Name: Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a cuantificar la homo-oligomerización de proteínas in vitro sin calibración usando espectroscopía de fluctuación de fluorescencia. Este método accesible facilita el cribado de fármacos y el estudio de interacciones proteicas.

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Este trabajo ha sido apoyado por Wellcome Trust conceder 105278/Z/14/2 al R.N. El Wellcome Trust Centre para genética humana está financiado por Wellcome Trust base Premio 203852/Z/16/2. Trabajo en el grupo C.S. es financiado por Cancer Research UK (C20724/A14414) y el Consejo Europeo de investigación horizonte 2020 investigación y innovación programa de beca 647278 de la Unión Europea.

1. FKBP12 F36V - mVenus purificación
<ol><li>Transformar (DE3) pLysS células con el vector de pET22b con monomerized humana FKBP12F36V12 y N-terminal His6 y mVenus etiquetas (vector disponible a petición). Células de la placa en agar LB suplementado con 50 μg/mL de ampicilina y cloranfenicol de 34 μg/mL.</li>
	<li>Transferencia de colonias transformadas en cultura de arrancador 100 mL LB y crecer para 16-20 horas a 37 ° C con agitación.</li>
	<li>Diluir la cultura de arrancador denso (OD600 > 1) 1: 100 en medio LB (lotes de 2 x 500 mL) y crecer de 2 a 3 horas para OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 rpm).</li>
	<li>Culturas frescas en hielo. Inducir con 250 μm IPTG y crecer para 16-20 horas a 21 ° C, 200 rpm.</li>
	<li>Recoger las células por centrifugación a 2.000 x g durante 20 minutos.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 40 mL de tampón IMAC (20 mM fosfato de sodio pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazol de 3 mM, 1 mM β-mercaptoetanol) suplementado con los inhibidores de la proteasa libre de EDTA (1 tableta por pellets celulares).</li>
	<li>Someter a ultrasonidos células (amplitud de 500 w, 20 kHz, de 40%, 9 s el 11 s de 15 min) en el hielo y cosecha material soluble mediante centrifugación a 20.000 x g.</li>
	<li>Transferencia soluble lisado a un erlenmeyer y añadir 2 mL de resina (véase Tabla de materiales). Incubar por 1 hora con rotación rpm 105 Nota: Sepharose de níquel puede utilizarse también para este paso IMAC.</li>
	<li>Cosechar la resina y lavar con 250 mL de tampón IMAC A seguido por 500 mL de tampón de IMAC B (imidazol de 7 mM, 20 mM de fosfato de sodio pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoetanol). Nota: Aumentar a imidazol 50 mM si se utiliza resina de níquel sefarosa.</li>
	<li>Eluir la proteína His6 etiquetadas usando buffer IMAC C (20 mM fosfato de sodio pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazol de 300 mM, 1 mM β-mercaptoetanol).</li>
	<li>Inyectar en una exclusión de tamaño (véase Tabla de materiales) equilibra la columna en 10 mM HEPES de pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TDT. FKBP12F36V tiene su elución pico 87,71 ml en la columna que hemos utilizado.</li>
	<li>Evaluar la pureza mediante SDS-PAGE y piscina y se concentran según sea necesario.</li>
</ol>2. preparación de pocillos de la placa matriz
<ol><li>Descongelar el FKBP12F36V purificada (o etiquetado proteína de interés) de-80 ° C.</li>
	<li>Preparar una solución de 100 nM purificada FKBP12F36V (medio, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TDT). Someter a ultrasonidos y centrifugue (vuelta rápida de 13.000 rpm) para evitar la formación de agregados.</li>
	<li>Pipetear 100-200 μL en una cámara de observación bien 8 con fondo de vidrio.</li>
	<li>Añadir el dimerizer de BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nM12,13.</li>
	<li>Como referencia, prepare una solución de 100 nM de mVenus solo para evaluar posibles efectos agregación y precipitación y recuperar un valor de brillo para el monómero con la misma configuración de la adquisición.</li>
</ol>3. calibración-libre Confocal adquisición
<ol><li>Inicie el sistema confocal (figura 1). Cualquier luz microscopio sistema confocal de exploración equipado con detectores digitales o bien caracterizado detectores analógicos8y capaz de mantener un tiempo constante para cada pixel adquirida podría funcionar.</li>
	<li>Establecer la ruta del haz de excitación:<ol>
<li>Encienda el 514 nm láser y en 20-100 nW de potencia en la salida del objetivo (FKBP12F36V-mVenus).</li>
		<li>Seleccione el objetivo 63X1.4NA o un objetivo de inmersión de agua corrección collar diseñado para FCS.</li>
		<li>Encienda uno hidráulico, APD o detector PMT calibrado. Detectores capaces de recuento de fotones son preferibles, como en este caso, el cálculo de S, de0offset y σ2 son innecesarias.</li>
		<li>Seleccione la ventana de emisión de 520-560 nm</li>
		<li>Coloque el agujero de alfiler en 1 unidad aireada para la correspondiente emisión ~ 545 nm.</li>
		<li>Establecer el modo de adquisición a 16 x 16 píxeles</li>
		<li>Establece el pixel detención tiempo tMoran que satisface tmarco >> TD >> tMoran, donde D es el tiempo de residencia del difusor t de proteína y marco es la velocidad de fotogramas. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en μs ~ 13. Nota: Algunos fabricantes comerciales tenían escáneres que no se mantenían constante el tiempo de permanencia por píxel. Esta constancia es fundamental para el método de trabajo.</li>
