Name: Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende la transferencia adoptiva estereotáctica de linfocitos humanos citotóxicos en modelos murinos con xenoinjertos ortotópicos de glioblastoma. Este protocolo demuestra la viabilidad y eficacia antitumoral de las inmunoterapias celulares intracraneales.

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Los autores agradecen al personal del Hospital de la Universidad animal (UTE) de Nantes para la cría de animales y cuidado, celular y tisular de instalaciones centrales de la Universidad de Nantes (MicroPICell) de la proyección de imagen para la proyección de imagen y la citometría (Cytocell) de Nantes por su asistencia técnica experta. Este trabajo fue financiado por el INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le cáncer (AO 2017 InterRegional) y el consorcio europeo ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). El equipo está financiado por la Fundación pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabajo fue realizado en el contexto de la empresa LabEX IGO y los programas de IHU-Cesti, apoyado por la nacional investigación Agencia Investissements Avenir a través de los programas de ANR-11-LABX-0016-01 y ANR-10-IBHU-005, respectivamente. El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Metropole y la región de Pays de la Loire. Los autores agradecen Chirine Rafia para proporcionar ayuda en la corrección del manuscrito.

Los siguientes temas animales que procedimiento se realizó según las directrices (acuerdo #00186.02, Comité de ética regional de Pays de la Loire (Francia)). PBMCs humanos se aislaron de la sangre de donantes sanos informados (Etablissement Français du Sang Nantes, Francia). Todas las medidas se realizan bajo condiciones estériles.
1. expansión de inespecífica de los linfocitos citotóxicos efectores T
<ol><li>Preparar e irradiar células de alimentador en 35 Gy. Para la estimulación de 2 x 105 - 4 x 105 células efectoras preparar PBMCs6 de 10 x 10 y 1 x 106 BLCLs de tres donantes distintos y saludables.</li>
	<li>Resuspender las células de alimentador y células efectoras en 15 mL de RPMI suplementado con 10% FCS inactivado con calor, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina (0.1 μg/mL) y 300 UI/mL IL-2 recombinante.</li>
	<li>Añadir PHA-L a una concentración final de 1 μg/mL, mezclar cuidadosamente y distribuir 150 μL de la suspensión de células por pocillo en placas de 96 pocillos fondo en U.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C y con 5% CO2 en un ambiente humidificado.</li>
	<li>Comprobar diariamente la placa hasta células grandes agrupaciones se forman en los pozos de la cultura (~ día 7).</li>
	<li>Transferencia de las células en un frasco de cultivo 1 x 106 células/ml en medio de cultivo fresco.</li>
	<li>Determinar el número total de células por contar (2 x semana) y mantener en el 1 x 106 células/mL en medio de cultivo fresco. Nota: Las células inmunes efectoras deben estar listas para la administración terapéutica en un estado de reposo (generalmente 3 semanas después del estímulo de amplificación inicial). La pureza y la reactividad de estas células efectoras deben comprobarse antes en vivo las inyecciones (por ejemplo, con ensayos en vitro ).</li>
</ol>2. preparación de las células efectoras preoperatorio
<ol><li>Después de comprobar el recuento de células efectoras, recoger las células efectoras en un tubo de 50 mL por centrifugación (300 x g durante 5 min). Nota: Para compensar las pérdidas, prepararse un exceso de células (p. ej., 50 x 106).</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender las células en 15 mL de PBS estéril y centrifugar durante 5 min a 300 x g para realizar el lavado.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y luego Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>La transferencia de las células resuspendidas en un microtubo de 1,5 mL para centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante mediante pipeteo lentamente.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 8 μl de PBS estéril por ratón. Nota: Este es un paso crítico.</li>
	<li>Miden el volumen de la suspensión celular con una micropipeta. Si es necesario, añadir PBS estéril (20 x 106 células en 15 μl de PBS por dosis) y mezclar cuidadosamente.</li>
	<li>Comprobar, mediante una micropipeta, que el volumen final por ratón es entre 15 y 20 μL (obligatoriamente < 20 μl).</li>
	<li>Mantener las células en hielo hasta inyección estereotáctica. Nota: los puntos de tiempo más de 3 h no fueron probados.</li>
</ol>3. stereotactic inyección
<ol><li>
Equipo
	<ol>
<li>Montar y calibrar un pequeño marco estereotáctico animal según las instrucciones del fabricante para asegurar la exactitud de las inyecciones intracraneales (p. ej., jeringa tamaño, volumen y tasa de inyección). Nota: Una tasa de infusión lenta se recomienda (es decir, 2-3 μl/min).</li>
		<li>Instale el material debajo de un gabinete de la seguridad microbiana (MSC) para mantener la esterilidad de los instrumentos y protegen a los ratones contra infecciones. Nota: lugar "bloques isotérmicos" en un baño de agua a 37 ° C. Este sistema limita la hipotermia de los ratones durante la cirugía. Cojines, que son necesarios para el cuidado posterior al procedimiento, la calefacción se debe utilizar durante el monitoreo continuo de la temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación preoperatoria de animales
	<ol>
<li>Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (10 mg/mL) y xilacina (0,1 mg/mL) a 10 μl/g de peso corporal del ratón.</li>
