Name: Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende la transferencia de embriones laparoscópica mínimamente invasiva y vitrificación óptima en conejos. Este método permite almacenar y transportar embriones para estudios reproductivos aplicables a humanos.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Ministerio de economía y competitividad de España (AGL2017-85162-C2-1-R) y del programa de investigación de la Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versión de texto en inglés revisada por el servicio de lenguaje inglés N. Macowan

Todos los procedimientos experimentales utilizados en este estudio se realizaron de conformidad con la Directiva 2010/63/CEE de la UE para experimentos con animales y fueron revisados y aprobados por el Comité ético para la experimentación con animales de la Universitat Politècnica de València, España (código de investigación: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC y JSV posee un certificado de autorización expedido por la administración gubernamental Valenciana para experimentar con animales. XGD está autorizada a supervisar in situ el bienestar y el cuidado de los animales durante el experimento.
1. transferencia de embriones
<ol><li>Preparación de hembras beneficiarias
	<ol>
<li>Utilice únicamente hembras sexualmente maduras (&gt; 4,5 meses de edad).</li>
		<li>Una semana antes del ET, adaptar las hembras a un régimen de 16 h de luz/8 h oscuro para iniciar el crecimiento folicular y la receptividad femenina mejorada.</li>
		<li>Seleccione las hembras destinatarias, observando la turgencia y el color de la vulva. Si la vulva es turgentes y rojiza, la hembra es receptiva.</li>
		<li>Inducir pseudoembarazo (ovulación) por una sola inyección intramuscular de 1 μg de acetato de buserelina (análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotropina) independientemente del peso corporal. Nota: normalmente, 0,8 μg es una dosis adecuada para la inducción de la ovulación en conejos de tamaño mediano (4-5 kg), por lo que 1 μg generalmente garantiza la ovulación.</li>
		<li>Inducir la ovulación con tantos días de antelación como la edad de los embriones a ser transferidos (por ejemplo, 70-72 h antes de la mórula fresca et).</li>
	</ol></li>
	<li>La anestesia y la analgesia
	<ol>
<li>Pesar el conejo y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos.<ol>
<li>En una jeringa de 1 mL con una aguja de 30G: carga de xilazina (5mg/kg) y clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg). En otra jeringa de 1 mL con una aguja pericranial 23G, cargue clorhidrato de ketamina (35 mg/kg).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sostenga el conejo e inyecte la mezcla de xilazina-buprenorfina por vía intramuscular.</li>
		<li>Inserte la aguja pericranial con ketamina en la vena del oído marginal, introduciendo lentamente todo el contenido de la jeringa por vía intravenosa.</li>
		<li>Fije la aguja y déjala insertada a lo largo de los pasos restantes para administrar más anestesia si es necesario.</li>
		<li>Dejar el conejo en la jaula (limpia y sin ningún otro animal) en un escenario cálido.</li>
		<li>Una vez inconsciente, aplicar ungüento ocular para evitar la sequedad del ojo y comprobar la ausencia del Freflex palpebral. Nota: este protocolo proporciona un plano quirúrgico de anestesia durante un mínimo de 30 min. Si se requiere un tiempo más largo, inyectar dosis adicionales con la mitad de la cantidad de hidrocloruro de ketamina descrita en 1.2.1 después de 30 min.</li>
		<li>Controle la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo del pedal y el movimiento respiratorio. Los cambios en el patrón respiratorio a una tasa irregular y más rápida indican la pérdida del plano adecuado de la anestesia.</li>
		<li>Monitorear el color de las membranas mucosas (ojos, labios, etc.), la frecuencia respiratoria (30-60 respiraciones por minuto), la frecuencia cardíaca (120-325 latidos por minuto) y la temperatura rectal (38-39.6 ° c).</li>
		<li>Ocho horas antes de la transferencia, retener los alimentos de los animales para evitar el mayor tamaño del intestino y la actividad hasta que el proceso de ET está terminado. Deje libre el acceso al agua.</li>
	</ol></li>
	<li>La preparación del embrión
	<ol>
<li>Calentar el medio de manipulación del embrión a 25 ° c: medio base (BM), que consiste en la solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) complementada con un 0,2% (p/v) de albúmina sérica bovina.</li>
		<li>Al trabajar bajo un microscopio Estereomicroscopio, enjuague los embriones frescos o descongelados (paso 2) con BM.</li>
		<li>Con guantes estériles, fije un catéter epidural 17G apropiadamente configurado a una jeringa de 1 mL.</li>
		<li>Aspiran 1 cm de BM en el catéter, seguido de una pequeña burbuja de aire.</li>
