Name: Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) para visualizar estructuras intracelulares inducidas por virus en células inmovilizadas por criofijación. Este método integra imágenes de células vivas con microscopía electrónica.

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Estamos muy agradecidos a los miembros del personal de la microscopia electrónica base instalaciones (EMCF) en el EMBL (Heidelberg) y en la Universidad de Heidelberg. También quisiéramos agradecer a Ulrike Herian, Stephanie Kallis y Andrea Hellwig (Universidad de Heidelberg), Eberhardt Schmidt y Renate Kunz (Universidad de Ulm) de asistencia técnica de expertos. Trabajo por R.B. y su equipo (H.U. y B. I.R.) fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 y TRR83, TP13.

Los autores no tienen nada que revelar.

La metodología de CLEM presentada aquí para estudiar el impacto de una expresión de la proteína viral en las membranas celulares se ha utilizado con éxito antes de dilucidar el VHC asociados de replicación de las estructuras, principalmente21de la vesículas (DMV) de doble membrana, así como determinar los bloques de edificio crítico requeridos para formar estas estructuras HCV-inducido23. Tenga en cuenta que en nuestro primer trabajo con CLEM para el estudio de la replicación del VHC21, se aplicó una versión ligeramente modificada del protocolo descrito aquí. En ese estudio, discos zafiro grueso convencional 0.05 mm, sin patrón alfanumérico, se utiliza en el que un patrón de referencia fue creado por carbón capa con una cuadrícula de buscador en la parte superior (véase Tabla de materiales). Esta versión del actual protocolo puede eventualmente aplicar, con la ventaja que el "Un" portador de HPF puede utilizarse directamente, sin necesidad de cortar hacia abajo como en la figura 3A. Por otra parte, como se menciona en el protocolo, un más grueso "A" portador puede ser utilizado (véase Tabla de materiales) con discos zafiro estampados, sin la necesidad de un operador "B".
Curiosamente, este protocolo se puede aplicar no sólo para estudiar muestras de BSL-1, tales como las células transfected con proteínas virales según lo descrito aquí y en otros lugares19,23, sino también para el estudio de células infectadas por virus. Aunque trabajo con patógenos humanos está generalmente restringido a laboratorios BSL-2 y BSL-3, en algunos países es posible realizar cryo-inmovilización en estas condiciones de bioseguridad. En los BSL-2 y BSL-3 laboratorios donde no es posible, debido a las regulaciones locales o a la ausencia de una máquina de HPF vitrificación, células infectadas por virus pueden todavía prepararse utilizando este método si se realiza fijación química con aldehídos por adelantado, es decir, antes para dejar las instalaciones BSL-2 o BSL-3. Además, aldehídos que se apagará inmediatamente después de la fijación para evitar la fluorescencia, mientras que el resto del protocolo es idéntico al descrito aquí. Esta técnica puede considerarse redundante porque las células se fijan dos veces y químicamente mediante vitrificación. Sin embargo, este protocolo de fijación doble de hecho conduce a una mucho mejor preservación de la DMV HCV-inducido en comparación con el DMV en células sometidas a fijación química solo21.
Para más modificaciones y resolución de problemas el lector es referidos a las notas a lo largo de la parte de protocolo de este manuscrito. Estas notas describen errores a evitar, así como las alternativas para superar posibles dificultades que pueden surgir al realizar este método.
El principal requisito para la aplicación de esta técnica es una máquina de HPF. Cuando crio-inmovilizar las células vía HPF no es factible (debido a la ausencia de una máquina de HPF) o no es necesario (cuando la preservación de la membrana no es necesario ser óptimos), las células pueden ser químicamente fijo y posteriormente preparado y analizadas por EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Esta opción no requiere el uso de discos zafiro, pero platos de cultivo celular con patrones cuadriculados para la reubicación de las células o grupos de células. La principal ventaja del uso de estos platos es su diámetro más grande en comparación con discos zafiro, lo que permite la proyección de las superficies más grandes. Por lo tanto, la aplicación de este protocolo de CLEM ha sido aplicada con éxito para estudiar el efecto de un compuesto antiviral contra VHC15 o para visualizar los cambios de la membrana inducidos por las proteínas no estructurales de los norovirus19. Otra cuestión que puede limitar los resultados de este método es la ausencia de un dispositivo comercial de FS. En este caso, sistemas de FS caseros básicos pueden ser utilizados en su lugar. Aunque los dispositivos automáticos de FS podrían reducir manejo de contratiempos, dispositivos caseros se utilizan con éxito por ejemplo en laboratorios de Paul Walther y30 de Kent McDonald .
Con respecto a la fijación química, el protocolo descrito aquí asegura una conservación óptima de las estructuras intracelulares20. Por lo tanto, en el caso de los dispositivos mencionados de HPF y FS están disponibles, vitrificado de las células de interés sería preferido.