		<li>Realizar una prueba del pellizco del dedo del pie para asegurar la completa anestesia y analgesia del animal. Nota: Cualquier movimiento es una indicación de analgesia no profundo, y si eso ocurre, se requieren unos minutos más antes de repetir la operación.</li>
		<li>Una vez que el ratón correctamente está anestesiado, use tijeras para quitar la piel del sitio quirúrgico (entre las dos orejas hasta la nariz).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación preoperatoria de la célula
	<ol>
<li>Con cuidado resuspender las células con una pipeta (varias veces) antes de cada inyección para evitar que cualquier célula aglutinación.</li>
		<li>Sacar cuidadosamente el volumen de suspensión celular requiere (15-20 μl) en la microjeringa de 22-G para evitar la aspiración de burbujas. Nota: Este paso de la célula de carga en la microjeringa es importante para minimizar las variaciones en los volúmenes inyectados. Recarga las células para cada inyección individual entre los procedimientos para evitar que cualquier célula agrupar y para un número par de administración de las células efectoras en la cohorte.</li>
		<li>Luego, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Atención procesal
	<ol>
<li>Desinfectar el sitio quirúrgico con torunda empapada en solución de povidona-yodo 5% por lo menos 3 x.</li>
		<li>Coloque un ungüento oftálmico lubricante en los ojos del ratón para prevenir cualquier sequedad de la córnea.</li>
		<li>Posición del ratón anestesiado en el marco estereotáctico, en un bloque isotérmico caliente cubierto con una envoltura de plástico estéril para mantener la temperatura del ratón durante la cirugía y limitar la mortalidad. Nota: Nariz y los dientes del ratón deben estar apropiadamente colocados encima de la barra de dientes, para asegurar un flujo respiratorio adecuado durante el procedimiento.</li>
		<li>Una vez que el ratón se coloca encima de la barra de dientes, apretar las barras oído firmemente debajo de orejas de ratón para inmovilizar la cabeza. Nota: Tenga cuidado de no dañar los tímpanos o comprometer la respiración.</li>
		<li>Hacer una incisión de piel sagital de línea media de 1-2 cm con las tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo de anterior a posterior para exponer el cráneo.</li>
		<li>Identificar la intersección de las suturas sagitales y coronales (Bregma) para servir como puntos de referencia para la localización estereotáctica antes de la inyección (se muestra en la figura 1).</li>
		<li>Lugar la microjeringa sobre este punto.</li>
		<li>Mueva la microjeringa 2 lateral derecha y anterior de la Bregma 0,5 mm.</li>
		<li>Usando una microperforadora, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca de taladro estéril en las coordenadas predeterminadas. Tenga cuidado de seguir siendo superficial para evitar cualquier lesión traumática del cerebro. Nota: En este protocolo, se inyectaron células inmunes dentro de un tumor establecido (una semana después de la inyección de células de tumor). La piel debe ser reabierta (cicatriz) y la inyección se realiza en las mismas coordenadas que se utiliza para la implantación de células tumorales (el orificio es generalmente persiste hasta 2 semanas después de la inyección). Coordenadas fueron seleccionados para la inyección de células tumorales y efectoras en el parénquima cerebral13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inyección de las células efectoras inmunes
	<ol>
<li>Introducir cuidadosamente la microjeringa en el orificio taladrado y, moviéndose lentamente, hacia adelante la aguja 3 mm abajo de la duramadre y luego hacia atrás 0.5 mm a una profundidad final de 2,5 mm antes de la inyección de las células efectoras.</li>
		<li>La inyección de células efectoras a 2-3 μl/min y vigilar los ratones a lo largo del tiempo de inyección.</li>
		<li>Una vez completada la inyección, retire la aguja de sólo 1 mm y mantenga la microjeringa en lugar por un minuto adicional antes de lentamente retirar completamente la microjeringa, para evitar cualquier fuga en el sitio de infusión. Nota: Después de la eliminación de los animales desde el dispositivo estereotáctico, limpie inmediatamente el equipo de inyección para próximos experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidados postoperatorios y el seguimiento del ratón
	<ol>
<li>Quitar el animal del marco estereotáctico e inmediatamente aplicar solución de povidona-yodo al 5% en el sitio de incisión y cierre la piel con una sutura quirúrgica apropiada.</li>
		<li>Aplique el gel de lidocaína 2% directamente sobre la herida y administrar 0.15 μg/g de la buprenorfina por una inyección subcutánea para analgesia posterior al procedimiento.</li>
		<li>Lugar nuevo el ratón anestesiado a la jaula encima de un cojín de calefacción situado a 37 ° C para mantener la temperatura corporal de un ratón apropiado y evitar cualquier hipotermia. Nota: No es necesario una carcasa separada.</li>
		<li>Controlar el ratón hasta que es recuperado de la anestesia y traslado a una habitación de la vivienda. Nota: Hasta la fecha, este protocolo es bien soportado como pocas complicaciones imprevistas han ocurrido (< 5% de los ratones inyectados).</li>
		<li>Diario controlar los ratones y les eutanasia cuando se observan signos de salud decreciente (p. ej., postura jorobada, movilidad reducida, postración y pérdida de peso significativa [≥ 15%]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una transferencia adoptiva de seleccionado nativa o las células efectoras inmunes ingeniería representa un enfoque prometedor para tratar eficazmente los tumores, como los cánceres de cerebro infiltrativa, teniendo cuidado de limitar reactividades contra las células no transformadas15, 16,17,18. Sin embargo, el sistema nervioso central, que comprende el cerebro, tiene un particular estado inmu...