		<li>Aspirar 5-7embriones en un volumen de 10 μL de BM, seguido de otra pequeña burbuja de aire.</li>
		<li>Terminar de cargar el catéter aspirando 1 cm de BM.</li>
	</ol></li>
	<li>La transferencia de embriones
	<ol>
<li>Considere el uso de guantes estériles, vestido y máscara para asegurar un ambiente aséptico.</li>
		<li>Esterilice los instrumentos quirúrgicos, limpie las superficies donde se realizará la cirugía y límpielos con etanol al 70%.</li>
		<li>Realice la anestesia como se detalla anteriormente (paso 1,2), comprobando la pérdida de reflejos.</li>
		<li>Afeita el pelaje del abdomen ventral con una maquinilla de afeitar eléctrica.</li>
		<li>Preparar el abdomen ventral asépticamente.<ol>
<li>Limpie el área quirúrgica y retire el vello restante. Lavar el área quirúrgica con un jabón de gluconato de clorhexidina. Sanitizar la zona con solución de clorhexidina y etanol 96 º (3 veces).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque el animal en una mesa quirúrgica tibia, en la posición de Trendelenburg (diríjase hacia abajo a 45 °) para asegurarse de que el estómago y los intestinos están localizados craneal. Considere la evacuación de la vejiga si es turgid. Si alguna vísceras se dañan en el proceso, el animal puede morir. Por lo tanto, es importante que se encuentran correctamente (figura 1).</li>
		<li>Cubra el área con una toalla estéril, con un orificio (fenestration) que exponga el área afeitada, para separar el sitio quirúrgico de cualquier posible contaminación.</li>
		<li>Insertar un trocar endoscópico 5 cm en la cavidad abdominal, 2 cm caudal al proceso xifoides, e insufflar a través de ella la cavidad peritoneal con un Insufflator mecánico regulador de presión. Nota: la presión intraabdominal debe ser de 8-12 mmHg con CO2 (figura 1A).</li>
		<li>Inserte la cámara del endoscopio a través del trocar endoscópico (figura 1B). Nota: identificar el tracto reproductivo, determinar el estado y la posición del infundíbulo y ampolla antes de et para facilitar los siguientes pasos.</li>
		<li>Inserte la aguja epidural 17-G en la región inguinal entre 2-3 cm del infundíbulo (figura 1B).</li>
		<li>Identifique la entrada del infundíbulo (figura 2A, 2B).</li>
		<li>Inserte el catéter cargado (paso 1,3) a través de la aguja epidural en el abdomen (figura 1C).</li>
		<li>Localice el oviducto e inserte 1-2 cm del catéter epidural a través del infundíbulo en la ampolla (figura 2A-2C). No avance muy lejos en el oviducto para evitar daños y hemorragias.</li>
		<li>Suelte los embriones en el oviducto presionando suavemente el émbolo de la jeringa acoplada al catéter (Figura 2D-2F). Ambas burbujas de aire deben salir del catéter.</li>
		<li>Retire el catéter justo después de que los embriones hayan sido liberados.</li>
		<li>Enjuague el catéter, aspirando y liberando el medio de manipulación para comprobar la ausencia de los embriones y confirmar su transferencia exitosa.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.11 a 1.4.16 en el otro lado del útero, si lo desea.</li>
		<li>Retire la aguja epidural y la cámara endoscopio.</li>
		<li>Libere el CO2 a través del trocar endoscópico. Si el exceso de gas permanece en el abdomen del animal, tendrá dolor y molestias.</li>
		<li>Retire el trocar endoscópico de la cavidad abdominal. Retire la toalla quirúrgica.</li>
		<li>Suspenda la anestesia.</li>
		<li>Limpie la incisión hecha por el trocar con solución de clorhexidina. Cerrar la incisión hecha por el trocar con un aluminio micronizado y un apósito de plástico.</li>
	</ol></li>
	<li>La atención postoperatoria
	<ol>
<li>Tratar a los animales con antibióticos: 10 mg/kg de enrofloxacina, por vía subcutánea, cada 24-h durante 5 días.</li>
		<li>Administrar analgésicos: clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg), por vía intramuscular, cada 12 horas durante 3 días; Meloxicam (0,2 mg/kg), por vía subcutánea, cada 24-h durante 3 días.</li>
		<li>Vigilar a los animales durante al menos 30 minutos después de la cirugía (dependiendo del animal y la dosis de anestesia utilizada) asegurándose de que recuperen sus condiciones fisiológicas.</li>
		<li>Identifique el recipiente (por ejemplo, el tatuaje del oído) y los animales de la casa individualmente en una jaula limpia con la condición ambiental apropiada.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> Figura 1: transferencia de embriones laparoscópica asistida por laparoscopia (vista externa). A) inserción del trocar endoscópico (un puerto). B) inserción de la cámara endoscópica y de la aguja epidural (flecha negra). C) inserción del catéter de transferencia de embriones (flecha blanca) a través de la aguja epidural. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> Figura 2: transferencia de embriones laparoscópica asistida por laparoscopia (vista interna). A: Inserción del catéter a través de la aguja epidural en la zona abdominal. El asterisco indica el infundibulum. B, C, D: El catéter cargado con los embriones se inserta en la región de ampolla a través del infundibulum. E, F: Liberación de los embriones, confirmado por la visualización de un oviducto inflamado. Esta figura ha sido adaptada de marco-Jiménez et al. 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. vitrificación y calentamiento de embriones