Alternativas futuras a este enfoque de CLEM incluyen la posibilidad de utilizar este método no sólo para adquirir información 2D a nivel ultraestructural, sino también para obtener información 3D sobre la arquitectura de las membranas y organelas alteraciones causadas por virus. Los métodos EM 3D, incluyendo tomografía de electrón (ET) y ion enfocado viga-microscopía electrónica (SEM-FIB) (ampliamente descrito en29), podrían aplicarse también a las células que han sido preparadas siguiendo este protocolo actual21, 31. Además, 3D podría también obtenerse información en el nivel de LM, cuando se utiliza un microscopio confocal, que permite la adquisición de pilas de z. De hecho, esta opción se recomienda cuando una correlación exacta entre conjuntos de datos EM y LM es deseada (véase por ejemplo17). La información incluida en 3D z-pilas ayuda a mejorar la correlación con las imágenes 2D de TEM. Así, en tal escenario, el mejor montaje de imágenes EM y LM puede ser seleccionado y después sometido a uno de los software de correlación disponible, por ejemplo el plugin de CE-CLEM de ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 o el plugin de las correspondencias de la señal de Imagen J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resultando en la generación de imágenes de LM-EM se superponen.
Cuando la información temporal es necesario para comprender la cinética de un determinado evento, proyección de imagen de Time-lapse puede utilizarse para monitorear la dinámica de las células vivas en combinación con EM. Durante el evento de interés, las células se fijan inmediatamente, generando una "instantánea congelada" que puede ser posteriormente analizada por EM, proporcionando información ultraestructural detallada sobre ese momento en el tiempo de inmovilización. Para obtener esa "instantánea inmovilizada", después de la observación en tiempo real, las células pueden ser químicamente fijo33 o inmovilizada de cryo6. Ya que muchos procesos celulares ocurren más rápidamente que los procesos de difusión de fijación química, si es posible, debe realizarse congelación ultra rápida. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las máquinas de HPF difieren en su tiempo efectivo resolución34.
Además, aunque este protocolo ha sido diseñado para la fijación de las células en una resina de epoxy, las células pueden ser también incrustadas en las resinas de baja viscosidad, tales como Lowicryls, White LR o LR oro. El uso de estos medio de inclusión permite preservar la antigenicidad35,36, así como la fluorescencia37,38 y, por lo tanto, se utilizan sobre todo para incrustar la inmunomarcación en sección39 , 40 y en la sección CLEM41,42,43,44, donde el LM se realiza después de la incrustación. Ambos enfoques (inmuno-EM y en la sección CLEM) deben ser cruciales para aquellos experimentos en que las estructuras de la característica no se pueden encontrar fácilmente mediante TEM o como control contra miscorrelation entre LM y EM señales. Así mismo, etiquetado con anticuerpos que pueden ser visualizados por ambas modalidades de imágenes (LM y EM) puede llevarse a cabo45 para, por ejemplo, identificar células transfected en LM (la pre-inserción etapa) y alcanzar una localización mucho más exacta de la Señal GFP a través de su etiqueta específica por inmuno-EM (etapa posterior incrustación). Debe tenerse en cuenta, sin embargo, esa permeabilización se lleva a cabo antes de LM para permitir el acceso de los anticuerpos al espacio intracelular, que puede resultar en una conservación óptima de la arquitectura de la célula en el nivel de EM. Curiosamente, este protocolo está también bien adaptado para experimentos de varios colores que se logra con el uso de otras etiquetas fluorescentes, que no sean de GFP (como se muestra aquí). En conclusión, existen muchas supuestas posibilidades de adaptación de este protocolo, tanto en el LM o en los lados de la EM, según las preguntas que se están abordando. Para una completa descripción de otros protocolos alternativos el lector se refiere a5,46. Independientemente de cómo se combinan las modalidades de microscopía, juntos el resultado es un aumento de la información, lo que nos permite comprender mejor cómo el virus y sus proteínas interactúan con sus anfitriones en la vida real.
El paso más crítico dentro de este método es la colección de secciones seriadas de las células de interés. Como se destacó en la sección de resultados representativos, esto requiere personal experto, así como mucha paciencia. Lo importante, este paso es fundamental para encontrar las células en el nivel de EM por dos razones. En primer lugar, en este tipo de protocolo de CLEM utilizando la pre-inserción LM, las coordenadas sólo son visibles en el plano de la LM y en la cara del bloque de resina después de la incrustación. Sin embargo, no serán visibles en las secciones por TEM. Por lo tanto, objetivo recortar en el bloque hacia abajo a las regiones de interés (ROIs) debe realizarse cuidadosamente con una cuchilla de afeitar para garantizar que las secciones que se obtienen posteriormente contienen las células que expresan un determinado PF. En segundo lugar, varias secciones de la "exploración" es necesaria encontrar el mejor recubrimiento entre el LM y las adquisiciones de EM. En contraste con métodos que LM se realiza en la etapa de la inclusión, en este caso el recubrimiento LM-EM no es tan preciso. La precisión baja superposición es debido a diferencias en la resolución axial entre LM y EM, contracción durante el procesamiento de la muestra de EM y la compresión durante el seccionamiento42. Sin embargo, métodos de seguimiento eficiente, como el uso de lugares de interés, ayudan a encontrar las células detrás. Esto incluye la posición de una celda a otra, así como la forma de las células y su núcleo. En este sentido, como se explica en el protocolo, DIC imágenes proporcionan información "anatómica" de las células que son fundamentales para mejorar la correlación. Alternativamente, los núcleos u otros orgánulos celulares así reconocible (como las mitocondrias o lípido gotitas) puede ser teñido antes de LM y utilizado como puntos de referencia.
Por último, cabe mencionar que aunque este manuscrito se centra en el uso de esta técnica para estudios de virología, puede ampliarse el alcance de este diseño experimental para abordar cuestiones biológicas más generales.