		<li>Establecer el tamaño del pixel en ~ 120 nm.</li>
		<li>Seleccione el modo de adquisición xyt y seleccione el número de fotogramas que se adquirirá por adquisición y bien (por ejemplo 5.000).</li>
		<li>Si el sistema está equipado con el modo de alto rendimiento, introducir las coordenadas de cada bien y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso. Nota: Tenga cuidado de asegurar la presencia de un dispensador de agua para si se utiliza un objetivo de inmersión.</li>
		<li>Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargar la solución BB y programa la perfusión después de derecho 5000th marco para evaluar la cinética de dimerización mientras adquiere por ejemplo, 10.000 imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir una gota de aceite en el objetivo de inmersión de aceite / agua utilizando un objetivo de inmersión de agua corrección collar diseñado para FCS.</li>
	<li>Monte la cámara de observación bien 8 dentro de la etapa.</li>
	<li>Seleccione el bien correcto y centrarse en la solución. Nota: Importante: evitar centrarse cerca el vidrio inferior para evitar la reflexión y dispersión. Al centrarse más en la solución, desconecte la opción de enfoque automático.</li>
	<li>Iniciar la adquisición y guarde la pila resultante de imágenes en formato TIFF.</li>
</ol>4. detrend y análisis de brillo con el paquete R nandb
<ol><li>Como una verificación de calidad preprocesamiento, utilizar ImageJ14 para echar un vistazo a las imágenes y recuperar el perfil de intensidad, como se muestra en la figura 2un. Esto es útil para determinar si se ha producido demasiado fotoblanqueo. Si hay demasiado del blanqueo, los datos no son adecuados para su posterior análisis. Nota: ImageJ puede también ser útil para convertir imágenes en TIFF de formatos comerciales. El software nandb que se describe a continuación sólo puede trabajar con archivos TIFF.</li>
	<li>Descargar e instalar R y RStudio15,16. Es mejor descargar e instalar R primero, luego el RStudio. Nota: Lo que sigue es una descripción de cómo utilizar el paquete nandb R. Conocimiento de la lengua R no es necesario utilizar nandb, sin embargo hará la vida más fácil.</li>
	<li>Instale el paquete nandb.<ol>
<li>RStudio de abrir en la consola, escriba install.packages("nandb") y esperar para la instalación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conocer nandb<ol>
<li>Revisar el manual17.</li>
		<li>Revisar la ayuda para varias funciones RStudio. La función más probable ser utilizado será será brightness(). ¿Ver el archivo de ayuda para esta función escribiendo? Brightness() en la consola.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular el brillo<ol>
<li>Dicen que uno tiene un archivo de imagen en el escritorio llamado img001.tif (nota que 'nandb' sólo funciona con archivos TIFF). Se puede calcular el brillo de la imagen: b <-brillo ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")<ol>
<li>Esto asigna el brillo de la imagen a la variable b en R. El tau = "auto" asegura que la imagen es detrended correctamente antes de cálculo del brillo. Lo más común aquí es calcular la media o mediana luminosidad de la imagen. Uno puede hacerlo escribiendo a mean(b) o median(b). También se puede escribir la imagen de brillo para el uso de escritorio ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dicen que uno tiene la carpeta llena de imágenes images_folder en el escritorio y uno necesita calcular los brillos de las imágenes y escribir las imágenes de brillo como archivos TIFF. Ver? brightness_folder(). Esta función procesa toda la carpeta a la vez: brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto") Esto es especialmente bueno para aquellos que tienen un software prefieren R, porque todos los archivos se procesan en un solo comando, y luego uno puede seguir trabajando con las imágenes TIFF brillo en el software elegido, ya sea de ImageJ14 , Python u otra cosa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+fluorescence+lifetime+correlation+spectroscopy+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell.</a> Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Tramier, M., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+imaging+microscopy+for+homo-FRET+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).</li>
<li>Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein+aggregation+and+interaction+in+live+cells%3A+A+guide+to+number+and+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness.</a> Methods. , (2017).</li>
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<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. , (2017).</li>
<li>Hur, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Brightness+from+Living+Cells+in+the+Presence+of+Photodepletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).</li>
<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
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<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