<ol><li>Realice todas las manipulaciones a temperatura ambiente (alrededor de 22 ° c) para reducir la toxicidad de la solución de vitrificación a temperaturas más cálidas. Nota: los embriones pueden ser movidos usando pipetas automáticas de 0,1-2 μL en este protocolo, pero otros dispositivos similares para mover los embriones que arrastran el volumen mínimo pueden ser adecuados.</li>
	<li>Vitrificar los embriones en un procedimiento de adición de dos pasos:<ol>
<li>Colocar los embriones durante 2 minutos en solución equilibrante consistente en un 10% (v/v) de etilenglicol y un 10% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en BM.</li>
		<li>Mover los embriones (del paso 2.2.1) durante 1 minuto a la solución de vitrificación que consiste en un 20% (v/v) de etilenglicol y un 20% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en BM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cargue los embriones en un ministraw de plástico de 125 μL (que contiene un extremo cerrado con un tapón de algodón y un extremo abierto). El proceso se esquematiza en la figura 3.<ol>
<li>Acoplar el extremo cerrado de 0,125 μL ministraw con el microdispensador adecuado (p. ej. Captroll III®).</li>
		<li>Aspiran BM hasta 1/3 de la longitud de la paja, siguiendo por una pequeña burbuja de aire.</li>
		<li>Aspirar los embriones en un volumen de 40 μL de solución de vitrificación, seguida de otra pequeña burbuja de aire.</li>
		<li>Aspirar BM hasta que la primera fracción líquida (paso 2.3.2) llegue al algodón.</li>
		<li>Cierre el extremo abierto con un tapón de paja.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice el paso 2.2.2 mientras se realiza el paso 2,3 para asegurarse de que no transcurera más de un minuto, lo que sería tóxico para los embriones.</li>
	<li>Sumergir el ministraw directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación.</li>
	<li>Almacene el ministraw en una Dewar por nitrógeno durante el tiempo deseado.</li>
	<li>Descongelar los embriones en un solo paso.<ol>
<li>Colocar el ministraw horizontalmente 10 cm de vapor de nitrógeno líquido para 20-30 s.</li>
		<li>Cuando el proceso de cristalización comienza dentro del ministraw, sumergir el ministraw en un baño de agua a 25 ° c para 10-15 s.</li>
		<li>Quite el tapón del ministraw y corte el tapón de algodón.</li>
		<li>Con un microdispensador acoplado, expulse todo el contenido del ministraw en una placa que contenga una solución de sacarosa de 0,33 M a 25 ° c en BM durante 5 minutos. Nota: este paso debe realizarse rápidamente con el fin de reducir la exposición de embriones a la solución de vitrificación.</li>
		<li>Mover los embriones a una nueva placa que contenga la solución BM durante otros 5 min.</li>
		<li>Considerar únicamente embriones no dañados (con capa de mucina intacta y zona pellucida) para continuar con el ET. Nota: tenga en cuenta que en los embriones descongelados, las transferencias asíncronas (p. ej., 60-62 h en las transferencias de mórula) pueden mejorar los resultados permitiendo una resincronización entre el embrión y el endometrio materno.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> Figura 3: esquematización de la paja correctamente cargada. A ) BM se refiere a los medios de manipulación de embriones empleados durante la vitrificación. Los embriones deben cargarse en la solución de vitrificación. B) aspecto macroscópico de la paja cargada con un detalle magnificado de la posición del embrión. Este dispositivo de gran volumen nos permite vitrificar un gran número de embriones, a diferencia de los dispositivos de volumen mínimos. Además, el manejo de este dispositivo es más fácil en comparación con los dispositivos de volumen mínimo, mientras que los resultados son similares en conejos41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde el primer caso documentado de nacimiento vivo de embriones transferidos9, esta técnica y las especies de conejo se han vuelto cruciales en los estudios reproductivos. Además, los estudios de investigación embrionaria que implican manipulación, producción, criopreservación, etc. requieren como último paso la evaluación de la capacidad de los embriones para generar crías sanas a término completo. Por lo tanto, la técnica de transferencia de embriones es indispensable...

