Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

La osteoartritis es uno de los trastornos debilitantes más comunes entre la población de edad avanzada. En la actualidad, no existe una cura definitiva para las causas subyacentes de la osteoartritis. Este protocolo clínico describe un procedimiento innovador para un tratamiento prometedor, mínimamente invasivo, y alternativo de la osteoartritis de rodilla humana mediante la regeneración del cartílago como el tejido.

La osteoartritis es uno de los trastornos debilitantes más comunes entre la población de edad avanzada. En la actualidad, no existe una cura definitiva para las causas de subrayado de la osteoartritis. Este protocolo clínico es un procedimiento innovador para un tratamiento prometedor, mínimamente invasivo y alternativo de la osteoartritis de rodilla humana mediante la regeneración de tejido similar al cartílago.

Lleve al paciente a un quirófano con una capucha de clase A de riesgo biológico y colóquelo en una posición supina. Limpie la zona abdominal del paciente con 5%betadine-povidine yodo y cubra al paciente utilizando la técnica estéril, exponiendo la zona limpia del abdomen para la liposucción. Aproximadamente cinco centímetros infero-lateralmente del umbilicus, anestesia dos sitios, uno a la izquierda y otro en el lado derecho del umbilicus de la incisión que se va a hacer.

Usar dos mililitros de 2%lidocaína sin epinefrina con una aguja de 25 calibres de 1,5 pulgadas en una jeringa de cinco mililitros inyectando cada sitio a nivel epidérmico. Anestesice el lugar de la incisión que se realizará utilizando cinco mililitros de solución tumescente y jeringa de 10 mililitros y la aguja de 25 calibres 1,5 pulgadas. Haga dos incisiones de 0,5 centímetros aproximadamente cinco centímetros por debajo del umbilicus lateralmente pellizcando la piel para elevar la profundidad del nivel subcutáneo.

Usando una hoja número 11, ayuda a la piel elevada a penetrar a través del nivel subcutáneo pero no a penetrar a través de la pared abdominal. Mediante el uso de cánula calibre 20 centímetros y 60, anestesia el nivel subcutáneo de toda la zona inferior del abdomen que se va a liposuplicar con 700 a 800 mililitros de la solución tumescente. Después de terminar la infiltración de todo el abdomen inferior con solución tumescente, preparar un aparato de liposucción conectando una cánula de 3,0 milímetros conectada a una jeringa de 60 mililitros o 30 mililitros para liposucción manual o especialmente diseñada cánula de 3,0 milímetros conectada a un kit centrífugo.

Una jeringa de sistema cerrado desarrollada por nosotros mismos y aprobada por FDA CDRH con el propósito de mantener la esterilidad conectada a una máquina de vacío para liposucción asistida por vacío. Realizar liposucción para obtener 100 a 110 gramos de tejido adiposo excluyendo la solución tumescente. Al realizar la liposucción, se obtendrá tejido adiposo junto con solución tumescente, pero debe separarse y eliminarse.

Para separar primero la solución tumescente por gravedad, el tejido adiposo del kit de centrífuga puede transferirse a una jeringa de 60 mililitros y colocar la jeringa hacia abajo. Por ejemplo, la parte de apertura de la jeringa está en la parte inferior. Al esperar de cinco a seis minutos, se separará el tejido adiposo y la solución tumescente.

Retire el líquido de la parte inferior de la jeringa presionando en la parte superior del émbolo de la jeringa. Realice los pasos anteriores nueve a 11 hasta que se haya acumulado el total de 100 gramos a 110 gramos de lípido de tejido adiposo por rodilla. Después de separar la solución tumescente por gravedad y acumular de 50 gramos a 55 gramos de aspirado lipídico por cada sistema cerrado estéril del kit de centrífuga de 60 mililitros, coloque los dos kits de centrífuga en un cubo de recipiente centrífugo y gire a 1600 G durante cinco minutos, condensando el lípido y separando el líquido del tejido adiposo.

Este proceso condensa aún más el aspirado lipídico y puede producir aceite graso en ciertos casos. Tenga cuidado de no agitar, retire la tapa de seguridad y el enchufe en la parte inferior del kit de centrífuga. Retire el líquido inferior empujando lentamente hacia abajo en la parte superior del émbolo del kit de centrífuga.