La idea de combinar dos modalidades de microscopía para obtener una mejor imagen de un proceso biológico específico es bastante vieja. Así, el primer estudio acerca de los virus con "microscopía correlativa" se publicó en 1960 como dos publicaciones separadas1,2. En ese estudio, los autores analizaron los cambios en la morfología del núcleo inducida por adenovirus por medio de dos técnicas de microscopía. En la primera publicación, observaciones de microscopía electrónica (EM) que describe los detalles morfológicos asociados con la infección del adenovirus fueron reportados1. En una segunda publicación, las diferentes estructuras observadas por EM se correlacionaron con las imágenes de microscopía de luz (LM) de patrones de tinción histoquímicos, para definir la naturaleza de las estructuras previamente observado por EM2.
En estos estudios iniciales, sin embargo, sus observaciones se realizaron utilizando diferentes células infectadas como experimentos independientes. La "correlación", de hecho, iba como la combinación de información proveniente de dos modalidades de imágenes para comprender un fenómeno, comparando todos los hallazgos que han sido obtenidos con diferentes ensayos para entender una determinada biológica proceso.
En la actualidad, la microscopía correlativa del término, también conocido como correlativa luz y la microscopia (CLEM), se aplica a un número creciente de métodos (revisado en referencias3,4,5), con la concordancia que ambas técnicas de imagen (EM y LM) se llevan a cabo en la misma muestra. Resultados de la combinación de ambos métodos, de tal modo, en un análisis multimodal, multiescalar y multidimensional de la muestra3. Las ventajas son que LM puede proporcionar una amplia visión de muchas células diferentes, lo que permite la identificación de subpoblaciones de células expresan una proteína o proteínas de interés dentro de una población celular heterogénea. EM supera el límite de resolución de LM, proporcionando una mayor resolución de imagen de un evento en particular intracelular. Además, la EM permite la visualización del contexto subcelular no fluorescente, incluyendo todos los organelos de membrana enlazado, grandes complejos macromoleculares (por ejemplo, los ribosomas, centriolos, etc) y elementos citoesqueléticos, así proporcionando información espacial adicional, el llamado "espacio de referencia"6y dar contexto a la mancha fluorescente detectada por LM.
Durante los últimos años, CLEM se ha convertido en una herramienta poderosa no sólo para biólogos de la célula5, sino también para los virólogos (revisados en la referencia7) dispuestos a comprender la interacción virus-célula compleja que conducen a una propagación de virus exitoso. Por lo tanto, entender cómo los virus modifican las membranas celulares y orgánulos para su propio beneficio es esencial para el desarrollo de fármacos antivirales para erradicar virus patógenos.
Aquí, CLEM describe un método es que permite la detección de LM de las células que expresan proteínas virales que unida a una proteína fluorescente (FP). Estas células son posteriormente cryo-inmovilizado y más preparados para análisis ultraestructural por microscopia electrónica de transmisión (TEM) para obtener nuevos conocimientos sobre cómo la expresión de estas proteínas reorganizar las membranas intracelulares (figura 1). CLEM ha llevado a cabo con células químicamente fijas en la mayoría de los estudios de virología publicados a fecha8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Esto es principalmente debido a la necesidad de inactivar el material infeccioso por razones de bioseguridad en nivel 2 de bioseguridad y laboratorios (BSL-2 y BSL-3)-3, donde crio-inmovilización de células no es generalmente posible. Para aquellas preguntas que requieren una conservación óptima de las membranas celulares, vitrificación mediante alta presión (HPF) de congelación, sin embargo, recomienda20. En estos casos, se puede aplicar el protocolo de CLEM descrito aquí. Interesante, especialmente cuando se trabaja con muestras infecciosas, HPF puede realizarse en muestras que han sido previamente inactivadas químicamente, por ejemplo en laboratorios BSL-2 y BSL-3. La combinación de fijación química seguida de HPF es una posibilidad de por lo menos parcialmente se benefician de las ventajas de la criopreservación métodos21,22.
<img alt="Diagrama del proceso de microscopía óptica a microscopía electrónica de transmisión; preparación y seccionamiento celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Representación esquemática del flujo de trabajo para el análisis de las células a través de CLEM. Las células crecen en discos zafiro estampados primero son analizadas por LM para localizar las células expresaban FPs antes de su tratamiento para la EM. Una vez localizado, las células se fijan inmediatamente por HPF y FS para posteriormente ser embebido en resina. En la polimerización de la resina, el soporte donde fueron creciendo las células (= discos zafiro) debe extraerse el bloque de resina. El bloque que contiene las células incrustadas se recorta a un pequeño trapecio que las células restantes, expresando FPs, se seccionaron con un cuchillo de diamante. Secciones ultrafinas son recogidas en rejillas de ranura y más examinadas por TEM para obtención de datos ultraestructurales de estas células. Esta cifra es adaptada y modificada con permiso de referencia29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Reticulante UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Stratalinker 1800, 230 Vac, equipado con bombillas de luz UV de 254 nm, 8 vatios/cada una.</td></tr><tr><td>Discos de zafiro estampados</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suiza</td><td>627</td><td>Tienen un diámetro de 0,3 mm y un grosor de 0,16 mm, así como un patrón alfanumérico grabado para permitir la reubicación de las celdas. Solo se pueden pedir por correo electrónico: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Pinzas delgadas y largas</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72919-SS</td><td>"Style SS", para el manejo de discos de zafiro.</td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td><td>. 41965-062</td><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 2 mM de L-glutamina, aminoácidos no esenciales, 100 unidades de penicilina por ml, 100 y micro; g de estreptomicina por ml y 10% de suero fetal para terneros (DMEM completo, ver más abajo). Envase de 10 frascos de 500 mL/c/u.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>25030-123</td><td>Paquete que contiene 20 frascos de 100 mL/cada uno.</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11140-068</td><td>Paquete que contiene 20 frascos de 100 mL/cada uno.