GBM (que grado astrocitoma IV), es el más frecuente y agresivo cáncer cerebral primario en adultos. A pesar de tratamientos agresivos que combinan cirugía y radio-quimioterapia, GBM permanece asociado con un pronóstico extremadamente pobre (supervivencia media de 14,6 meses y una mortalidad de 2 años > 73%)1. Esto pone en evidencia que algunos avances terapéuticos eficientes han sido validados en la última década2. Entre los candidatos para el diseño de estrategias terapéuticas más eficaces3,de4,5, inmunoterapias6 se exploran actualmente para rastrear y eliminar altamente invasivo y radio/quimioterapia-resistente del tumor células, sospechadas por su contribución clave a la rápida y fatal tumor recidiva7. Varios potenciales dianas inmunológicas fueron identificadas y propuestas para inmunoterapias, participación natural o αβ modificado o linfocitos de T ϒδ como GBM-antígenos específicos de tumor o moléculas inducidas por el estrés8,9, 10. La posibilidad de administrar efectores de células inmunitarias GBM-reactivo seleccionados representa una oportunidad única para entregar cantidades elevadas de linfocitos effector directamente en el sitio de la neoplasia residual. Para apoyar esta estrategia, hemos demostrado recientemente que los modelos basados en ratones inmunodeficientes con xenoinjertos GBM humanos primarios orthotopic fielmente recapitulan el desarrollo de tumores cerebrales en GBM pacientes9,11. Por otra parte, estos modelos fueron utilizados para demostrar la fuerte eficacia antitumoral de eventualmente transferidos linfocitos allogeneic de Vϒ9Vδ2T humanos.
Este protocolo describe los pasos experimentales críticos para el logro de las inmunoterapias estereotáxicas de tumores cerebrales, como el GBM, basado en la transferencia adoptiva de linfocitos T trasplante allogeneic. Se muestra en el artículo: (i) la amplificación de linfocitos efector inmune alogénico terapéutico T, como los linfocitos Vϒ9Vδ2T humanos; (ii) la preparación de estos linfocitos efectores T para inyección; (iii) el procedimiento para la administración estereotáxica en el cerebro, cerca del tumor. Este artículo también proporciona la penetración en el comportamiento de estos efectores celulares después de la inyección estereotáctica.
El enfoque terapéutico presentado aquí se basa en la inyección de 20 x 106 efectoras células por dosis para cada ratón inmunodeficiente de con tumores de cerebro. Un paso inicial en vitro expansión es necesaria para producir grandes cantidades de células inmunitarias. Por lo tanto, no específica de la célula expansiones se realizan con fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiado células allogeneic alimentador: células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos y de células linfoblastoides de B transformada Epstein Barr Virus EBV líneas (BLCLs), derivadas de PBMCs en vitro infección con EBV contiene cultivo sobrenadante de la línea celular de Tití B95-8, en presencia de 1 μg/mL de ciclosporina-A.
Las células inmunes efectoras GBM-reactivo se comparan y seleccionadas en vitro ensayos9. Estas células efectoras se activan y amplificaron utilizando protocolos estándar, según su naturaleza (por ejemplo, humano de los linfocitos T Vγ9Vδ29 o virus humano del herpes αβ T linfocitos12) con una pureza mínima de > 80%, como habitualmente comprobado por análisis cytometric. El procedimiento de expansión celular detallado a continuación se aplica a varios subconjuntos de linfocitos humanos.