N & B es una técnica para detectar multimerization luz comercial exploración confocal microscopio equipado con detectores digitales. Este enfoque es bastante atractivo en comparación con único punto FCS, FCCS y smFRET porque es libre de calibración y el cálculo de brillo es sencillo y concentración independiente6. Es de gran importancia, sin embargo, para corregir las fluctuaciones de intensidad de blanqueo y a largo plazo antes de realizar cálculos de brillo9; un ligero in...

Proteínas interacciones n Vitro
Tradicionalmente, la cristalografía y resonancia magnética nuclear experimentos combinados con microscopia del cryo-electrón (cryoEM) son las tecnologías elegidas para describir con precisión la arquitectura tridimensional de las proteínas y deducir su función por escudriñando sus detalles estructurales de alta resolución. Proteínas, sin embargo, no son estructuras estáticas y pueden experimentar una variedad de cambios conformacionales y vibraciones en el tiempo y el espacio. Por esta razón estructural información cristalográfica o CryoEM datos deben complementarse con otras técnicas (por ejemplo, simulaciones de dinámica molecular y técnicas de la sola molécula): la función de una proteína está relacionada con su conformacional cambios y las interacciones y esta información no está presente en una estructura estática. Con el fin de la punta de prueba dinámica intra moleculares, técnicas basadas en la sola molécula Forster transferencia de energía de resonancia (smFRET) son muy eficaz1. Estos enfoques son capaces de evaluar diversas subpoblaciones de moléculas en medios complejos. Esto es muy importante, estos cambios son rápidos y se producen durante la adquisición de los datos (es decir, nanosegundo a segundo rango).
Dos enfoques principales se emplean comúnmente para detectar y cuantificar estos cambios: las proteínas en solución y superficie-inmovilización. Para la detección de interacciones inter moleculares y en particular, el proceso de dimerización inducida por ligandos, smFRET no siempre es la mejor herramienta. De hecho, traste depende no sólo de la distancia (≈10 nm) sino también en la orientación de los dos dipolos (donador y aceptor, χ2) y la superposición de la emisión del donador con espectros de absorción2 del aceptador, pero tal vez esta última condición es menos importante siempre que el experimentador puede eligió el par derecho de traste. Una desventaja particular de smFRET para sondeo homo-dimerización proviene el etiquetado de la proteína de interés: para hetero smFRET, dimerización sólo puede ser detectado hasta un 50% (hetero-traste, es decir, sólo será capaz de detectar aceptador de donantes y donante receptor homo-dímeros no donante donante o de aceptador-aceptor, que es el otro 50% de los dímeros). El uso de la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) y derivados (FCCS, etc.3) para determinar proteína constantes de difusión y enlace constantes en vitro es otra alternativa. Estos enfoques no son capaces de cuantificar plenamente homo-dimerización o, como en el coeficiente de concentración y difusión y el radio y la difusión de medidas FCS uno de una partícula difusión dependen muy mal el peso molecular; por ejemplo un aumento de 10 veces el peso molecular sólo implica un cambio de 2.15 veces el coeficiente de difusión4. En el caso de dos colores FCS o FCCS, sólo el 50% de homo dímeros se verá por la misma razón que el anterior. Enfoques más prácticos y cuantitativos para detectar homo-dimerización en vitro e in vivo son homo-traste5 y el número y el brillo (N &amp; B)6. Teniendo en cuenta el hecho de que homo-FRET requiere recuperación de instrumentación específica del valor de anisotropía (es decir, elementos/analizadores ópticos para recuperar la polarización paralela y perpendicular), N &amp; B se presentaron aquí como una técnica favorable para detectar proteínas homo-dimerización y agregación. Puede ser empleado tanto en vitro como en vivo con un establecimiento comercial.
Número y brillo