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140-163</td><td>Paquete que contiene 20 frascos de 100 mL/cada uno.</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU</td>. <td>F7524</td><td>Frasco de 50 mL</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus Deutschland, Hamburgo, Alemania</td><td>CKX41</td><td>Es un microscopio invertido con opciones de cabezal trinocular y capacidad de actualización de fluorescencia.</td></tr><tr><td>Células Huh7-Lunet que expresan de manera estable la ARN-polimerasa T7</td><td>Disponible en el laboratorio del Prof. Dr. Ralf Bartenschlager</td><td>No disponible</td><td>Póngase en contacto con el Prof. Bartenschlager en: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Mirus TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio LLC, Madison, EE. UU</td>. <td>MIR 2304</td><td>Reactivo de transfección de ADN de amplio espectro, baja toxicidad. Vial de 0,4 mL</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia de campo amplio invertido</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Alemania</td><td>Zeiss Observer.Z1</td><td>Microscopio de fluorescencia invertida para experimentos con cultivos de células vivas.</td></tr><tr><td>1-hexadeceno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>8220640100</td><td>Frasco de 100 mL</td></tr><tr><td>"A" soportes de aluminio para frezing de alta presión (HPF)</td><td>Oficina de Ingeniería M. Wohlwend, Sennwald, Suiza</td><td>241</td><td>Este es el soporte que se ha utilizado para este protocolo y tiene 2 profundidades diferentes de 0,1 y 0,2 mm. Solo se puede pedir por correo electrónico: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Soportes de aluminio "B" para HPF</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suiza</td><td>242</td><td>Este es el soporte que se ha utilizado para este protocolo. Tiene un grosor de 0,3 mm. Solo se pueden pedir por correo electrónico: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Soporte de aluminio "A" para HPF (especial para trabajar con discos de zafiro estampados)</td><td>Oficina de ingeniería M. Wohlwend, Sennwald, Suiza</td><td>737</td><td>Este es el soporte que se puede utilizar solo con el disco de zafiro estampado (como alternativa al protocolo actual), sin necesidad de un soporte "B" o la edición del soporte "A". Tiene un grosor de 0,84 mm. Solo se puede pedir por correo electrónico: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Discos de zafiro Oficina de</td><td>Ingeniería M. Wohlwend, Sennwald, Suiza</td><td>405</td><td>Estos discos de zafiro son los "convencionales", con un diámetro de 0,3 mm y un grosor de 0,05 mm. También se pueden utilizar para CLEM como alternativa en lugar de los discos de zafiro estampados.</td></tr><tr><td>Rejillas buscadoras Electron</td><td>Microscopy Sciences, Hatfield, Filadelfia, EE.UU</td>. <td>LF135-Cu</td><td>Estas 135 rejillas de malla se utilizan para crear un patrón alfanumérico en discos de zafiro "convencionales" (descritos anteriormente) mediante un recubrimiento de carbono, de modo que se pueden utilizar para CLEM. 100 rejillas/vial.</td></tr><tr><td>Máquina HPF</td><td>ABRA Fluid AG, Widnau, Suiza</td><td>HPM 010</td><td>Esta máquina HPF se ha utilizado para este protocolo.</td></tr><tr><td>Máquina HPF</td><td>Leica Microsystems, Viena, Austria</td><td>EMPACT 2</td> <td>"EMPACT 2", como alternativa al uso de la máquina HPM que se ha utilizado en este protocolo (descrito anteriormente).</td></tr><tr><td>Tubos criogénicos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td><td>. Z763667-500EA</td><td>Para el almacenamiento a largo plazo de muestras crioinmovilizadas en nitrógeno líquido. Paquete que contiene 500 crioviales.</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido dewar</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Alemania</td><td>GZ-05094-60</td><td>Para el almacenamiento a largo plazo de muestras crioinmovilizadas en nitrógeno líquido, equipado con crio-racks con una capacidad de 1600 tubos criogénicos.</td></tr><tr><td>Máquina automática de sustitución por congelación (AFS)</td><td>Leica Microsystems, Viena, Austria</td><td>EM AFS2</td><td>Esta máquina realiza técnicas de sustitución por congelación y descenso progresivo de la temperatura (PLT) y permite la inclusión y polimerización de resinas a baja temperatura.</td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio (OsO4)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica, Hatfield, PA, EE. UU</td><td>. 19150</td><td>Solución acuosa al 4%, una caja que contiene 10 ampollas de 2 mL.</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo (UA)</td><td>Serva, Heidelberg, Alemania</td><td>77879.01</td><td>Frasco que contiene 25 grs de (UA)-2 H2O.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin Electronic, Berlín, Alemania</td><td>329</td><td>"Sonorex Super RK 31" es un baño de limpieza ultrasónico de alta potencia para solución de limpieza acuosa que se utiliza en este protocolo para mezclar OsO4 y Ua al preparar el medio FS.</td></tr><tr><td>Acetona destilada en vidrio</td><td>Electrónica Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU</td><td>. 10015</td><td>Frasco de 100 mL</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems, Viena, Austria</td><td>Leica M80</td><td>Microscopio estereoscópico de rutina para inspecciones diarias, equipado con una cámara para capturar imágenes.</td></tr><tr><td>Resina epoxi</td><td>Electrónica Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>14120</td><td>Embed 812 es un kit que contiene varios componentes que deben mezclarse entre sí en las proporciones dadas por los fabricantes.</td></tr><tr><td>Anillos de flujo Leica</td><td>Microsystems, Viena, Austria</td><td>16707157</td><td>Paquete que contiene 100 piezas.</td></tr><tr><td>Baños de reactivos</td><td>Leica Microsystems, Viena, Austria</td><td>16707154</td><td>Paquete que contiene 100 piezas.</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems, Viena, Austria</td><td>Leica EM UC7</td><td>Ultramicrótomo para la preparación de secciones semifinas y ultrafinas a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante Ultra 35 &deg</td><td>Diatome Ltd., Nidau Suiza</td><td>AGG339-735</td><td>Este cuchillo tiene una longitud de filo de 3 mm.</td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU</td>. <td>E78318</td> <td>"Style 3X", para el manejo de rejillas EM.</td></tr><tr><td>Rejillas de ranuras EM Ciencias de</td><td>la Microscopía Electrónica, Hatfield, PA, EE. UU</td>. <td>G2010-Cu</td><td>100 rejillas/vial.</td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de red EM</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU</td><td>. 71155</td><td>Tiene capacidad para 100 redes.</td></tr></tbody></table>