<table><tbody><tr><td>PBMC</td><td></td><td></td><td>de 3 donantes sanos diferentes</td></tr><tr><td>BLCL de</td><td></td><td></td><td>3 donantes diferentes</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de ratón para marco estereotáxico&nbsp; &nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>inyector de bomba de microjeringa&nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Ratones NSG</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>WPI</td><td></td> Pinzas 201758 <td></td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de glioblastoma multiforme de orthotopic humanos

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), el cáncer cerebral primario más frecuente y agresiva en los adultos, se asocia generalmente a un pronóstico pobre, y escasas terapias eficaces se han propuesto en la última década. Entre los candidatos prometedores para el diseño de estrategias terapéuticas novedosas, han sido objeto de inmunoterapias celulares para eliminar altamente invasiva y radiorresistente quimioterapia las células del tumor, probablemente involucrados en una recaída rápida y fatal de este cáncer. Así, administraciones de allogeneic efectores GBM-reactivo de células inmunitarias, como humanos Vϒ9Vδ2 los linfocitos T, en las proximidades del tumor representa una oportunidad única para ofrecer eficiente y altamente concentrado de agentes terapéuticos directamente en el sitio de tumores malignos de cerebro. Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto preclínica para la viabilidad y la eficacia antitumoral de estas inmunoterapias celulares que dependen de inyecciones de stereotactic de linfocitos alogénicos humanos en camas de tumor intrabrain.