Con los objetivos de eludir la infertilidad humana o mejorar la difusión de ganado de alto valor genético y preservar los recursos genéticos animales, un conjunto de técnicas colectivamente denominadas tecnologías de reproducción asistida, tales como la superovulación, en la fertilización vitro, la cultura embrionaria o la criopreservación, se desarrollaron1,2. Actualmente, se administran tratamientos hormonales para estimular los ovarios y producir un gran número de folículos ováricos antrales1. Los ovocitos recolectados de estos folículos se pueden madurar, fertilizar y desarrollar in vitro hasta que sean criopreservados o transferidos a madres sustitutas3. Sin embargo, durante estos tratamientos, los gametos y los cigotos están expuestos a una serie de procesos no fisiológicos que podrían requerir la adaptación del embrión para sobrevivir en estas condiciones4,5. Esta adaptación es posible debido a la plasticidad embrionaria temprana, que permite cambios en los embriones en la expresión génica y la programación del desarrollo6. Sin embargo, estas modificaciones pueden influir en las etapas subsiguientes del desarrollo del embrión hasta la edad adulta, y ahora se acepta ampliamente que los métodos, el tiempo, el procedimiento de criopreservación o las condiciones de cultivo muestran diferentes resultados en el destino del embrión7 , 8. por lo tanto, para dilucidar los efectos específicos inducidos de las artes, el uso de modelos animales bien caracterizados es inevitable.
El primer parto en vivo documentado resultante de la transferencia de embriones de mamíferos tuvo lugar en 18909. Hoy, la transferencia de embriones (ET) a una hembra sustituta es un paso crucial en el estudio de los efectos inducidos por el arte durante la preimplantación en las siguientes etapas de desarrollo del embrión10. Las técnicas ET dependen del tamaño y la estructura anatómica de cada animal. En el caso de modelos animales de gran tamaño, ha sido posible realizar ET por técnicas no quirúrgicas ET transcervicales, pero en las especies de tamaño más pequeño el cateterismo del cuello uterino es más complejo y las técnicas quirúrgicas se utilizan con frecuencia11. Sin embargo, la ET quirúrgica puede causar hemorragia que podría perjudicar la implantación y el desarrollo del embrión, ya que la sangre puede invadir el lumen uterino, causando la muerte del embrión10. Las técnicas transcervicales no quirúrgicas et se siguen aplicando en humanos, babuinos, bovinos, cerdos y ratones12,13,14,15,16,17, pero quirúrgicos Los ETS se siguen utilizando en especies como cabras, ovejas u otros animales que presentan dificultades adicionales10,18,19,20,21, como conejos (dos cervices independientes) o ratones (tamaño pequeño). Sin embargo, los métodos de transferencia quirúrgica tienden a haber sido reemplazados gradualmente por métodos menos invasivos. La endoscopia se utilizó para transferir embriones, por ejemplo, en conejos, cerdos y pequeños rumiantes18,19,20. Estos métodos de endoscopia mínimamente invasivas se pueden utilizar para transferir embriones a la ampolla a través del infundibulum, que es esencial en los conejos y ha demostrado efectos beneficiosos en algunas especies20. Esto se basa en la importancia del diálogo correcto entre el embrión y la madre durante las etapas tempranas del embrión en el oviducto. Como se mencionó anteriormente, la remodelación del embrión que tiene lugar en conejos durante la migración de embriones a través del oviducto es esencial para lograr embriones capaces de implantar22,23.
Los modelos animales de mayor tamaño, como el bovino, son interesantes porque las características bioquímicas y preimplantarias son similares a las de las especies humanas24. Sin embargo, los animales grandes son demasiado caros de usar en los ensayos preliminares, y los roedores se consideran un modelo ideal (76% los organismos modelo son roedores) para la investigación de laboratorio25. Sin embargo, el modelo de conejo ofrece algunas ventajas sobre los roedores en los estudios reproductivos, ya que algunos procesos biológicos reproductivos expuestos por los seres humanos son más similares en conejos que en los ratones. Los humanos y los conejos presentan una activación cronológica del genoma embrionario similar, la gastrulación y la estructura emocorial de la placenta. Además, el uso de conejos es posible conocer el momento exacto de la fertilización y las etapas del embarazo debido a su ovulación inducida25. Los ciclos de vida del conejo son cortos, completando la gestación en 31 días y alcanzando la pubertad en aproximadamente 4-5 meses; el animal es fácil de manejar debido a su comportamiento dócil y no agresivo, y su mantenimiento es muy económico comparado con el gasto de animales más grandes. Por otra parte, es crucial mencionar que los conejos tienen un útero dúplex con dos cervixes independientes11,25. Esto coloca al conejo en una posición preferencial, ya que los embriones de los diferentes grupos experimentales pueden transferirse al mismo animal, pero en un cuerno uterino diferente. Esto nos permite comparar ambos efectos experimentales, reduciendo el factor materno de los resultados.
En la actualidad, los métodos de ET no quirúrgicos no se utilizan en conejos. Algunos estudios realizados a finales de los años 90 utilizando una técnica transcervical et resultaron en tasas de entrega bajas que oscilan entre el 5,5% y el 20,0%11,26 versus el 50-65% por métodos quirúrgicos, entre ellos el procedimiento de laparoscopia descrito por Besenfelder y Brem18. Las bajas tasas de éxito de estos métodos no quirúrgicos de ET en conejos coinciden con la falta de la remodelación necesaria del embrión en el oviducto, que se evita en la ET transcervical. Aquí, describimos un procedimiento de ET laparoscópica mínimamente invasivo eficaz utilizando conejos como un organismo modelo. Esta técnica proporciona un modelo para una mayor investigación reproductiva en animales grandes y humanos.
Debido a que los conejos tienen una ventana de tiempo particularmente estrecha para la implantación de embriones, la ET en esta especie requiere un alto grado de sincro entre la etapa de desarrollo del embrión en ET y el estado fisiológico del receptor27. En algunos casos, después de un tratamiento reproductivo que ralentiza el desarrollo del embrión (como la cultura in vitro ) o altera la receptividad endometrial (como los tratamientos de superovulación), no hay ninguna sincronía entre el embrión y el útero materno. Estas situaciones pueden afectar negativamente al resultado. Para responder en estos contextos, describimos un protocolo de vitrificación de mórula de conejo eficaz que nos permite pausar, organizar y reanudar los experimentos. Este proceso es logísticamente deseable para los estudios reproductivos y nos da la capacidad para el almacenamiento a largo plazo de embriones, permitiendo su transporte. El procedimiento laparoscópico y las estrategias de criopreservación permiten una mejor planificación de los estudios con menos animales. Por lo tanto, nuestra metodología ofrece ventajas higiénicas y económicas y se ajusta al concepto de la 3Rs (sustitución, reducción y refinamiento) de la investigación animal con el objetivo declarado de mejorar el tratamiento humano de los animales experimentales. Así, con estos métodos, los conejos constituyen un organismo modelo ideal para los ensayos reproductivos in vivo .