N &amp; B ha sido recientemente ha7. Esa revisión se centró en la aplicación de la técnica en células vivas. Vale la pena reproducir el formalismo matemático aquí como estas ecuaciones se aplicará a los datos recogidos in vitro. En primer lugar, es necesario definir algunos términos y cantidades matemáticas:
<ul><li>Una entidad es un conjunto de moléculas que están limitados juntos.</li>
	<li>El ε del brillo de una entidad es el número de fotones emite por unidad de tiempo (por marco).</li>
	<li>
n es el número de entidades presentes.</li>
	<li>De un determinado píxel a lo largo de una serie de imágenes, &lt; i &gt; es su media intensidad y σ2 la variación en su intensidad.</li>
</ul>Luego, con el conteo de fotones detectores y asumiendo las entidades móviles y sin fondo,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
donde N es el número aparente y B es el brillo aparente. Esto se traduce en
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Dalal et al. 8 demostraron que con equipo análogo, uno necesita tres términos de corrección: el factor S, el fondo offsety el ruido de lectura σ02. Luego, otra vez asumiendo las entidades móviles,
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
dando
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
Tenga en cuenta que la ecuación antedicha para es diferente que en Dalal et al. 8 y una revisión posterior. 7 de Dalal et al. S en el denominador fue omitido debido a un error y este error se reprodujo en la revisión. La ecuación anterior es la correcta. Instrucciones para medir S, offset y σ02 - junto con una explicación de su significado - son dadas por Dalal et al. 8
El ε del brillo es proporcional al estado oligomérico de las entidades de difusión: ε será dos veces tan grande para dímeros como para monómeros, tres veces tan grandes para trimers como para monómeros, dos veces tan grandes para hexamers como para trimers y así sucesivamente. De esta manera, medir el ε de brillo, uno puede cuantificar cualquier tipo de multimerization.
Si hay una mezcla de los Estados presentes, número y el brillo no es capaz de recuperar los Estados presentes. Esto es una limitación de la técnica.
Detrend software algoritmo y nandb
La importancia de la corrección de fotoblanqueo ha subrayó previamente9. Fotoblanqueo se produce inevitablemente durante experimentos de microscopía de luz en el modo time-lapse; tanto en células vivas y en vitro. Muchos enfoques se han descrito en la literatura para corregir para el blanqueo de7. La técnica de filtrado exponencial con elección automática de robustos parámetro T es el mejor actual. Está integrado en el software libre de código abierto nandb9. De hecho, software que requiere el usuario seleccionar manualmente los parámetros robustos puede conducir a resultados incorrectos debido a la elección de este parámetro será arbitrario e incorrecto. El algoritmo automático inspecciona los datos y determina el parámetro, sin necesidad de intervención de usuario9. Incluso con la mejor opción del parámetro de suavizado, robustos tienen sus limitaciones y funciona bien sólo con porcentajes de fotoblanqueo inferiores al 25%, como se muestra con simulaciones9. Curiosamente, cuando se utiliza la rutina robustos automática, su exactitud es tal que uno puede trabajar con valores de brillo bajo (incluso B &lt; 1.01) y por lo tanto, de baja intensidad y siendo preciso cuantificar homo-dimerización.
Fotoblanqueo también causa otro problema: la presencia de fluoróforos photobleached en un complejo de multimer. Esto hace que por ejemplo, un trímero aparecen como un dímero cuando una de las tres unidades en el trímero es no fluorescente. Hur y Mueller10 demostraron cómo corregir para esto y esta corrección también se destacó en un informe posterior7. El software nandb incluye corrección9.
La FKBP12 F36V sistema de
FKBP12F36V es una proteína que naturalmente no oligomerize pero se sabe que dimerizan con la adición del fármaco (conocido coloquialmente como el BB dimerizing ligando) AP2018711,12. Esto hace que sea un caso de prueba ideal para número y brillo: con FKBP12F36V, una duplicación de los Estado debe observarse sobre adición de BB.