En una jeringa separada de 60 mililitros, disuelva 10 miligramos de colagenasa, cinco miligramos de colagenasa específica para el tejido conectivo y cinco miligramos de colágeno específico para el tejido adiposo con 50 mililitros de solución salina normal. Mezclar aproximadamente 25 a 30 mililitros de lípido condensado con colágeno disuelto, cinco miligramos de colagenasa específica para el tejido conectivo, y cinco miligramos de colágeno específico para tejido adiposo en una proporción de uno a uno, volumen a volumen, conectando la jeringa de 60 mililitros a un kit centrífugo mediante el uso de un conector especializado. Mezclar a fondo para condensar el aspirado de preparación y la colagenasa empujando el contenido entre la jeringa de 60 mililitros y el kit de centrífugas utilizando una varilla o un empujador.

Transfiera la mezcla del aspirado lipídico y la colagenasa de vuelta a la jeringa de 60 mililitros. Conecte cada jeringa de 60 mililitros que contenga la mezcla con el homogeneizador de tejido que contiene cuchillas. Conecte una jeringa vacía de 60 mililitros al otro extremo del homogeneizador.

Empuje la mezcla a la otra jeringa de 60 mililitros a través del homogeneizador durante cuatro a seis veces, lo que resulta en el corte y la picadura del aspirador de lípidos. Transfiera el aspirado lipídico homogeneizado y la mezcla colagenosa de nuevo al kit de centrífuga de 60 mililitros a través de un conector especializado. Coloque los kits de centrífuga en un recipiente para colocar en una incubadora que haya sido precalentada a 37 grados centígrados.

Incubar los dos kits de centrífugas con la mezcla homogeneizada a 37 grados celsius durante 40 minutos mientras se gira a 45 rpm. Después de 40 minutos de incubación, retire el recipiente de la incubadora de forma estéril. A continuación, retire los kits de centrífuga y colóquelos en una máquina centrífuga.

Centrifugar las mezclas a 800 G durante cinco minutos para separar el SVF derivado del tejido adiposo. Después de la centrífuga, el sobrenadante, que incluye colagenasa y tejido adiposo digerido, se extrae de cada kit de centrífuga quitando la tapa de la jeringa en la parte superior del émbolo y colocando una jeringa de 30 mililitros en la abertura del émbolo a través de una conexión de bloqueo de jeringa. Presione lentamente hacia abajo en la parte del barril de la jeringa de 30 mililitros para que el sobrenadante se llene en la jeringa de 30 mililitros.

Presione hacia abajo el barril de la jeringa de 30 mililitros hasta los últimos tres a cuatro mililitros de la parte inferior del kit de centrífuga, dejando sólo los últimos tres a cuatro mililitros de SVF derivado del tejido adiposo. El sobrenadante es descarte. Retire la jeringa de 30 mililitros de la parte superior del émbolo y llene la jeringa con una solución de timbre lactado de 5% dextrosa, también conocida como D5LR.

Al fijar la jeringa de 30 mililitros llena de D5LR en la parte superior de la abertura del émbolo, llene los kits de centrífugas que contienen de tres a cuatro mililitros de SVF derivado del tejido adiposo con D5LR hasta 55 mililitros. A continuación, retire la jeringa de 30 mililitros, tape la abertura del émbolo y centrifugar de nuevo los kits de centrífuga a 300 G durante unos cuatro minutos. Repita los pasos del número 17 al número 21 para un total de cuatro lavados.

Después de la cuarta centrífuga, con el fin de obtener el SVF final para inyección, retire la tapa de seguridad y el enchufe en la abertura inferior del kit de centrífuga sin agitar o girar el kit de centrífuga. Conecte una jeringa de 20 mililitros a la abertura inferior del kit de centrífugas utilizando un conector especialmente diseñado. Tire del émbolo de la jeringa de 20 mililitros varias veces hacia adelante y hacia atrás para agitar las células que se han asentado en la parte inferior del kit de centrífuga.

