Name: Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprende a producir fracción vascular estromal de tejido adiposo para regenerar cartílago en pacientes con osteoartritis de rodilla. Este protocolo mínimamente invasivo mejora la función articular.

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El autor reconoce el apoyo del personal de la clínica médica Mipro y el diseño de la figura de Jaepil/David Lee. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la bioenergía y programa de desarrollo de tecnología médica de la NRF financiada por MSIT número NRF-2017M3A9E4078014; y el nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (números NRF-2017R1A2B4002315 y NRF-2016R1C1B2010308).

La aprobación y consentimiento para informar después de informes del caso fueron renunciados por el Comité de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Myongji (MJUIRB). Además, este protocolo clínico estaba cumpliendo con las directrices de la declaración de Helsinki y la regulación de la KFDA. Para los procedimientos de los pacientes se obtuvieron Consentimientos informados.
1. la liposucción
Nota: Realizar con técnica estéril.
<ol><li>Utilice los siguientes criterios de inclusión: (1) evidencia de MRI de la etapa 3 OA; (2) varón o hembra; (3) mayores de 18 años de edad; (4) el tejido adiposo (100-110 g) suficiente para la liposucción; (5) falta de voluntad para proceder con la intervención quirúrgica; (6) fracaso de tratamiento conservador; y el dolor incapacitante permanente (7).</li>
	<li>Utilice los siguientes criterios de exclusión: (1) enfermedad inflamatoria o tejido conectivo activa cree que afectan la condición de dolor (es decir,lupus, artritis reumatoide, fibromialgia); (2) trastorno endocrino activo que pueda impactar la condición de dolor (es decir, hipotiroidismo, diabetes); (3) trastorno neurológico activo que pueda impactar la condición de dolor (es decir, neuropatía periférica, esclerosis múltiple); (4) enfermedad pulmonar activa que requiere el uso de fármacos; y (5) sin antecedentes de inyecciones esteroides común pasados 3 meses.</li>
	<li>Poner al paciente en un quirófano con una capucha de biohazard clase A y él (o ella) en una posición supina.</li>
	<li>Limpiar la zona abdominal del paciente con 5% betadine (povidona yodada) y cubra al paciente usando la técnica estéril, exponiendo el área limpiada del abdomen para la liposucción.</li>
	<li>Aproximadamente 5 cm infero-lateral del ombligo, anestesiar dos sitios (uno a la izquierda y el otro a la derecha del ombligo) de la incisión para-ser-con una aguja (25 calibre, 1½ pulgadas) en una jeringa de 5 mL con 2 mL de lidocaína al 2% sin epinefrina mediante la inyección de cada sitio a nivel epidérmico.</li>
	<li>Anestesiar el sitio de la incisión para-ser-usando 5 mL de solución tumescente (de normal salina, 40 mL de lidocaína al 2%, 20 mL de bupivacaína 0.5%, 0.5 mL de epinefrina 1: 1000 500 mL) en jeringa de 10 mL con una aguja (calibre 25, 1½ pulgadas).</li>
	<li>Hacen 2 incisiones de 0,5 cm aproximadamente 5 cm debajo del ombligo lateralmente pellizcando la piel para aumentar la profundidad del nivel subcutáneo.</li>
	<li>Usando la cuchilla no. 11, empujar la piel levantada para atravesar el nivel subcutáneo pero no penetran a través de la pared abdominal.</li>
	<li>Mediante el uso de cánula de calibre 16 de 20 cm, anestesiar el nivel subcutáneo de la zona de abdomen entero inferior, que es a-ser-operada, con 700 a 800 mL de la solución tumescente.</li>
	<li>Después de acabado infiltración de todo bajo vientre con la solución tumescente, preparar un aparato de liposucción mediante la conexión de una cánula de 3,0 mm conectada a la jeringuilla de 60 mL (o 30 mL) para la liposucción manual o una cánula especialmente diseñada de 3.0m m conectado a un kit de la centrifugadora, una jeringa de sistema cerrado con el fin de mantener la esterilidad, conectado a una máquina del vacío para la liposucción asistida por vacío.</li>