<table><tbody><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>A ser ordenado por un veterinario autorizado.</td></tr><tr><td>Acetato de busrelina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>Jabón de digluconato de clorhexidina</td><td>Alvet Escart;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>Solución de digluconato de clorhexidina</td><td>Alvet Escart;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Fisher scientific</td><td>15385194</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich W387509</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>Sin cloruro de calcio.</td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar eléctrica</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>Cámara endoscópica</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>Trocar endoscópico con válvula valva de silicona</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>Modelo de trocar ligero.</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993046</td><td>A ser ordenado por un veterinario autorizado.</td></tr><tr><td>Aguja epicraneal 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>También se pueden utilizar agujas más pequeñas.</td></tr><tr><td>Catéter epidural</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Aguja epidural</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol Sigma</td><td>Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>Pomada ocular</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>A ser ordenado por un veterinario autorizado.</td></tr><tr><td>Equipo de laparoscopia</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>26003 AA</td><td>Hopkins&reg; Laparoscopio, laparoscopio de visión recta de 0 mm, 30 cm de longitud, canal de trabajo de 5 mm.</td></tr><tr><td>Fuente de luz</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>Air Liquide</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>Insuflantador mecánico de CO2</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>Endoflator&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>A ser ordenado por un veterinario autorizado.</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 35 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Apósito de plástico (Nobecutan)</td><td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>Pajita de plástico 0,25 mL</td><td>IMV - technologies</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Solución de yoduro de povidona</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Cualquier tijera recta pequeña de acero de grado quirúrgico regular funcionará.</td></tr><tr><td>Tubo de silicona para insuflador</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Existen opciones más baratas como Leica MZ8 o Nikon SMZ-10 o SMZ-2B, por nombrar algunas.</td></tr><tr><td>guantes estériles</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>Bata estéril</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>Mascarilla estéril</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de pajita</td><td>IMV - tecnologías</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S7903</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 1 mL</td> Jeringa de <td>11750425</td><td></td><td>Fisher scientific</td></tr><tr><td>, 5 mL</td><td>Fisher scientific</td><td></td> 11773313 <td></td></tr><tr><td>Catéter urinario</td><td>IMV - tecnologías</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>A ser ordenado por un veterinario autorizado.</td></tr><tr><td>Conejos</td><td>Universitat Polit&egrave; cnica de Val&egrave; Se</td><td></td><td>pueden utilizar otras líneas maternas, como la Línea V o la Línea HP.</td></tr></tbody></table>

transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo rabbit

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Las técnicas de reproducción asistida (ARTs), como la cultura embrionaria in vitro o la criopreservación de embriones, afectan a los patrones de desarrollo natural con consecuencias perinatales y postnatales. Para garantizar la inocuidad de las aplicaciones de ART, es necesario realizar estudios en modelos animales. Además, como último paso, los estudios de desarrollo de embriones requieren la evaluación de su capacidad para desarrollar crías sanas a término. Aquí, la transferencia de embriones al útero es indispensable para realizar cualquier experimento relacionado con las artes.
El conejo se ha utilizado como un organismo modelo para estudiar la reproducción de mamíferos durante más de un siglo. Además de su proximidad filogenética a la especie humana y su pequeño tamaño y bajo costo de mantenimiento, tiene características reproductivas importantes como la ovulación inducida, una cronología de desarrollo embrionario temprano similar a los seres humanos y una breve gestación que nos permiten estudiar fácilmente las consecuencias de la aplicación de ART. Además, las Artes (como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, el cultivo de embriones o la criopreservación) se aplican con la eficiencia adecuada en esta especie.
Utilizando la técnica de transferencia de embriones laparoscópica y el protocolo de criopreservación presentados en este artículo, describimos 1) Cómo transferir embriones a través de una técnica fácil, mínimamente invasiva y 2) un protocolo eficaz para el almacenamiento a largo plazo de conejo embriones para proporcionar capacidades logísticas flexibles en el tiempo y la capacidad de transportar la muestra. Los resultados obtenidos después de la transferencia de embriones de conejo en diferentes etapas de desarrollo indican que la Mórula es la etapa ideal para la recuperación y transferencia de embriones de conejo. Por lo tanto, se requiere una transferencia de embriones oviductal, justificando el procedimiento quirúrgico. Además, las morulae de conejo se vitrifican con éxito y se transfieren por vía laparoscópica, demostrando la efectividad de las técnicas descritas.

La transferencia laparoscópica mínimamente invasiva de embriones frescos o vitrificados coloca al conejo entre los mejores animales modelo para estudios reproductivos. El cuadro 1 muestra los resultados de la et fresca en diferentes etapas de desarrollo (figura 4) de embriones transferidos. La tasa de supervivencia al nacer (porcentaje de embriones que resultan en un cachorro) demostró la eficacia de la técnica laparoscópica descrita en este ...

Las técnicas de reproducción asistida (ARTs) están en continua evaluación para mejorar los resultados y reducir los riesgos asociados. Este manuscrito describe un procedimiento de transferencia de embriones mínimamente invasivo con un eficiente protocolo de criopreservación que permite el uso de conejos como un modelo animal ideal de reproducción humana.

