Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo
7 de septiembre de 2018
Un método de microscopía electrónica correlativos (CLEM) se aplica a estructuras intracelulares inducida por virus de imagen mediante microscopia electrónica (EM) en las células que son previamente seleccionadas por microscopía de luz (LM). EM y LM se combinan como un enfoque de imagen híbrida para lograr una visión integrada de las interacciones virus-huésped.
Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biología sobre cómo las bioproteínas que se encuentran en las membranas celulares crean entornos que favorecen la bio-replicación y el ensamblaje. Los dos pilares técnicos que se combinan aquí son, en primer lugar, la correlación entre las imágenes de células vivas y la microscopía electrónica, y en segundo lugar, la congelación a alta presión. Aunque este método ha sido diseñado y utilizado con éxito para abordar las interacciones entre las fuentes de virus, puede generalizarse fácilmente a una serie de aplicaciones en biología celular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que hay muchos pasos que requieren experiencia práctica con éxito, especialmente la crioinmovilización por congelación a alta presión y los pasos posteriores. Comience colocando discos de zafiro estampados con un patrón alfanumérico grabado en una de sus superficies en un tubo de centrifugación cónico de 15 mililitros y lave bien los discos con etanol. Coloque los discos de zafiro lavados en una placa de Petri forrada con papel de filtro para que se sequen y use pinzas largas y delgadas para transferir los discos de zafiro secos a portaobjetos de vidrio. Usando un microscopio invertido con un aumento de 4x, confirme que el patrón de coordenadas en cada disco de zafiro es legible. A continuación, esterilice los discos con un reticulante ultravioleta durante cinco minutos. En un gabinete de bioseguridad, agregue la mitad del medio de cultivo celular a un plato de cultivo celular y use pinzas largas para transferir cuidadosamente los discos de zafiro al plato. Luego, siembra 1x10
Descripción general
Este artículo presenta un método de microscopía electrónica de correlación con microscopía óptica (CLEM) para visualizar estructuras intracelulares inducidas por virus. Al integrar la microscopía óptica (LM) y la microscopía electrónica (EM), los investigadores pueden obtener información sobre las interacciones entre virus y huésped.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Técnicas de Microscopía
- Interacciones Virus-Huésped
Antecedentes
- El método combina la microscopía de células vivas con microscopía electrónica.
- La congelación a alta presión es un componente esencial de la técnica.
- Se ha aplicado con éxito para estudiar interacciones virales.
- El método puede generalizarse a diversas aplicaciones en biología celular.
Objetivo del estudio
- Visualizar estructuras inducidas por virus en células.
- Mejorar la comprensión de las interacciones bio-proteicas en membranas celulares.
- Ofrecer una guía práctica para investigadores que utilicen este método.
Métodos Utilizados
- Preparación de discos de zafiro con patrón para imágenes.
- Uso de microscopía invertida para confirmar el patrón.
- Esterilización de los discos mediante reticulación ultravioleta.
- Técnicas de cultivo celular para sembrar células en discos de zafiro.
Resultados Principales
- Visualización exitosa de estructuras intracelulares inducidas por virus.
- Demuestra la eficacia de la microscopía correlativa de fluorescencia y electrónica (CLEM) en el estudio de las interacciones entre virus y huésped.
- Pasos prácticos descritos para implementar el método.
- Aplicaciones potenciales en contextos más amplios de la biología celular.
Conclusiones
- El método CLEM proporciona información valiosa sobre la biología viral.
- Reduce la brecha entre la microscopía óptica y la microscopía electrónica.
- Se fomentan aplicaciones adicionales en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía correlativa de luz y electrones (CLEM) aborda un cuello de botella crítico en la investigación virológica al permitir el análisis dirigido de poblaciones celulares raras transfectadas o infectadas. Al combinar imágenes de células vivas basadas en fluorescencia con una preservación ultraestructural de alta resolución mediante congelación a alta presión, este método aumenta la confianza predictiva en estudios mecanicistas de las interacciones entre virus y huésped. Facilita la validación temprana de objetivos y el desarrollo de ensayos al proporcionar datos correlativos que vinculan fenotipos funcionales con la arquitectura subcelular, informando decisiones de avance o interrupción en las líneas de descubrimiento de antivirales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la expresión de proteínas virales marcadas con fluorescencia con cambios ultraestructurales en células inmovilizadas por criofijación.
- Valor operativo: Aumenta la eficiencia en el estudio de eventos de transfección o infección de baja eficiencia mediante un preanálisis por microscopía óptica.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización de alteraciones en las membranas inducidas por el virus y de los sitios de ensamblaje relacionados con complejos de replicación.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas correlacionadas de fluorescencia y densidad electrónica que permiten la evaluación cuantitativa de la localización de proteínas virales y las perturbaciones estructurales.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras utilizando discos de zafiro patrones, facilitando una correlación reproducible entre experimentos y usuarios.
- Preparación del ensayo: Produce muestras con preservación ultraestructural adecuada para análisis morfométricos e imágenes posteriores en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Mantiene la fidelidad estructural desde la imagenología de células vivas hasta la microscopía electrónica, apoyando la selección fenotípica alineada con biomarcadores en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Modelado Preclínico: Permite la caracterización detallada de los efectos citopáticos inducidos por virus en estados casi nativos, mejorando la confianza en la extrapolación traduccional.
- Avance Ajustado al Riesgo: Proporciona evidencia ultraestructural para respaldar o refutar mecanismos de acción de candidatos antivirales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La MELC se integra en el continuo de descubrimiento desde la generación de hipótesis en virología temprana hasta la validación mecanicista en la optimización de compuestos líderes, especialmente cuando se necesitan correlatos estructurales de la función proteica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la visualización directa de estructuras asociadas a proteínas virales en subpoblaciones celulares definidas.
- Selección: Mejora la fiabilidad del ensayo mediante la localización estandarizada de células y la criopreservación, reduciendo la variabilidad en las lecturas estructurales.
- Análisis: Proporciona conjuntos de datos correlacionados de microscopía óptica y electrónica que permiten la comparación cuantitativa de condiciones basada en la intensidad de fluorescencia y características ultraestructurales.
- Investigación Traducional: Conecta la imagen funcional con datos estructurales de alta resolución, apoyando la continuidad desde ensayos basados en células hasta la validación mecanicista.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el estudio de interacciones virus-huésped aplicable a múltiples objetivos y familias virales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar evidencia correlativa directa de la localización de proteínas virales y de los cambios estructurales inducidos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante el uso estandarizado de sustratos estructurados y congelación a alta presión, minimizando los artefactos derivados de la fijación química.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas sobre continuar o descartar un candidato al validar el acoplamiento al blanco a nivel ultraestructural, reduciendo el riesgo de fracaso en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos antivirales basada en efectos confirmados sobre compartimentos de replicación viral o sitios de ensamblaje.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de fluorescencia en células vivas, congelación a alta presión, sustitución criogénica y microscopía electrónica de transmisión.
- Depende del acceso a congeladores a alta presión, ultramicrotomos y sistemas de imágenes de microscopía correlativa de luz y electrones.
- Necesita la estandarización de marcadores fiduciales (por ejemplo, discos de zafiro con patrón) y protocolos de mapeo de coordenadas entre equipos.
- La adaptación a diferentes tipos celulares o sistemas virales puede requerir la optimización de la eficiencia de transfección, la marcación fluorescente y los parámetros de congelación.
- Las limitaciones prácticas incluyen un bajo rendimiento debido al equipo especializado y la necesidad de alineación mediante software correlativo, como se indica en el material de origen.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