	<li>Realizar la liposucción para obtener 100-110 g de tejido adiposo excepto solución tumescente. Cuando se realiza la liposucción, se obtiene tejido adiposo junto con la solución tumescente, que debe ser separada y eliminada.</li>
	<li>Para separar la solución tumescente, primero por gravedad, transferencia de tejido adiposo en el kit de la centrífuga a una jeringa de 60 mL y coloque la jeringa hacia abajo (es decir, que es la porción de la jeringa en la parte inferior). Esperar 5-6 min., se separará el tejido adiposo y el líquido tumescente. Retire el líquido en la parte inferior de la jeringa presionando en la parte superior del émbolo de la jeringa.</li>
	<li>Realizar los pasos anteriores 1.9-1.11 hasta que se ha acumulado un total de 100-110 g de tejido adiposo (lipoaspirates) por la rodilla.</li>
</ol>2. preparación de mezcla de ASC/ECM con sistema cerrado estéril
<ol><li>Después de separar la solución tumescente por gravedad y acumulando 50-55 g de lipoaspirates por cada kit de 60 mL centrífuga, un sistema cerrado estéril, colocar los kits 2 centrifugadora en una centrifugadora envase cubo y vuelta a 1600 x g durante 5 min, condensación del lipoaspirates y separar el líquido del tejido adiposo. En este proceso de más condensa, la lipoaspirates puede producir aceite graso en ciertos casos.</li>
	<li>Ser precavido no debe sacudir, retire el tapón de seguridad y el enchufe en la parte inferior del kit centrífuga.</li>
	<li>Retire el líquido de la parte inferior presionando lentamente hacia abajo en la parte superior del émbolo del kit centrífuga.</li>
	<li>Jeringa 60 mL separado, disolver 10 mg de colagenasa (5 mg de colagenasa específica para tejido conectivo24 ) y 5 mg de colagenasa específica para tejido adiposo25con 50 mL de solución salina normal.</li>
	<li>Mezclar aproximadamente 25-30 mL de lipoaspiración condensada con colagenasa disuelto (5 mg de colagenasa específica para tejido conectivo) y 5 mg de colagenasa específica de tejido adiposo en una proporción de 1:1 (v: v) conectando la jeringa de 60 mL con un kit de centrífuga mediante el uso de un conector especializado.</li>
	<li>Mezclar bien la lipoaspiración condensada y la colagenasa, empujando el contenido entre la jeringa de 60 mL y los kits de centrífuga mediante una varilla o un empujador.</li>
	<li>Transferir la mezcla de la lipoaspiración y la colagenasa a jeringas de 60 mL.</li>
	<li>Conecte cada jeringa de 60 mL que contiene la mezcla con un homogenizador de tejido que contiene las hojas.</li>
	<li>Conecte una jeringa de 60 mL vacía al otro extremo de la homogeneizadora.</li>
	<li>Empuje la mezcla a la otra jeringa de 60 mL a través del homogeneizador para 4 -6 veces, resultando en el corte y picado de la lipoaspiración.</li>
	<li>Transferir la lipoaspiración homogeneizada y la mezcla de la colagenasa a kits de 60 mL centrífuga a través de un conector especializado</li>
	<li>Coloque los kits de la centrífuga en un contenedor para ser colocados en una incubadora que ha sido precalentada a 37 ° C.</li>
	<li>Incubar los kits de dos centrífugas con la mezcla homogeneizada a 37 ° C durante 40 minutos mientras gira a 45 rpm.</li>
	<li>Después de lo 40 min de incubación, retire el recipiente de la incubadora de forma estéril. Luego, retirar los kits de la centrífuga y colocarlos en una máquina de la centrifugadora.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla a 800 x g durante 5 min separar el SVF derivadas de tejido adiposo.</li>
	<li>Después de centrifugar, quitar el sobrenadante (que incluye colagenasa y digiere tejido adiposo) de cada kits centrífuga quitando la tapa de la jeringa en la parte superior del émbolo y colocar una jeringa de 30 mL en el émbolo apertura mediante cerradura de jeringa conexión.</li>
	<li>Lentamente Presione hacia abajo la parte del barril de la jeringa de 30 mL de sobrenadante llenar la jeringa de 30 mL.</li>
