Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto
17 de julio de 2018
Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificación de proteína homo-Oligomerización en vitro basado en la espectroscopia de fluorescencia de fluctuación comercial luz microscopia. Se muestran los métodos de análisis y configuración correcta adquisición.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cribado de fármacos, como la dilucidación del efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en concentraciones muy bajas para las interacciones proteína-proteína. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere calibración, se puede implementar en cualquier microscopio confocal y utiliza cantidades muy pequeñas de proteínas marcadas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de fármacos contra el cáncer, inhibidores de moléculas pequeñas y diversos inhibidores de fusión, ya que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones proteína-proteína.
Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones y agregaciones de proteínas in vitro, también se puede aplicar a otros sistemas, como la dinámica de proteínas de células vivas y las interacciones célula-célula. Para empezar, transforme las células pLysS con un vector pET-22b que contenga FKBP12 humano monomerizado y etiquetas N-terminal His6 y mVenus. Después de que las células se hayan recuperado de la incubación y el choque térmico, colóquelas en agar LB suplementado con antibióticos.
Transfiera las colonias transformadas a un cultivo iniciador de LB de 100 mililitros y crezca durante 16 a 20 horas a 37 grados centígrados con agitación. Después de la incubación, diluya el cultivo iniciador denso de uno a 100 en medio LB en dos lotes de 500 mililitros. Luego, crezca durante dos o tres horas hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,6 a 0,8.
Después de enfriar los cultivos en hielo, induzca la producción de proteínas con IPTG de 250 micromolares. Cultive los cultivos durante 16 a 20 horas a 21 grados centígrados y 200 rpm. A continuación, recoja las células por centrifugación a 2.000 g durante 20 minutos.
Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mililitros de tampón A IMAC suplementado con inhibidores de la proteasa sin EDTA. Ahora, sonique las celdas a 500 vatios, 20 kilohercios y 40% de amplitud a nueve segundos encendido, 11 segundos apagados durante 15 minutos en hielo. Tras la sonicación, se recolecta el material soluble por centrifugación a 20.000 g durante una hora a cuatro grados centígrados.
Transfiera el lisado soluble a un matraz cónico y agregue dos mililitros de resina TALON. Deje que la suspensión se incube durante una hora con una rotación de 105 rpm. Ahora, coseche la resina y lávela con 250 mililitros de tampón IMAC A seguidos de 500 mililitros de tampón IMAC B. Elute la proteína marcada con His6 utilizando el tampón IMAC C. Inyecte el eluido en una columna de exclusión de tamaño preequilibrada y recoja el pico FKBP12, que eluye a aproximadamente 87,7 mililitros.
Evalúe la pureza de la proteína a través de SDS-PAGE, y agrupe y concentre según sea necesario. Para configurar la matriz de placas multipocillos, primero prepare una solución de FKBP12 purificada de 100 nanomolares en el mismo tampón utilizado para la cromatografía de exclusión por tamaño. Sonicar y centrifugar con un centrifugado rápido de 13.000 rpm para evitar la formación de agregados.
Ahora, pipetee de 100 a 200 microlitros de la proteína diluida en una cámara de observación de ocho pocillos con un fondo de vidrio. Agregue el dimeriizador BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nanomolares. Como referencia, prepare una solución de mVenus de 100 nanomolares solo para evaluar los posibles efectos de agregación y precipitación y para recuperar un valor de brillo para el monómero con los mismos ajustes de adquisición.
Se puede utilizar cualquier sistema confocal de microscopio de barrido óptico equipado con detectores digitales o detectores analógicos bien caracterizados y capaces de mantener un tiempo de permanencia constante para cada píxel adquirido. Seleccione el objetivo de inmersión en agua de corrección de collar diseñado para la espectroscopia de correlación de fluorescencia. Ahora, agregue una gota de agua al objetivo de inmersión en agua de corrección del collar.
Monta la cámara de observación de ocho pozos en el escenario. Establezca la trayectoria del haz de excitación encendiendo el láser de 514 nanómetros y configurándolo a una potencia de 20 a 100 nanovatios a la salida del objetivo. Encienda un detector HyD.
Son preferibles los detectores capaces de contar fotones. Seleccione la ventana de emisión de 520 a 560 nanómetros. Para el modo de adquisición, use 16 por 16 píxeles.
Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de modo que el tiempo de fotograma sea más largo que la difusión de proteínas y el tiempo de permanencia de píxeles sea mucho más corto. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en aproximadamente 13 microsegundos para el sistema utilizado en esta demostración. Coloque el orificio en una unidad Airy para la emisión correspondiente de aproximadamente 545 nanómetros.
Seleccione el modo de adquisición de tiempo xy y seleccione el número de fotogramas que se adquirirán por adquisición y pozo. Ahora, establezca el tamaño de píxel en aproximadamente 120 nanómetros. Si el sistema está equipado con modo de alto rendimiento, introduzca las coordenadas de cada pozo y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso.
Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargue la solución BB y programe la perfusión para que comience justo después del fotograma 5.000 para evaluar la cinética de dimerización mientras adquiere 10.000 imágenes. Seleccione el pozo correcto y concéntrese en la solución. A continuación, inicie la adquisición y guarde la pila de imágenes resultante en formato TIFF.
Se adquirieron secuencias de 20.000 imágenes de FKBP12 mVenus purificado en solución de 100 nanómetros como se especifica en la sección de protocolo. La intensidad del primer fotograma se muestra junto con el perfil de intensidad media de la imagen sin tendencia. También se muestra el brillo sin y con filtrado suave.
