Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cribado de fármacos, como la dilucidación del efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en concentraciones muy bajas para las interacciones proteína-proteína. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere calibración, se puede implementar en cualquier microscopio confocal y utiliza cantidades muy pequeñas de proteínas marcadas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de fármacos contra el cáncer, inhibidores de moléculas pequeñas y diversos inhibidores de fusión, ya que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones proteína-proteína.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones y agregaciones de proteínas in vitro, también se puede aplicar a otros sistemas, como la dinámica de proteínas de células vivas y las interacciones célula-célula. Para empezar, transforme las células pLysS con un vector pET-22b que contenga FKBP12 humano monomerizado y etiquetas N-terminal His6 y mVenus. Después de que las células se hayan recuperado de la incubación y el choque térmico, colóquelas en agar LB suplementado con antibióticos.

Transfiera las colonias transformadas a un cultivo iniciador de LB de 100 mililitros y crezca durante 16 a 20 horas a 37 grados centígrados con agitación. Después de la incubación, diluya el cultivo iniciador denso de uno a 100 en medio LB en dos lotes de 500 mililitros. Luego, crezca durante dos o tres horas hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,6 a 0,8.

Después de enfriar los cultivos en hielo, induzca la producción de proteínas con IPTG de 250 micromolares. Cultive los cultivos durante 16 a 20 horas a 21 grados centígrados y 200 rpm. A continuación, recoja las células por centrifugación a 2.000 g durante 20 minutos.

Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mililitros de tampón A IMAC suplementado con inhibidores de la proteasa sin EDTA. Ahora, sonique las celdas a 500 vatios, 20 kilohercios y 40% de amplitud a nueve segundos encendido, 11 segundos apagados durante 15 minutos en hielo. Tras la sonicación, se recolecta el material soluble por centrifugación a 20.000 g durante una hora a cuatro grados centígrados.

Transfiera el lisado soluble a un matraz cónico y agregue dos mililitros de resina TALON. Deje que la suspensión se incube durante una hora con una rotación de 105 rpm. Ahora, coseche la resina y lávela con 250 mililitros de tampón IMAC A seguidos de 500 mililitros de tampón IMAC B. Elute la proteína marcada con His6 utilizando el tampón IMAC C. Inyecte el eluido en una columna de exclusión de tamaño preequilibrada y recoja el pico FKBP12, que eluye a aproximadamente 87,7 mililitros.

Evalúe la pureza de la proteína a través de SDS-PAGE, y agrupe y concentre según sea necesario. Para configurar la matriz de placas multipocillos, primero prepare una solución de FKBP12 purificada de 100 nanomolares en el mismo tampón utilizado para la cromatografía de exclusión por tamaño. Sonicar y centrifugar con un centrifugado rápido de 13.000 rpm para evitar la formación de agregados.

Ahora, pipetee de 100 a 200 microlitros de la proteína diluida en una cámara de observación de ocho pocillos con un fondo de vidrio. Agregue el dimeriizador BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nanomolares. Como referencia, prepare una solución de mVenus de 100 nanomolares solo para evaluar los posibles efectos de agregación y precipitación y para recuperar un valor de brillo para el monómero con los mismos ajustes de adquisición.

Se puede utilizar cualquier sistema confocal de microscopio de barrido óptico equipado con detectores digitales o detectores analógicos bien caracterizados y capaces de mantener un tiempo de permanencia constante para cada píxel adquirido. Seleccione el objetivo de inmersión en agua de corrección de collar diseñado para la espectroscopia de correlación de fluorescencia. Ahora, agregue una gota de agua al objetivo de inmersión en agua de corrección del collar.

Monta la cámara de observación de ocho pozos en el escenario. Establezca la trayectoria del haz de excitación encendiendo el láser de 514 nanómetros y configurándolo a una potencia de 20 a 100 nanovatios a la salida del objetivo. Encienda un detector HyD.

Son preferibles los detectores capaces de contar fotones. Seleccione la ventana de emisión de 520 a 560 nanómetros. Para el modo de adquisición, use 16 por 16 píxeles.

Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de modo que el tiempo de fotograma sea más largo que la difusión de proteínas y el tiempo de permanencia de píxeles sea mucho más corto. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en aproximadamente 13 microsegundos para el sistema utilizado en esta demostración. Coloque el orificio en una unidad Airy para la emisión correspondiente de aproximadamente 545 nanómetros.

Seleccione el modo de adquisición de tiempo xy y seleccione el número de fotogramas que se adquirirán por adquisición y pozo. Ahora, establezca el tamaño de píxel en aproximadamente 120 nanómetros. Si el sistema está equipado con modo de alto rendimiento, introduzca las coordenadas de cada pozo y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso.

Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargue la solución BB y programe la perfusión para que comience justo después del fotograma 5.000 para evaluar la cinética de dimerización mientras adquiere 10.000 imágenes. Seleccione el pozo correcto y concéntrese en la solución. A continuación, inicie la adquisición y guarde la pila de imágenes resultante en formato TIFF.

Se adquirieron secuencias de 20.000 imágenes de FKBP12 mVenus purificado en solución de 100 nanómetros como se especifica en la sección de protocolo. La intensidad del primer fotograma se muestra junto con el perfil de intensidad media de la imagen sin tendencia. También se muestra el brillo sin y con filtrado suave.

Después de que se adquirieron 10.000 marcos, se agregó el fármaco homodimeriizador BB a la solución mientras se adquiría. Se analizó cada serie consecutiva de 5.000 fotogramas. El brillo medio cinco minutos después de la adición de BB fue de 1,010, lo que supone un aumento del doble, lo que indica un dímero FKBP12.

La cinética del proceso muestra un retraso entre la adición de BB y la dimerización completa de FKBP12 de aproximadamente dos minutos. Un aspecto clave para evaluar las interacciones proteína-proteína in vitro es la producción y purificación de la proteína marcada. Asegúrese de tener pequeñas cantidades de la proteína etiquetada de interés y de que su proteína no se agregue según su análisis.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la resonancia de plasmón de superficie o la espectroscopia de correlación de fluorescencia, para responder a preguntas adicionales, como las constantes de disociación o los coeficientes de difusión. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica exploraran en detalle las interacciones proteína-proteína en células vivas. No olvide que trabajar con reactivos para la purificación de proteínas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como gafas de seguridad, guantes, al realizar este procedimiento.