humanas en el parénquima cerebral de ratón durante varios días, lo que apoya estudios sobre dosis y programación.
- Valor operativo: Facilita la evaluación de la eliminación mediada por células inmunitarias de células tumorales diseminadas en el tejido cerebral circundante.
- Continuidad traslacional: Proporciona una prueba de concepto para la administración localizada que minimiza la dilución sistémica y los efectos fuera del blanco.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, al permitir la evaluación directa de la actividad antitumoral de las células inmunitarias en un modelo de tumor cerebral clínicamente relevante.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos efector citotóxicos mediante administración estereotáctica y seguimiento espacial en modelos ortotópicos de GBM.
- Selección: Permite la evaluación estandarizada y cuantitativa de la administración de células inmunitarias y su interacción con el tumor, utilizando lecturas histológicas y citométricas de flujo.
- Análisis: Proporciona resultados medibles que incluyen viabilidad celular, reactividad (CD107A+), enraizamiento (% de células cerebrales) y capacidad proliferativa tras la recuperación.
- Investigación Traducional: Relaciona la localización intratumoral de células inmunitarias con resultados funcionales en un modelo preclínico de glioma.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de inyección estereotáctica para evaluar diversas terapias con células inmunitarias en oncología del SNC.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la funcionalidad de las células inmunitarias, validación de objetivos y reducción de la incertidumbre mecanicista en la inmunoterapia del SNC.
- Valor operativo: Administración estereotáctica estandarizada con volumen y velocidad de flujo controlados garantiza la reproducibilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción al demostrar actividad antitumoral localizada y persistencia de células inmunitarias in vivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos inmunoterapéuticos basada en datos de enxerto y actividad en el cerebro.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo estéril de células, cirugía estereotáxica y cuidados posoperatorios en ratones inmunodeficientes.
- Depende de instrumentación precisa, incluyendo marco estereotáxico, bomba de jeringa y microtaladro, para un posicionamiento intracraneal exacto.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación celular para mantener la viabilidad y prevenir la formación de agregados durante la inyección.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos celulares, volúmenes y coordenadas diana en diversos modelos preclínicos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad técnica de la administración intracraneal y la necesidad de una técnica aséptica rigurosa para evitar complicaciones.