Después de que se adquirieron 10.000 marcos, se agregó el fármaco homodimeriizador BB a la solución mientras se adquiría. Se analizó cada serie consecutiva de 5.000 fotogramas. El brillo medio cinco minutos después de la adición de BB fue de 1,010, lo que supone un aumento del doble, lo que indica un dímero FKBP12.
La cinética del proceso muestra un retraso entre la adición de BB y la dimerización completa de FKBP12 de aproximadamente dos minutos. Un aspecto clave para evaluar las interacciones proteína-proteína in vitro es la producción y purificación de la proteína marcada. Asegúrese de tener pequeñas cantidades de la proteína etiquetada de interés y de que su proteína no se agregue según su análisis.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la resonancia de plasmón de superficie o la espectroscopia de correlación de fluorescencia, para responder a preguntas adicionales, como las constantes de disociación o los coeficientes de difusión. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica exploraran en detalle las interacciones proteína-proteína en células vivas. No olvide que trabajar con reactivos para la purificación de proteínas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como gafas de seguridad, guantes, al realizar este procedimiento.
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Resumen
Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificar la homo-oligomerización de proteínas in vitro mediante espectroscopía de fluctuaciones de fluorescencia. Destaca los ajustes correctos de adquisición y los métodos de análisis para una implementación eficaz.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Interacciones proteicas
- Espectroscopía de fluorescencia
Antecedentes
- Comprender las interacciones entre proteínas es fundamental en el desarrollo de fármacos.
- Los inhibidores de moléculas pequeñas pueden afectar las interacciones proteicas a bajas concentraciones.
- Esta técnica es aplicable a diversos sistemas, incluyendo la dinámica en células vivas.
- Los métodos libres de calibración permiten una accesibilidad más amplia en entornos de investigación.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método para cuantificar la homo-oligomerización de proteínas.
- Facilitar la selección de fármacos mediante la elucidación de interacciones proteicas.
- Permitir el uso de cantidades mínimas de proteínas marcadas en experimentos.
Métodos Utilizados
- Espectroscopía de fluctuaciones de fluorescencia con microscopía de barrido de luz comercial.
- Transformación de células pLysS con un vector pET-22b.
- Recuperación y siembra de células en agar LB con antibióticos.
- Análisis de interacciones y agregaciones proteicas in vitro.
Resultados principales
- El método proporciona información cuantitativa sobre las interacciones proteicas.
- Demuestra eficacia en el estudio de concentraciones bajas de proteínas.
- Sus aplicaciones se extienden al desarrollo de fármacos contra el cáncer y a inhibidores de fusión.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar futuras investigaciones sobre la dinámica de las proteínas.
Conclusiones
- Esta técnica sin calibración es una herramienta valiosa para los investigadores.
- Mejora la comprensión de las interacciones proteicas en la selección de fármacos.
- El método es versátil y puede adaptarse a diversas configuraciones experimentales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis de número y brillo independiente de calibración permite la evaluación cuantitativa y reproducible de la homo-oligomerización de proteínas mediante microscopía confocal estándar y software de código abierto. Este enfoque satisface una necesidad crítica de cuantificación robusta y de bajo requerimiento de muestra para las interacciones proteína-proteína en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos y en la desestimación mecanicista de riesgos. Su accesibilidad y rigor cuantitativo apoyan una validación confiable de dianas terapéuticas y la selección de carteras en la industria biofarmacéutica.&D.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la cuantificación directa de los estados de homo-oligomerización de proteínas sin necesidad de estándares de calibración.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al revelar los efectos de moléculas pequeñas en las interacciones proteína-proteína a bajas concentraciones.
- Facilita la validación funcional del blanco al distinguir las formas monoméricas y oligoméricas in vitro.
- Proporciona datos cuantitativos para orientar las decisiones de avance o interrupción en la selección de blancos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara ensayos validados de interacciones proteicas para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles adecuados para la estandarización de ensayos y la reutilización de plataformas.
- Permite la evaluación confiable de los cambios inducidos por compuestos en la oligomerización proteica.
- Reduce el tiempo de desarrollo del ensayo aprovechando instrumentación comercial y herramientas de análisis de código abierto.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Apoya la continuidad desde estudios mecanicistas in vitro hasta el análisis de interacciones proteicas en células vivas.
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al cuantificar estados de interacción relevantes para los mecanismos de enfermedad.
- Proporciona una base para el avance ajustado al riesgo hacia la validación preclínica de moduladores de interacciones proteicas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos activos, permitiendo la interrogación basada en hipótesis de las interacciones proteicas y apoyando el cribado posterior y la investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: El análisis cuantitativo de brillo aclara los mecanismos de interacción de proteínas y reduce los riesgos asociados a las hipótesis sobre dianas.
- Tamizaje: La reproducibilidad del ensayo y sus resultados cuantitativos facilitan el cribado de compuestos y el análisis comparativo.
- Análisis: Proporciona mediciones estadísticas robustas de los estados de oligomerización para comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Permite alinear los hallazgos in vitro con biomarcadores de interacción de proteínas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: El método es ampliamente aplicable a distintas dianas proteicas y adaptable a diversos sistemas biológicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Estandariza la cuantificación de interacciones proteicas utilizando instrumentación y software accesibles.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos sólidos en etapas tempranas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de objetivos de interacción proteica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal y análisis de fluctuaciones de fluorescencia.
- Necesita acceso a microscopios confocales equipados con detectores digitales y software de análisis de código abierto.
- Exige un control riguroso de los parámetros de adquisición y la corrección del fotoblanqueo para lograr reproducibilidad.
- Adaptable a diversos sistemas de proteínas, pero depende de proteínas marcadas de alta calidad y no agregantes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad ante la agregación de proteínas y la necesidad de un procesamiento cuidadoso de los datos previo al análisis.