	<li>Presione hacia abajo el cuerpo de la jeringuilla de 30 mL hasta lo últimos 3-4 mL de la parte inferior del kit centrífuga, dejando sólo el último 3-4 mL de SVF derivadas de tejido adiposo. Se descarta el sobrenadante.</li>
	<li>Retire la jeringa de 30 mL de la parte superior del émbolo y llenar la jeringa con 5% de dextrosa en solución de Ringer entibiada (D5LR).</li>
	<li>Conectando la jeringa de 30 mL llenada de D5LR en la parte superior del émbolo abrir, llenar los kits de centrífuga, 3-4 ml de SVF derivadas de tejido adiposo, con D5LR hasta 55 mL.</li>
	<li>Retire la jeringa de 30 mL, tapa el émbolo y centrifugue los kits de centrifugar a 300 x g durante 4 minutos.</li>
	<li>Repita los pasos 2.17 2.21 para un total de 4 lavados. La colagenasa utilizada es xenogénica. Por lo tanto, la mayoría de la colagenasa se elimina por 4 lavados. Sin embargo, para la aprobación de la FDA, puesta a punto del Protocolo puede ser necesario eliminar por completo los residuos de colagenasa en el volumen final, aunque el monto actual de los residuos de la colagenasa puede ser lo suficientemente insignificante para los pacientes que no tienen ningún clínico efectos secundarios.</li>
	<li>Después de la centrifugación deth 4, para obtener el final SVF para inyección, saque el tapón de seguridad y el tapón en la abertura inferior del kit centrífuga, sin sacudir o girar el kit de la centrifugadora.</li>
	<li>Sujetar una jeringa de 20 mL a la base del kit de centrífuga abrir usando un conector especialmente diseñado.</li>
	<li>Tire el émbolo de la jeringa varias veces ida y vuelta a las células que se han asentado en la parte inferior del kit de la centrifugadora.</li>
	<li>Quitar el volumen total deseado de la SVF que contiene ASCs y ECM junto con otras células y tejidos (generalmente cerca de 3-4 mL de cada kit de centrífuga para inyecciones conjuntas de rodilla).</li>
</ol>3. PRP preparado con técnica estéril
<ol><li>Mientras se prepara el ASCs y el ECM, extraer 30 mL de sangre autóloga con 2,5 mL de anticoagulante citrato dextrosa solución.</li>
	<li>Transferencia de la sangre dibujada con los kits de centrífuga de 60 mL.</li>
	<li>Centrifugar la sangre dibujada a 730 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante en un nuevo kit de centrífuga de 60 mL. Centrifugar el sobrenadante a 1300 x g durante 4 min, dando por resultado en 3-4 mL de PRP.</li>
	<li>Justo antes de la inyección, añadir 3% (w/v) cloruro de calcio en una proporción de 10:2 (PRP: cloruro de calcio, v: v) para el PRP para activarlo.</li>
	<li>Añadir 0,5% (p/v) HA, como un andamio para el PRP activado con cloruro de calcio. Estos ASC con ECM, junto con PRP, activado por el cloruro de calcio, y HA reposar la mezcla ASC/ECM.</li>
</ol>4. ASC/ECM mezcla-tratamiento
<ol><li>Limpiar la rodilla del paciente con clorhexidina 5% y cubra de forma estéril.</li>
	<li>Palpar la parte anterior de la rodilla para el espacio articular entre los huesos tibiales y femorales.</li>
	<li>Anestesiar el sitio de la inyección superficial con lidocaína diluida (1 mL de lidocaína al 1% diluida con 4 mL de solución salina normal) de la piel a sólo fuera de la cápsula articular.</li>
	<li>Anestesiar el interior de la cápsula articular con ropivacaína diluida (ropivacaína de 0.75% de 1 mL diluida con 3 mL de solución salina normal).</li>
	<li>Mezcle 2 mL de HA a lo 6-8 mL de SVF contenida en una jeringa de 20 mL a través del conector de la jeringa a jeringa.</li>
	<li>Mediante el uso de un conector de jeringa a jeringa, agregar 0,4 mL de cloruro de calcio a lo 3-4 mL de PRP que ya ha sido preparado autólogo y estar preparado en una jeringa de 5 mL.</li>
	<li>Se combinan con 8-10 mL de mezcla HA/SVF en un 20 mL jeringa a través de jeringa a jeringa conector 3.5-4.5 mL de cloruro de calcio PRP en una jeringa de 5 mL.</li>
	<li>Inmediatamente inyecte lentamente la mezcla (aproximadamente 12-15 mL) en la articulación femoral tibio-femorales anterior de las rodillas con aguja de calibre 18 de 38 mm con o sin la dirección del ultrasonido.</li>