correlativos luz microscopia electrónica (clem) para el seguimiento y proyección de imagen proteína viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de cryo

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Debido a su alta resolución, la microscopia electrónica (EM) es una herramienta indispensable para los virólogos. Sin embargo, una de las principales dificultades al analizar infectado o transfected las células por medio de EM son la baja eficiencia de la infección o transfección, lo que dificulta el examen de estas células. Para superar esta dificultad, microscopía de luz (LM) se puede realizar primero para asignar la subpoblación de células infectadas o transfected. Así, aprovechando el uso de proteínas fluorescentes (FPs) unida a las proteínas virales, LM se utiliza aquí para registrar las posiciones de las células "positivo-transfected", expresando una FP y creciendo sobre un soporte con un patrón alfanumérico. Posteriormente, las células son procesadas más de EM con alta presión (HPF) de congelación, congelación de resina incrustación y sustitución (FS). El paso de congelación ultra rápido garantiza la preservación excelente de la membrana de las celdas seleccionadas que luego pueden ser analizadas a nivel ultraestructural por microscopia electrónica de transmisión (TEM). Aquí, se proporciona un flujo de trabajo de microscopía de electrones luz correlativa paso a paso (CLEM), describiendo la preparación de la muestra, la proyección de imagen y correlación en el detalle. El diseño experimental se puede aplicar también para hacer frente a muchas preguntas de Biología de la célula.