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

El objetivo principal de este experimento es describir un procedimiento de transferencia de embriones laparoscópico en conejo como modelo. La principal ventaja de esta técnica es que este trabaja para transferir embriones utilizando una técnica fácil y mínimamente invasiva. Además, el eficaz protocolo de criopreservación de embriones aquí descrito también funciona para el almacenamiento a largo plazo de los embriones de conejo, proporcionando capacidades logísticas flexibles en el tiempo y la capacidad de transportar la muestra.Como sabemos, las tecnologías de reproducción asistida están en evaluación continua para mejorar los resultados y reducir los riesgos asociados. Por lo tanto, utilizando ambas técnicas, el conejo se puede utilizar como un modelo animal ideal de reproducción humana para responder a preguntas clave en este campo, tales como los efectos de la manipulación in vitro del embrión en la descendencia. La demostración visual de estos asuntos es crítica ya que los pasos de transferencia de embriones son difíciles de aprender, porque debe hacerse con gran precisión para asegurar el éxito de la técnica.Para la vitrificación embrionaria, sumerja los embriones en solución de equilibrio durante dos minutos, seguido de una incubación de un minuto en solución de vitrificación. Al final de la incubación, cargue los embriones en una mini-paja de plástico de 125 microlitros, y combine el extremo cerrado de la mini-paja con un microdispensor de un mililitro apropiado. Aspirar el medio base hasta un tercio de la longitud de la paja, seguido de una pequeña burbuja de aire.A continuación, utilice un estereomicroscopio para aspirar los embriones en 40 microlitros de solución de vitrificación, seguido de otra pequeña burbuja de aire y suficiente medio base para mover la primera fracción líquida hasta el algodón de la mini-paja. A continuación, cierre el extremo abierto de la mini-paja con un tapón de paja, sumerja la mini-paja directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación, y almacene la mini-paja en una dewar de nitrógeno líquido. Para descongelar los embriones para una transferencia, coloque la mini-paja horizontalmente a 10 centímetros del vapor de nitrógeno líquido durante 20 a 30 segundos.Cuando el proceso de cristalización comience dentro de la mini-paja, sumerja la mini-paja en el baño de agua de 25 grados celsius durante 10 a 15 segundos. Retire inmediatamente los tapones de mini-paja y algodón y utilice un microdispensor acoplado para expulsar el contenido de mini-paja en una placa que contenga un medio base de 25 grados centígrados complementado con una solución de sacarosa molar de 0,33, en la que los embriones deben permanecer durante cinco minutos. A continuación, transfiera los embriones a un plato de medio base fresco para otra incubación de cinco minutos.Tantos días antes como la edad de los embriones a transferir, observar la turgencia y el color de las vulvas de los conejos hembra de 4,5 meses de edad sexualmente maduros disponibles, e inducir la ovulación en los animales receptivos con una sola inyección intramuscular de un microgramo de buserelina acetato independientemente del peso corporal. El día de la transferencia, enjuague los embriones frescos o descongelados en un medio base de 37 grados centígrados bajo un estereomicroscopio, y conecte un catéter epidural de calibre 17 configurado adecuadamente a una jeringa de un mililitro. Aspirar un centímetro de media base en el catéter, seguido de una pequeña burbuja de aire.A continuación, aspirar de cinco a siete embriones y 10 microlitros de medio base, seguido de otra pequeña burbuja de aire, y un último un centímetro de media base. Una vez cargados los embriones, coloque el conejo receptor anestesiado en una jaula en una etapa de calentamiento, y aplique ung ón en los ojos del animal. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, afeite el pelaje del abdomen ventral, limpie el área quirúrgica con jabón de gluconato de clorhexidina y retire el cabello restante.Cubra el área con una cortina estéril con un orificio para el área quirúrgica, e inserte un trocar endoscópico de cinco centímetros en la cavidad abdominal, dos centímetros caudales para el proceso de la phoide, y utilice un insuflador mecánico regulador de presión para inflar la cavidad peritoneal. Inserte la cámara del endoscopio a través del trocar endoscópico e inserte la aguja epidural del calibre 17 en la región inguinal, de dos a tres centímetros del infundibulum. Inserte el catéter cargado a través de la aguja epidural en el abdomen e inserte de uno a dos centímetros del catéter epidural a través del infundibulum en la ampolla.Presione suavemente el émbolo del catéter para liberar los embriones en el oviducto. Ambas burbujas de aire deben salir del catéter. Retire el catéter justo después de que los embriones hayan sido liberados, y aspire y libere el medio restante para confirmar la ausencia de los embriones.Después de confirmar una transferencia exitosa de los embriones, retire la aguja epidural y la cámara del endoscopio, y libere el dióxido de carbono abdominal a través del trocar endoscópico. Limpie la incisión del trocar con solución de clorhexidina y cierre la herida con un aluminio micronizado y un apósito de plástico. Luego trate al animal con los antibióticos y analgésicos apropiados, y monitoree al animal hasta su recuperación completa.La transferencia laparoscópica mínimamente invasiva de embriones coloca al conejo entre los mejores modelos animales para estudios reproductivos, con un alto porcentaje de embriones frescos transferidos que resultan en un cachorro. En particular, se alcanzan valores más altos cuando la transferencia de embriones frescos se realiza con embriones en la etapa morulae temprana o compacta. Se observan resultados similares después de la transferencia temprana y compacta de la morula de conejo vitrificado, particularmente con morulas compactas, lo que confirma la eficacia y fiabilidad de esta técnica para la transferencia de embriones frescos en vitrificados en conejos.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como las tecnologías de reproducción de asistencia condicional con el fin de responder a preguntas adicionales como cómo la adición de densidades puede incurrir en un efecto analgésico más adelante en la vida. Después del desarrollo reciente, esta técnica allana el camino para que los científicos en el campo de la reproducción exploren este efecto en humanos basado en la estrecha distancia filogenética entre el conejo y los seres humanos. Por lo tanto, esta técnica puede proporcionar resultados fácilmente transferibles a la medicina clínica humana, así como en otras especies de mamíferos.No olvide que nuestro método ofrece algunas ventajas higiénicas y económicas que se ajustan al concepto de tres R de bienestar animal, reemplazo, reducción y refinamiento, con la intención de mejorar el tratamiento humano de los animales experimentales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un etilenglicol basado en el método de vitrificación de embriones de ratón se describe. Es conveniente que otros métodos en su simplicidad y la toxicidad embrionaria bajo, y por lo tanto se puede aplicar ampliamente a muchas cepas de ratones, incluyendo ratones endogámicos y el gen modificado.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