	<li>Después de la inyección, venda el sitio de inyección con presión doblando la gasa de algodón 4 x 4 4 veces y colocando cintas sobre la gasa de 4 x 4 doblada.</li>
	<li>Instruir al paciente a permanecer todavía durante 60 min permitir el accesorio de la célula.</li>
	<li>Instruir al paciente a limitar las actividades para un mínimo de 1 semana tras el alta de la clínica.</li>
	<li>Regresar a la clínica de tres inyecciones adicionales de PRP activado por cloruro de calcio durante 3 semanas.</li>
</ol>5. después del tratamiento de seguimiento
<ol><li>Evaluar el paciente en la semana del 2, 4 y 16 (18 o 22) para la mejora del dolor en escala visual analógica (VAS) y mejora de la función en términos de parámetros de terapia física. Determinar el índice de clasificación funcional (Vie), VAS y rango de movimiento (ROM) como se describió anteriormente26,27.</li>
	<li>Seguir al paciente después del tratamiento RM 3 meses después del tratamiento.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En 2001, Zuk et al. células madre aisladas del tejido adiposo por romper la matriz de colágeno colagenasa6. Luego, el grupo demostró que estas células madre aisladas del tejido adiposo podría transformar en cartílago y otros tejidos del mesodermo en origen, demostrando que estas células madre eran de origen mesenquimales.
Asimismo, el procedimiento presentado en este artículo es un modificado protocolo para aplicar el método similar a pacientes humanos. La prin...

Las células madre mesenquimales (MSCs) se sabe que tienen la capacidad de regenerar cartílago1,2,3,4,5,6. Pueden ser fácilmente obtenidos de diversas fuentes: médula ósea, sangre del cordón umbilical y tejido adiposo entre muchos otros. Entre estas fuentes, el tejido adiposo es la única fuente donde se puede obtener un número suficiente de MSCs sin cualquier expansión de la cultura para la regeneración de cartílago en ajustes clínicos7,8. Fracción vascular estromal de médula ósea autóloga (SVF) puede obtenerse fácilmente así. Sin embargo, el número de células madre contenidas en la médula ampliada de cultura no es muy bajo7,8. Sangre del cordón umbilical puede contener un número suficiente de MSCs. Sin embargo, la sangre del cordón no es una fuente fácilmente disponible de SVF autólogo.
Existen numerosos métodos de procesamiento de tejido adiposo para obtener SVF para aplicaciones clínicas. Entre estos, el método de obtención de MSCs del tejido adiposo con colagenasa, desarrollado y confirmado por Zuk et al. 5 , 6, es muy bien aceptada. Este método de uso de colagenasa se ha modificado para usos clínicos en ortopedia. Para ser aplicado a contextos clínicos, el sistema debe ser un sistema cerrado para mantener la esterilidad, manteniendo la comodidad. Una modificación particular presentada en este artículo implica la homogeneización de la lipoaspirates. Lipoaspirates de tamaño pequeño son digeridos relativamente más rápido que los más grandes que están resultando en un desgaste irregular del tejido adiposo. Además, estos lipoaspirates de tamaño más grandes puede producir tejidos fibrosos que pueden obstruir las jeringas y agujas al realizar inyecciones conjuntas9,10. Para evitar estos problemas, el lipoaspirates puede ser homogeneizada mediante corte y trituración de la lipoaspirates antes de la incubación con colagenasa. El SVF resultante derivadas de tejido adiposo puede contener más uniforme matriz extracelular (ECM) en comparación con lipoaspirates que no están homogeneizadas11. El ECM averiado en el SVF puede funcionar como un andamio de12.
En 2009, SVF autóloga derivadas de tejido adiposo se ha permitido por la administración de drogas (KFDA) cuando se procesa dentro de un centro médico con un mínimo tratamiento por un médico13Coreano. Luego, SVF autóloga derivadas de tejido adiposo ha sido utilizado como un agente potencial para mejorar las funciones de la rodilla en pacientes de osteoartritis (OA) potencialmente regenerando tejido similar a cartílago10,14,15 , 16 , 17 , 18 . 