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) células pLysS</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID de la sustancia 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID de la sustancia: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB cultivo iniciador</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medio</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Identificación de sustancias 329815691</td><td></td></tr><tr><td>tampón IMAC</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de proteasa sin EDTA&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>resina TALON</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Níquel sefarosa</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 columna</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fondo de cristal plato de observación de 8 pocillos</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

calibración-libre in vitro cuantificación de proteína homo-oligomerización utilizando instrumentación comercial y software de análisis de brillo libre de código abierto

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Número y el brillo es una técnica de espectroscopia (FFS) de fluctuación libre de calibración de la fluorescencia para la detección de proteína homo-Oligomerización. Pueden emplearse utilizando un microscopio confocal convencional equipado con detectores digitales. Un protocolo para el uso de la técnica de vitro se muestra por medio de un caso de uso donde se observan número y brillo para cuantificar con precisión el estado oligomérico de FKBP12F36V etiqueta de mVenus antes y después de la adición de la droga dimerizing AP20187. Se discuten la importancia de utilizar los parámetros de adquisición microscopio correctos y los métodos de preprocesamiento y análisis de datos correctos. En particular, se destacó la importancia de la opción de corrección de fotoblanqueo. Este método de bajo costo puede ser empleada para estudiar las interacciones de la proteína-proteína en muchos contextos biológicos.

Robustos y monomérico brillo
Una vez se ha adquirido los datos, uno puede iniciar los cálculos de brillo para determinar el estado oligomérico de la proteína de interés en la solución. Aunque el efecto de blanqueamiento en la solución no puede ser tan drástico como lo puede ser en vivo, el rastro de intensidad todavía probablemente no tendrá medio estacionario, posiblemente debido a los efectos de fotof...

Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificación de proteína homo-Oligomerización en vitro basado en la espectroscopia de fluorescencia de fluctuación comercial luz microscopia. Se muestran los métodos de análisis y configuración correcta adquisición.