Utilizando el procedimiento presentado aquí (figura 1), las células Huh7 Lunet estable expresando la T7 ARN polimerasa fueron sembradas en discos de zafiros con dibujos y posteriormente transfectadas con un plásmido de expresión de dos dominios del virus de la Hepatitis C (HCV) proteína no estructural NS5A, etiquetadas con GFP (pTM_AH-D1-GFP) (figura 4). Al día siguiente, los discos zafiro estampados, donde las células crecen, se sacan los platos de cultivo celular y reflejados por medio de la LM (figura 4, figura 2). Esas células que expresan la GFP-D1-AH fueron identificados por la presencia de fluorescencia verde en el citosol y grabados para salvar sus posiciones dentro del coordenadas-patrón de los discos de zafiro (figuras 5A, 5B). Inmediatamente después de su examen de LM, los discos de zafiro que contiene las células de interés fueron montados entre dos portadores de aluminio (figura 3) y sometidas a cryo-inmovilización por HPF. Las células fueron entonces congelar substituido y posteriormente embebida en una resina epóxica.
Al retirar los discos de zafiro de los bloques de resina polimerizada, la impronta del patrón alfanumérico era visible en la cara del bloque, que permitió recuperar las áreas donde se encontraban las células de interés. El resto del bloque de resina fue recortado distancia para generar un pequeño trapecio que las células de interés. Las secciones ultrafinas seriales fueron obtenidas de este trapecio, recogidas en rejillas de ranura de EM y más analizadas por TEM (figura 5C). Tenga en cuenta que obtener manualmente serial secciones consecutivas aunque es factible28 intensivo de mano de obra y requiere de personal bien entrenado. También es importante que las células tienen una confluencia baja cuando se someten a este protocolo de CLEM (figura 5A) con el fin de garantizar una rápida identificación de la misma célula previamente identificada por LM. De lo contrario, tener mayor confluencia celular podría dramáticamente disminuir la localización exitosa de las células a nivel de EM.
Análisis de temperatura de varias secciones ultrafinas de la célula de interés (figuras 5, 5E), expresando la AH-D1-GFP, reveló la presencia en su espacio intracelular de grandes acumulaciones de vesículas de morfología variable, delimitada de la alrededor de citosol por una bicapa de lípidos individuales (figura 5E).
<img alt="Diagrama experimental de replicación del ARN del VHC: resultado de la transfección celular y la microscopía de fluorescencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4 : Representación esquemática del flujo de trabajo seguido para llevar a cabo el ejemplo de CLEM en Figura 5 . Las células Huh7 Lunet estable expresando la T7 ARN polimerasa fueron transfectadas con un plásmido de ADN codifican el anfipáticos helix (AH) y el dominio 1 (D1) de la proteína NS5A del VHC, la etiqueta en su c-terminal con GFP (GFP-D1-pTM_AH). Se controla la expresión de esta parte de la proteína NS5A transcripcionalmente por un promotor T7 (T7 Pm) y forma por un elemento Encefalomiocarditis (EMCV) de virus IRES (sitio de la entrada interna del ribosoma), indicado por una estructura secundaria. Patrón de células de la transfección (hpt 24) 24 h en discos zafiro y expresan la GFP-D1-AH fueron detectados por LM y sometido inmediatamente a HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de la estructura celular; secciones de núcleo; diagrama de microscopía; Imágenes celulares 3D; estudio de ultraestructura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5 : Ejemplo de un procedimiento de CLEM. (A) Huh7 Lunet células expresando estable la polimerasa T7 analizada por microscopía de fluorescencia para asignar las células GFP-positivas cultivadas en discos zafiro estampados, 24 h después de la transfección con el plásmido pTM_AH-D1-GFP. Imagen de (B) el mayor aumento de una sola celda seleccionada dentro del rectángulo de puntos blanco para ser analizadas por CLEM. (C) imagen TEM de una sección ultrafina de la misma célula después de HPF, FS e incrustación de resina. (D) representación esquemática de las secciones seriales 70 nm ultrafinas en una cuadrícula de ranura EM que contiene la celda de interés. (E) a la izquierda: descripciones TEM de dos secciones de la célula de interés. A la derecha: imágenes TEM de alta ampliación de las áreas intracelulares seleccionadas en rectángulos amarillos a la izquierda, revelando un número elevado de vesículas delimitadas desde el citosol a través de una sola membrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un método de microscopía electrónica correlativos (CLEM) se aplica a estructuras intracelulares inducida por virus de imagen mediante microscopia electrónica (EM) en las células que son previamente seleccionadas por microscopía de luz (LM). EM y LM se combinan como un enfoque de imagen híbrida para lograr una visión integrada de las interacciones virus-huésped.

Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biología sobre cómo las bioproteínas que se encuentran en las membranas celulares crean entornos que favorecen la bio-replicación y el ensamblaje. Los dos pilares técnicos que se combinan aquí son, en primer lugar, la correlación entre las imágenes de células vivas y la microscopía electrónica, y en segundo lugar, la congelación a alta presión. Aunque este método ha sido diseñado y utilizado con éxito para abordar las interacciones entre las fuentes de virus, puede generalizarse fácilmente a una serie de aplicaciones en biología celular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que hay muchos pasos que requieren experiencia práctica con éxito, especialmente la crioinmovilización por congelación a alta presión y los pasos posteriores. Comience colocando discos de zafiro estampados con un patrón alfanumérico grabado en una de sus superficies en un tubo de centrifugación cónico de 15 mililitros y lave bien los discos con etanol. Coloque los discos de zafiro lavados en una placa de Petri forrada con papel de filtro para que se sequen y use pinzas largas y delgadas para transferir los discos de zafiro secos a portaobjetos de vidrio. Usando un microscopio invertido con un aumento de 4x, confirme que el patrón de coordenadas en cada disco de zafiro es legible. A continuación, esterilice los discos con un reticulante ultravioleta durante cinco minutos. En un gabinete de bioseguridad, agregue la mitad del medio de cultivo celular a un plato de cultivo celular y use pinzas largas para transferir cuidadosamente los discos de zafiro al plato. Luego, siembra 1x10