En este video, describimos el procedimiento para la vitrificación de embriones de conejo cosechados en la etapa de desarrollo deseada utilizando etilenglicol y dimetilsulfóxido como crioprotectores y paja criogénica como sistema portador. Los embriones vitrificados tienen una alta tasa de supervivencia y pueden almacenarse durante un período prolongado hasta su uso.

Vitrificación de embriones de conejo con paja criogénica: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar embriones de conejo para su almacenamiento a largo plazo

Este video muestra el procedimiento para descongelar embriones de conejo vitrificados y los pasos de medición de precaución para una recuperación óptima del embrión.

Descongelación de embriones de conejo: un procedimiento de calentamiento para recuperar embriones de conejo criopreservados para la transferencia de embriones

Este video describe la técnica de transferir embriones al oviducto de una coneja receptora mediante laparoscopia. Permite la remodelación embrionaria en conejos durante su migración a través del oviducto, lo que finalmente ayuda a una implantación exitosa. Esta técnica también se puede utilizar para embriones almacenados con buena eficiencia.

Transferencia de embriones a conejo: un procedimiento para la transferencia guiada por laparoscopia de embriones al oviducto de un modelo de coneja receptora ovulante

El reciente desarrollo de herramientas de mutagénesis dirigida hace que la producción de knockout (KO) conejos posible. En el presente trabajo, hemos generado cinco conejos apolipoproteína (Apo) C-III KO utilizando nucleasas de dedos de zinc (ZFN). Este trabajo demostró que ZFN es un método muy eficiente para producir conejos KO.

La producción de la apolipoproteína C-III Conejos Knockout utilizando nucleasas de dedos de zinc

La transferencia de embriones útero-tubárica utiliza la unión útero-tubárica como una barrera para impedir la salida de embriones que puede ocurrir cuando se realiza la transferencia uterina. Se requieren machos vasectomizados obtener destinatarios pseudopreñadas para la transferencia de embriones. Ambas técnicas se discuten.

Transferencia de Embriones Utero-de trompas y vasectomía en el modelo de ratón

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.

Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Este protocolo describe metodologías para establecer un modelo de implantación embrionaria in vitro simple y eficiente para evaluar las moléculas relevantes que afectan el proceso de implantación embrionaria.

Establecimiento de un modelo de implantación embrionaria in vitro

Este protocolo describe una técnica de manejo de la preñez y la alimentación para conejos transferidos con embriones y modificados genéticamente, destinada a reducir la mortalidad de conejos recién nacidos y mejorar la eficiencia de la preparación de conejos editados genéticamente.

Manejo de la gestación y la lactancia para conejos transferidos con embriones y modificados genéticamente

Aquí, presentamos el protocolo Espátula Montevideo para vitrificar embriones de preimplantación de ratones y ovejas, que consiste en una espátula casera y utiliza soluciones caseras. Los embriones se equilibran rápidamente en dos soluciones crioprotectoras de concentración creciente, se cargan en la espátula, se sumergen en nitrógeno líquido y finalmente se sellan con una pajita de 0,5 ml.

Espátula Montevideo Dispositivo para la vitrificación de embriones de mamíferos

Aprende la transferencia de embriones laparoscópica mínimamente invasiva y vitrificación óptima en conejos. Este método permite almacenar y transportar embriones para estudios reproductivos aplicables a humanos.

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

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