Este estudio describe la estrategia de transferencia adoptiva de células efectoras inmunes celulares en el cerebro de ratones portadores de tumor, basado en inyecciones estereotácticas realizadas directamente en la cama del tumor.
Para minimizar cualquier riesgo de lesión cerebral asociada a un volumen de inyección grande, la suspensión de células efectoras debe ser concentrada (20 x 106 células en 15-20 μl de PBS). P...

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

El glioblastoma multiforme sigue siendo el tumor cerebral primario más frecuente y agresivo en adultos. A pesar de los tratamientos agresivos basados en cirugía seguida de radio y quimioterapia, el GBM se asocia con un pronóstico extremadamente malo y una mediana de supervivencia inferior a 15 meses. Dado que se han realizado pocos avances terapéuticos en la última década, actualmente se exploran las inmunoterapias celulares para eliminar las células GBM altamente invasivas y resistentes que probablemente estén involucradas en la recaída tumoral rápida.La administración de factores inmunológicos citotóxicos reactivos a GBM seleccionados en las proximidades del tumor podría representar una oportunidad única para administrar inmunoterapia celular concentrada, directamente en el sitio de la neoplasia maligna residual. Nuestro grupo demostró recientemente que los ratones NSG inmunodeficientes portadores de xenoinjerto de GBM humano primario ortotópico recapitulan el GBM a un mayor desarrollo en los pacientes. Estos modelos de GBM se utilizaron para evaluar la eficacia de los efectores inmunitarios citotóxicos en las inyecciones intratumorales.Este protocolo describe nuestro proceso terapéutico basado en primer lugar en el aislamiento y amplificación de células efectoras inmunitarias reactivas a GBM. En segundo lugar, la propagación de estas células efectoras para inyección intercraneal. Y tercero, su inyección estereotáctica en el sitio del tumor dentro del cerebro del ratón.También se investigó el comportamiento del efector inmune después de la inyección ortotópica. Tres semanas después de la estimulación del feto con PHA, las células efectoras, que forman un grupo de células en el fondo del matraz, deberían haber vuelto al estado de reposo y estar listas para ser utilizadas. Después de verificar el recuento de células efectoras, vuelva a suspender y recoja las células en un tubo de 115 mililitros y centrifugarlas.Retire con cuidado y por completo un sobrenadante. Y resuspender las células en PBS estériles y centrifugar para lavarlas. Retire con cuidado y por completo el sobrenadante.Y luego resuspender las células en un mililitro de PBS estéril. Células de transferencia en un microtubo para centrifugación. De nuevo, retire con cuidado y por completo el sobrenadante pipeteando lentamente.El siguiente paso es crítico, resuspender las células en la mitad del volumen final de PBS estéril y homogeneizar suave y cuidadosamente. Verifique el volumen final con micropipeta, el volumen final por ratón tiene que estar entre 15 y 20 microlitros para 20 millones de células. Asegúrese de que no exceda los 20 microlitros por mouse.Mantenga las células en hielo hasta la inyección. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado con un pellizco en los dedos de los pies y luego retire el pelo del sitio quirúrgico, entre las dos orejas y hasta la nariz. Vuelva a suspender las células lentamente para evitar la aglomeración de células y cargue la suspensión de las células en la jeringa con mucho cuidado para evitar la presencia de burbujas.A continuación, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada. Desinfecte el sitio quirúrgico con sal y povidona yodada al 5% y coloque una pomada oftálmica lubricante en los ojos del ratón para evitar que se seque la córnea. A continuación, coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico de un bloque caliente.Coloque correctamente la nariz y los dientes del ratón por encima de la barra de dientes. Apriete las barras de los oídos firmemente en las orejas del ratón para inmovilizar la cabeza. Tenga cuidado de no dañar los tímpanos, comprometer la respiración y asegúrese de que la cabeza esté bien inmovilizada.Haga una incisión en la piel sagital de la línea media con tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo para exponer el cráneo. Identifique la intersección de las estructuras sagital y coronal para que sirvan como puntos de referencia para