Elimine el volumen total deseado del SVF que contiene tanto los AST como el ECM junto con otras células y tejidos. Por lo general, alrededor de tres a cuatro mililitros de cada kit de centrífuga para inyecciones de articulaciones de rodilla. Hicimos 30 mililitros de sangre autóloga junto con 2,5 mililitros de solución anticoagulante de dextrosa de citrato.

Luego, la sangre extraída fue transferida a los kits de barriles de centrífuga de 60 mililitros. Luego fue centrifugado a 730 de gravedad durante cinco minutos. Y el sobrenadante fue removido y puesto en un nuevo kit de barril centrífugo de 60 mililitros.

El sobrenadante fue centrifugado a 1350 de gravedad durante cuatro minutos, obteniendo 4,4 mililitros de PRP. Limpie la rodilla del paciente con 5%betadina y colótela de forma estéril. Palpa la parte anterior de la rodilla para el espacio articular entre los huesos tibiales y femorales.

Anestesiar el lugar de inyección superficialmente con lidocaína diluida, un mililitro de 1%lidocaína diluido con cuatro mililitros de solución salina normal, desde la piel hasta justo fuera de la cápsula articular. A continuación, anestesiar el interior de la cápsula articular con ropivacaína diluida, un mililitro 0,75% ropivacaína diluida con tres mililitros de solución salina normal. Mezclar dos mililitros de HA en el mililitro de SVF contenido en una jeringa de 20 mililitros a través de una jeringa para el conector de la jeringa.

Mediante el uso de una jeringa para el conector de la jeringa, añadir 0,4 mililitros de cloruro de calcio a los tres o cuatro mililitros de PRP autólogo que ya se ha preparado y estar listo en una jeringa de cinco mililitros. Combine de 3,5 a 4,5 mililitros de cloruro de calcio PRP en una jeringa de cinco mililitros con ocho a 10 mililitros de mezcla HA-SVF en una jeringa de 20 mililitros a través de una jeringa y un conector de jeringa. Inyecte inmediatamente la mezcla, de unos 12 a 15 mililitros, lentamente en la articulación tibial-femoral anterior de la rodilla, utilizando una aguja de calibre 38 milímetros de 18 milímetros con o sin la guía de ultrasonido.

Después de la inyección, venda el lugar de inyección a presión doblando la gasa de algodón 4x4 cuatro veces y colocando cintas sobre la gasa 4x4 plegada. Indique al paciente que permanezca inmóyo durante 60 minutos para permitir la fijación celular. Indique al paciente que limite las actividades por un mínimo de una semana después del alta de la clínica.

Vuelva a la clínica para tres inyecciones adicionales de PRP activadas por cloruro de calcio durante tres semanas. El paciente con OA en etapa tres recibió el tratamiento como se describe en la sección de protocolo. Después de la segunda semana de la inyección de mezcla ASV-ECM, el dolor y la ROM del paciente mejoraron.

Para la semana 16, el dolor y la ROM del paciente mejoraron significativamente más del 70%De la rmN de tratamiento posterior, tomada después de la semana 16, mostraron el mayor grosor del tejido similar al cartílago en el lado medial de la rodilla. Otro paciente con OA en etapa tres recibió el tratamiento como se describe en la sección de protocolo. Después de la segunda semana de la inyección de mezcla ASV-ECM, el dolor y la ROM del paciente mejoraron.

Para la semana 18, el dolor y rom mejoraron significativamente a 80%Rmn repetida tomada después de la semana 18 mostró un aumento en la altura del tejido similar al cartílago en el lado medial anterior de la rodilla. El tercer paciente con OA en la etapa tres recibió el tratamiento descrito en la sección de protocolo. Después de la segunda semana de inyección de mezcla ASV-ECM, el dolor y la ROM del paciente mejoraron en aproximadamente 50%Por la semana 22, el dolor y la ROM mejoraron significativamente más del 80%De la resonancia magnética repetida tomada después de la semana 22 mostró un aumento en la altura del tejido similar al cartílago en el lado medial de la rodilla.

Actualmente no hay terapia curativa disponible para el tratamiento de OA. Sin embargo, la inyección percutánea de terapia con células madre con ASCs y ECM homogeneizado junto con HA y PRP análogo activado con cloruro de calcio pueden proporcionar una alternativa a la terapia de tratamiento actual del tratamiento de la OA de rodilla.