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cribado de fármacos, como la dilucidación del efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en concentraciones muy bajas para las interacciones proteína-proteína. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere calibración, se puede implementar en cualquier microscopio confocal y utiliza cantidades muy pequeñas de proteínas marcadas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de fármacos contra el cáncer, inhibidores de moléculas pequeñas y diversos inhibidores de fusión, ya que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones proteína-proteína.Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones y agregaciones de proteínas in vitro, también se puede aplicar a otros sistemas, como la dinámica de proteínas de células vivas y las interacciones célula-célula. Para empezar, transforme las células pLysS con un vector pET-22b que contenga FKBP12 humano monomerizado y etiquetas N-terminal His6 y mVenus. Después de que las células se hayan recuperado de la incubación y el choque térmico, colóquelas en agar LB suplementado con antibióticos.Transfiera las colonias transformadas a un cultivo iniciador de LB de 100 mililitros y crezca durante 16 a 20 horas a 37 grados centígrados con agitación. Después de la incubación, diluya el cultivo iniciador denso de uno a 100 en medio LB en dos lotes de 500 mililitros. Luego, crezca durante dos o tres horas hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,6 a 0,8.Después de enfriar los cultivos en hielo, induzca la producción de proteínas con IPTG de 250 micromolares. Cultive los cultivos durante 16 a 20 horas a 21 grados centígrados y 200 rpm. A continuación, recoja las células por centrifugación a 2.000 g durante 20 minutos.Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mililitros de tampón A IMAC suplementado con inhibidores de la proteasa sin EDTA. Ahora, sonique las celdas a 500 vatios, 20 kilohercios y 40% de amplitud a nueve segundos encendido, 11 segundos apagados durante 15 minutos en hielo. Tras la sonicación, se recolecta el material soluble por centrifugación a 20.000 g durante una hora a cuatro grados centígrados.Transfiera el lisado soluble a un matraz cónico y agregue dos mililitros de resina TALON. Deje que la suspensión se incube durante una hora con una rotación de 105 rpm. Ahora, coseche la resina y lávela con 250 mililitros de tampón IMAC A seguidos de 500 mililitros de tampón IMAC B. Elute la proteína marcada con His6 utilizando el tampón IMAC C. Inyecte el eluido en una columna de exclusión de tamaño preequilibrada y recoja el pico FKBP12, que eluye a aproximadamente 87,7 mililitros.Evalúe la pureza de la proteína a través de SDS-PAGE, y agrupe y concentre según sea necesario. Para configurar la matriz de placas multipocillos, primero prepare una solución de FKBP12 purificada de 100 nanomolares en el mismo tampón utilizado para la cromatografía de exclusión por tamaño. Sonicar y centrifugar con un centrifugado rápido de 13.000 rpm para evitar la formación de agregados.Ahora, pipetee de 100 a 200 microlitros de la proteína diluida en una cámara de observación de ocho pocillos con un fondo de vidrio. Agregue el dimeriizador BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nanomolares. Como referencia, prepare una solución de mVenus de 100 nanomolares solo para evaluar los posibles efectos de agregación y precipitación y para recuperar un valor de brillo para el monómero con los mismos ajustes de adquisición.Se puede utilizar cualquier sistema confocal de microscopio de barrido óptico equipado con detectores digitales o detectores analógicos bien caracterizados y capaces de mantener un tiempo de permanencia constante para cada píxel adquirido. Seleccione el objetivo de inmersión en agua de corrección de collar diseñado para la espectroscopia de correlación de fluorescencia. Ahora, agregue una gota de agua al objetivo de inmersión en agua de corrección del collar.Monta la cámara de observación de ocho pozos en el escenario. Establezca la trayectoria del haz de excitación encendiendo el láser de 514 nanómetros y configurándolo a una potencia de 20 a 100 nanovatios a la salida del objetivo. Encienda un detector HyD.Son preferibles los detectores capaces de contar fotones. Seleccione la ventana de emisión de 520 a 560 nanómetros. Para el modo de adquisición, use 16 por 16 píxeles.Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de modo que el tiempo de fotograma sea más largo que la difusión de proteínas y el tiempo de permanencia de píxeles sea mucho más corto. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en aproximadamente 13 microsegundos para el sistema utilizado en esta demostración. Coloque el orificio en una unidad Airy para la emisión correspondiente de aproximadamente 545 nanómetros.Seleccione el modo de adquisición de tiempo xy y seleccione el número de fotogramas que se adquirirán por adquisición y pozo. Ahora, establezca el tamaño de píxel en aproximadamente 120 nanómetros. Si el sistema está equipado con modo de alto rendimiento, introduzca las coordenadas de cada pozo y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso.Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargue la solución BB y programe la perfusión para que comience justo después del fotograma 5.000 para evaluar la cinética de dimerización mientras adquiere 10.000 imágenes. Seleccione el pozo correcto y concéntrese en la solución. A continuación, inicie la adquisición y guarde la pila de imágenes resultante en formato TIFF.Se adquirieron secuencias de 20.000 imágenes de FKBP12 mVenus purificado en solución de 100 nanómetros como se especifica en la sección de protocolo. La intensidad del primer fotograma se muestra junto con el perfil de intensidad media de la imagen sin tendencia. También se muestra el brillo sin y con filtrado suave.Después de que se adquirieron 10.000 marcos, se agregó el fármaco homodimeriizador BB a la solución mientras se adquiría. Se analizó cada serie consecutiva de 5.000 fotogramas. El brillo medio cinco minutos después de la adición de BB fue de 1,010, lo que supone un aumento del doble, lo que indica un dímero FKBP12.La cinética del proceso muestra un retraso entre la adición de BB y la dimerización completa de FKBP12 de aproximadamente dos minutos. Un aspecto clave para evaluar las interacciones proteína-proteína in vitro es la producción y purificación de la proteína marcada. Asegúrese de tener pequeñas cantidades de la proteína etiquetada de interés y de que su proteína no se agregue según su análisis.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la resonancia de plasmón de superficie o la espectroscopia de correlación de fluorescencia, para responder a preguntas adicionales, como las constantes de disociación o los coeficientes de difusión. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica exploraran en detalle las interacciones proteína-proteína en células vivas. No olvide que trabajar con reactivos para la purificación de proteínas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como gafas de seguridad, guantes, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