la localización estereotáctica y coloque la jeringa por encima de este punto. Mueva la jeringa en coordenadas predeterminadas.Dos milímetros lateral derecho, y 0,5 milímetros anterior de la Usando un microtaladro, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca estéril. Tenga cuidado de permanecer superficial para evitar lesiones cerebrales. Inserte la jeringa con cuidado en el orificio perforado.Mueva lentamente la aguja hacia adelante tres milímetros hacia abajo en la duramadre, y luego retroceda 0,5 milímetros hasta una profundidad final de inyección de células de 2,5 milímetros. Ejecute la inyección celular a dos o tres microlitros por minuto y controle a los ratones durante todo el tiempo de inyección. Una vez completada la inyección, retire la aguja solo un milímetro y mantenga la jeringa en su lugar durante un minuto adicional antes de retirar lentamente la jeringa por completo para evitar cualquier fuga del sitio de infusión.Retire con cuidado al animal del marco estereotáctico. Cierre la piel con una sutura quirúrgica adecuada y aplique gel de lidocaína al 2% directamente sobre la herida. Transfiera el ratón anestesiado a su jaula respectiva sobre la almohadilla térmica ajustada a 37 grados Celsius para mantener la temperatura corporal adecuada del ratón hasta la recuperación completa de la anestesia.Como la suspensión es muy concentrada, se comprobó la viabilidad y reactividad de la célula. Las células efectoras se cargaron en jeringa para imitar la inyección in vivo. Las células se recolectaron inmediatamente o 10 minutos después y se analizaron por citometría de flujo para la tinción con yoduro de propidio.Como se puede ver, la preparación y la carga no afectaron a la viabilidad de las células efectoras a las 24 horas. La reactividad frente a las células tumorales de glioblastoma también se comprobó utilizando células no preparadas o efectores preparados y permanecieron tres horas en los ojos. La reactividad se monitoriza mediante la tinción positiva del marcador de activación CD107A.Estos resultados demuestran que la reactividad de las células efectoras no se vio afectada por la preparación. Siete días después de la inyección de las células efectoras, se recolectaron cerebros de ratones, se seccionaron y se tiñeron para determinar la coloración hemática y permitir la identificación de la estructura tumoral. Luego, la tinción anti-CD3 humana permitió la localización de las células efectoras.Curiosamente, se encontraron células efectoras alrededor del tumor y en el núcleo tumoral, pero también en el hemisferio contralateral. Las células T efectoras humanas aisladas del cerebro de ratón 48 horas después de la inyección representan el 2% de las células cerebrales. Todavía eran capaces de proliferar en presencia de PHA, alimentadores y estimulación de IL2, con una pureza del 99% después de la amplificación.Gracias a este protocolo, las células efectoras humanas en reposo pueden sobrevivir y patrullar con un parénquima cerebral de ratón durante varios días después de la inyección estereotáxica. En conclusión, la transferencia adoptiva de células efectoras humanas mediante inyecciones estereotácticas representa enfoques prometedores para tratar eficazmente los tumores cerebrales malignos infiltrantes con efectos deletéreos limitados en las células sanas. Esta vía de administración aprovecha que las células humanas se entregan cerca del sitio del tumor, limitando su dilución dentro de los tejidos y el organismo.Aquí describimos el procedimiento después de la administración de una gran cantidad de células inmunitarias dentro del tumor cerebral sin efectos nocivos sobre las células efectoras y, lo que es más importante, sin ningún efecto deletéreo visible en los ratones. Además, las células inmunitarias inyectadas localmente en el cerebro del ratón no solo son capaces de sobrevivir y mantener su capacidad de ser activadas y amplificadas ex vivo, sino también de eliminar las células tumorales diseminadas en el tejido cerebral circundante. En conjunto, estas características son esenciales para permitir la eliminación de las células tumorales infiltrativas fuertes que caracterizan a los tumores GBM.Este protocolo abre una nueva oportunidad para el establecimiento de un procedimiento de transferencia adoptiva en ratones con modelos de tumor cerebral. Paso esencial antes de plantearse la EC clínica.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior...