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Se demuestra la fabricación de una etapa criogénica de bajo costo diseñado para adaptarse a la mayoría de los microscopios de luz reflejada. Esta etapa criogénica de laboratorio permite construir imágenes correlativas eficiente y confiable entre la luz y la crio-crio-microscopía electrónica.

Bajo Costo Cryo-microscopio de luz para la luz de la etapa de fabricación correlacionadas / Microscopía Electrónica

La técnica CLEM se ha adaptado para analizar la morfología ultraestructural de las membranas, orgánulos, y estructuras subcelulares afectados por moléculas microinyectados. Este método combina las poderosas técnicas de micromanipulación / microinyección, microscopía fluorescente confocal y microscopía electrónica para permitir a milímetro resolución nanométrica múltiples. Esta técnica es viable para una amplia variedad de aplicaciones.

Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Este artículo describe la metodología de criomicroscopía electrónica, que se utiliza para obtener imágenes microscópicas de alta calidad de macromoléculas en su estado casi nativo. El método produce imágenes adecuadas para el procesamiento computarizado posterior utilizando el enfoque de partícula única, ideado para generar la reconstrucción 3D de una macromolécula.

Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

Se describe un método mediante el cual se pueden utilizar nanopartículas de puntos cuánticos (QD) para estudios inmunocitoquímicos correlativos de tejido de patología humana incrustado en epoxi. Empleamos QDs conjugados con fragmentos de anticuerpos comerciales que se visualizan mediante microscopía de luz de fluorescencia de campo amplio y microscopía electrónica de transmisión.

Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, "Flash-y-congelación", que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Aquí, presentamos un protocolo para la microscopía correlativa de luz-electrónica optimizada en sección basada en el marcaje endógeno y fluorescente como herramienta para investigar la localización de proteínas raras en relación con la ultraestructura celular. El poder de este enfoque se demuestra mediante la localización ultraestructural de LC3 endógena en células hambrientas sin tratamiento con bafilomycina.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

Presentamos un protocolo detallado para la microscopía correlativa de luz y electrónica posterior a la inclusión de Epon utilizando una proteína fluorescente llamada mScarlet. Este método puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Esta técnica es susceptible de una amplia variedad de aplicaciones biológicas.

Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon

Este protocolo describe un mecanismo para utilizar la microscopía óptica y electrónica correlativa para visualizar la interacción de mitocondrias y lisosomas marcados con mEosEM y APEX2, respectivamente.

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Este flujo de trabajo permite la producción de láminas dirigidas a estructuras biológicas marcadas con fluorescencia que son pequeñas (&lt;1 μm de extensión axial) y raras (1 copia por célula) utilizando una plataforma de imágenes criogénicas tricoincidentes. Esta plataforma integra microscopía de fluorescencia, fresado por haz de iones enfocado y microscopía electrónica de barrido en una sola posición focal y permite la microscopía de fluorescencia simultánea durante el fresado.

Flujo de trabajo que utiliza un microscopio criogénico de fluorescencia coincidente, electrones y haz de iones para la molienda dirigida de células

Aprende microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) para visualizar estructuras intracelulares inducidas por virus en células inmovilizadas por criofijación. Este método integra imágenes de células vivas con microscopía electrónica.

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Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo

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