Este video demuestra la técnica de espectroscopia de fluctuación de fluorescencia (FFS) para estudiar la homo-oligomerización de proteínas. Las proteínas marcadas con fluorescencia en una muestra se dimerizan con un agente cuando se estudia la oligomerización de proteínas con FFS. Utilizando un microscopio confocal, a medida que las proteínas entran y salen del pequeño volumen de observación, se realiza el análisis de las fluctuaciones en el brillo de las moléculas fluorescentes para determinar...

Espectroscopía de fluctuación de fluorescencia para estudiar la homooligomerización de proteínas

Aquí reportamos protocolos para detectar proteínas endógenas y exógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas y cuantificar estos niveles de proteínas en centrómeros-cinetocoros mediante tinción inmunofluorescente indirecta mediante el uso de fijación (fijación de paraformaldehído, acetona o metanol).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos smFRET tricolor y su análisis con un conjunto 3D modelo de Markov ocultos. Con este enfoque, los científicos pueden extraer información cinética de sistemas complejos de la proteína, incluyendo cooperatividad o interacción correlacionadas.

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Describimos un enfoque de imagen para la determinación del estado oligomérico promedio de los oligómeros receptores etiquetados con mEGFP inducidos por la unión de ligandos en la membrana plasmática de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&amp;B).

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN).  Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Este protocolo combina la fotometría de masas con un novedoso sistema de microfluídica para investigar las interacciones proteína-proteína de baja afinidad. Este enfoque se basa en la dilución rápida de complejos altamente concentrados en solución, lo que permite mediciones de baja afinidad y amplía la aplicabilidad de la fotometría masiva.

Análisis de la formación de complejos proteicos a concentraciones micromolares mediante el acoplamiento de microfluídica con fotometría de masas

Aprende a cuantificar la homo-oligomerización de proteínas in vitro sin calibración usando espectroscopía de fluctuación de fluorescencia. Este método accesible facilita el cribado de fármacos y el estudio de interacciones proteicas.

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto (Video) | JoVE Journal

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