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

Este video muestra una técnica de inyección estereotáxica para administrar linfocitos T efectores humanos en un modelo murino portador de un tumor cerebral humano. Al colocar un ratón anestesiado portador de tumor en un marco estereotáctico y crear un orificio en el lugar de la inyección en el cráneo, se inyectan linfocitos T efectores en el sitio del tumor.

Administración de linfocitos T efectores en ratones portadores de tumores cerebrales humanos

Las gliomas malas constituyen un grupo heterogéneo de neoplasmas glial altamente infiltrativos con las características clínicas y moleculares distintas. Los xenografts orthotopic primarios recapitulan las características histopatológicas y moleculares de los subtipos malos de la glioma en modelos animales preclínicos.

Xenoinjertos de glioma ortotópico primario Recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa I

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

El cerebro es un sitio único con cualidades que no están bien representados por los análisis in vitro o ectópicos. Modelos ortotópico de ratón con la ubicación y características de crecimiento reproducibles se pueden crear de forma fiable con inyecciones intracraneales utilizando un instrumento de fijación estereotáxica y una bomba de inyección de baja presión.

Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

Los efectos linfodepletorios e inmunomoduladores de la quimioterapia y la radiación estándar pueden aprovecharse para mejorar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia con células T. Describimos un método para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas de EGFRvIII y administrarlas en el contexto del tratamiento estándar del glioblastoma.

Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

Búsqueda de tumor terapéuticas las células madre mesenquimales (MSCs) muestran promesa como tratamiento para el glioblastoma invasor. El trasplante óptimo consiste en entrega de MSCs en la cavidad de resección de tumor en andamios. Aquí, preclínicas técnicas para estudio de tratamiento de MSC de glioblastoma se proporcionan como: resección tumoral guiada por la imagen; implantación de semillas MSC andamios; y seguimiento de la terapia postoperatoria.

Resección guiada por la imagen de Glioblastoma e implantación intracraneal de andamios sembrado células madre terapéuticas

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

El desarrollo de modelos ortotópicos de tumores cerebrales pediátricos requiere una precisión meticulosa, utilizando un dispositivo estereotáxico para implantar células cancerosas con precisión. La metodología presentada aquí describe los pasos involucrados en la preparación de las células tumorales cerebrales, la realización de inyecciones intracraneales y la implementación de un sistema de monitoreo postoperatorio para evaluar el injerto de tumor cerebral.

Establecimiento de modelos ortotópicos de xenoinjertos derivados de pacientes para tumores cerebrales utilizando un dispositivo estereotáxico

El glioblastoma es una forma devastadora de cáncer cerebral primario, y la terapia térmica intersticial con láser está emergiendo como una alternativa prometedora a la resección quirúrgica convencional para el glioblastoma inoperable. Este protocolo describe un modelo preclínico optimizado de ratón que se puede utilizar para estudiar los efectos del tratamiento o los tratamientos adyuvantes y combinatorios.

Un modelo murino inmunocompetente para la terapia térmica intersticial con láser del glioblastoma

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los investigadores una técnica altamente reproducible para las implantaciones intracraneales.

Implantación intracraneal estereotáctica de líneas celulares de xenoinjertos derivadas de pacientes con glioblastoma en ratones

Aprende la transferencia adoptiva estereotáctica de linfocitos humanos citotóxicos en modelos murinos con xenoinjertos ortotópicos de glioblastoma. Este protocolo demuestra la viabilidad y eficacia antitumoral de las inmunoterapias celulares intracraneales.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos (Video) | JoVE Journal

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

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