Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

Aquí describimos por primera vez un método que permite la detección de fármacos de alto rendimiento para compuestos senoterapéuticos que han demostrado ser beneficiosos en enfermedades relacionadas con el envejecimiento. De hecho, varios ensayos clínicos con fármacos probados en esta esencia están actualmente en curso. La principal ventaja de esta técnica es distinguir entre dos tipos de fármacos senoterapéuticos, senolíticos y senomorfos, mediante el uso de la detección bien establecida de SA-beta-Galactosidasa en células senescentes.

Esta técnica es una importante herramienta de cribado para nuevos compuestos senoterapéuticos. De hecho, varios compuestos que se han identificado con la ayuda de esta pantalla se presentan en varias publicaciones de alto perfil, y actualmente están en ensayo clínico. Esta técnica es extremadamente versátil y puede adaptarse a varias pantallas de alto rendimiento.

De hecho, es posible multiplexar pantallas, y la pantalla de compuestos que suprimen la senescencia a través de la activación o inhibición de una de varias vías. Pica cada embrión en trozos de un milímetro y entubalo hacia arriba y hacia abajo varias veces. A continuación, añadir 10 mililitros de medio de crecimiento a los tejidos de cada embrión.

Artiarlos en un plato de cultivo de 10 centímetros, e incubar a 37 grados centígrados en 3% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante dos a tres días. E incubar el resto de cada embrión con 0.25%trypsin EDTA mezcla durante 10 minutos. Para probar las células, primero, retire cuidadosamente el medio de crecimiento y lave las células con 10 mililitros de 1X PBS dos veces.

Luego, agregue dos mililitros de una solución EDTA de 025 trippsina a las células, e incubarlos a 37 grados Centígrados durante dos a tres minutos. A continuación, inspeccione las células bajo un microscopio para asegurarse de que las células se separan de la superficie. Agregue la misma cantidad de medio de crecimiento para terminar la digestión de la trippsina, y transferir las células a un tubo cónico.

Luego, centrifuga las células a 200 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y agregue un medio de crecimiento fresco para volver a suspender las células. A continuación, cuente las células y se las semilla en nuevas placas en la densidad de celdas proyectada.

Para la subcultivación no senescente, primero, divida las células confluentes en una proporción de uno a cuatro. Luego incuba las células a 37 grados celsius en 3%oxígeno y 5%dióxido de carbono para extenderse para otro pasaje. A continuación, para inducir la senescencia celular, las semillas dividen las células confluentes del paso uno en una proporción de uno a cuatro e incubarlas a 37 grados centígrados en 20%oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante tres días.

Para monitorear la senescencia celular, con un avanzado sistema de contador de celdas Coulter, mida el aumento gradual en el diámetro de la célula y el volumen de la célula durante cada paso de la tripsinación. Para comenzar el ensayo de cribado beta-Gal, siembra 5.000 células senescentes o 3.000 células no senescentes por pozo en 96 placas de pozo. Luego, agregue 100 microlitros de medio de crecimiento a cada pozo e incuba las células a 37 grados Celsius y 20%oxígeno y 5% dióxido de carbono durante seis horas.

A continuación, agregue diluciones de fármacos a las células MEF e incubar las células a 37 grados centígrados en 20%oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Después de la incubación, retire la solución del medicamento y lave las células con 100 microlitros de 1X PBS. Para inducir la alcalinización lisosomal, pretrata las células con 90 microlitros de solución de bafilomicina A1, diluidas en un medio de cultivo celular fresco a una concentración final de 100 nanomolares.

Luego, incuba las células a 37 grados centígrados en un 20% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Para el análisis de fluorescencia de la actividad SA-beta-Gal, haga una solución de trabajo fresca de C12FDG diluida en medio de crecimiento, a una concentración final de 100 micromolares. Luego, agregue 10 microlitros de la solución de trabajo al medio de cultivo a una concentración final de 10 micromolares, e incubar las células a 37 grados centígrados en 20% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante dos horas.

Lavar las células con 100 microlitros de 1X PBS. A continuación, añada dos microlitros de un tinte Hoechst 33342 de 100 microgramos por mililitro a una concentración final de dos microgramos por mililitro. Incubar las células a 37 grados centígrados, 20% de oxígeno y 5% dióxido de carbono durante 20 minutos.

Después de la incubación, retire el medio, agregue 100 microlitros de medio de crecimiento fresco y proceda a la toma de imágenes. En este estudio, una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido permitió la identificación de fármacos senolíticos, como 17-DMAG, que redujeron las actividades generales de SA-beta-Gal en cultivos celulares de fibroblastos embrionarios murinos que contienen células senescentes en el paso cinco. Los análisis cuantitativos generados por software de mezclas de células senescentes y no senescentes permiten la demostración clara de los efectos senescentes específicos de las células, y la eliminación de la actividad beta-galactosidasa de fondo por bafilomicina A.Asegúrese de que se incluyan todos los controles celulares necesarios, especialmente las células senescentes no tratadas y las células senescentes tratadas con un control positivo.

Este ensayo incluye trabajar con células primarias bajo estrés oxidativo, lo que puede conducir a variaciones que necesitan ser monitoreadas. Este procedimiento es el primer paso en la detección de fármacos senoterapéuticos. Es necesario realizar ensayos adicionales de viabilidad celular y senescentes celulares para confirmar los resultados de la proyección.

Se han detectado varios fármacos senolíticos nuevos utilizando este ensayo, incluyendo la primera combinación de fármacos senolíticos dasatinib quercetina, inhibidores de la proteína de choque térmico 90, inhibidores de la familia Bcl-2 y la fisetina de polifenol.