En 2011, Pak demostró por primera vez que el tejido adiposo células madre derivadas (ASCs) contenidas en el SVF derivadas de tejido adiposo puede mejorar funciones de rodilla potencialmente regenerar tejido similar a cartílago en pacientes humanos de OA cuando se inyecta con rico en plaquetas plasma (PRP) 14. Además, Pak et al han informado datos de seguridad en 2013 con 91 pacientes. La tasa de eficacia media en estos datos de seguridad fue 67%15. Posteriormente, estudios adicionales por Pak et al demostraron rodilla mejora funciones potencialmente debido a la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes con un menisco lagrimal y condromalacia de la rótula10,16,17 ,18. Basado en artículos registrados, se sabe que el número de células madre contenidas en 100 g de tejido adiposo por el protocolo presentado en este artículo puede variar desde 40,000,000 de 1.000.000 dependiendo de las características de pacientes8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.
Aquí, presentamos un protocolo clínico de OA de la rodilla humana utilizando SVF autóloga derivadas de tejido adiposo con HA y PRP activado con cloruro de calcio. La primera versión de este protocolo clínico, que implica un sistema cerrado, manual para mantener la esterilidad, se reportó en 201114. El protocolo idéntico fue optimizado, mantenimiento de esterilidad y fue reportado en 2013 y 201610,15. Aquí, se presenta el protocolo optimizado. La descripción esquemática del Protocolo se presenta en la figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58363/58363fig1.jpg"> Figura 1: Descripción esquemática del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58363/58363fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% Betadine (povidona yodada)&nbsp;</td><td>Firson Co., Ltd.</td><td></td><td></td>657400260</tr><tr><td>2% de lidocaína&nbsp;</td><td>Daehan Pharmaceutical Co.</td><td></td><td></td>670603480</tr><tr><td>Solución tumescente&nbsp;</td><td>Myungmoon Pharm. Co. Ltd.</td><td>N01BB01</td><td>La solución estaba compuesta por 500 mL de solución salina normal, 40 mL de lidocaína al 2%, 20 mL de marcaína al 0,5% y 0,5 mL de epinefrina 1:1000.</td></tr><tr><td>Grado de investigación Liberase TL y TM&nbsp;</td><td>Roche Applied Science 5401020001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D5LR</td><td>Dahan Pharm. Co., Ltd.</td><td>645101072</td><td>Dextrosa 5% en solución de Ringer lactato&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución anticoagulante de citrato dextrosa &nbsp;</td><td>Fenwal, Inc.</td><td>NDC: 0942-0641</td><td>La solución estaba compuesta por ácido cítrico al 0,8 %, citrato de sodio al 0,22 % y dextrosa al 0,223 %.</td></tr><tr><td>3% (p/v) Cloruro de calcio&nbsp;</td><td>Choongwae Farmacéutica Co.</td><td></td><td></td>644902101</tr><tr><td>0,5% (p/v) de HA (ácido hialurónico)</td><td>Dongkwang pharm. Co., Ltd.</td><td></td><td></td>645902030</tr><tr><td>0.25% Ropivacaína</td><td>Huons Co., Ltd.</td><td>670600150</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.0 mm Cánula&nbsp;</td><td>WOOJU Instrumentos Médicos Co.</td><td></td><td></td>ML30200</tr><tr><td>jeringa Luer-Lock de 60 ml</td><td>BD (Becton Dickinson)&nbsp;</td><td></td><td></td>309653</tr><tr><td>Kit de barril de centrífuga&nbsp;</td><td>CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827044</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos que contiene cuchillas</td><td>CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827045</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de incubadora giratorio</td><td>Medikan Co., Ltd</td><td>MS02060092</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Hanil Scientific Inc.</td><td>CE1133</td><td></td></tr><tr><td>Imágenes por resonancia magnética</td><td>Philips Medical Systems Inc.</td><td>18068</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes de ultrasonido</td><td>Samsung Medison co., Ltd</td><td>CT-LK-V10-ICM-09.05.2007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo clínico de producir fracción vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

La osteoartritis (OA) es uno de los más comunes trastornos debilitantes. Recientemente, se hicieron numerosos intentos para mejorar las funciones de las rodillas utilizando diferentes formas de células madre mesenquimales (MSCs). En Corea, concentrados de médula y cordón de células madre procedentes de sangre han sido aprobadas por la administración de medicamentos (KFDA) Coreano para regeneración de cartílago. Además, se ha permitido una derivados del tejido adiposo stromal vascular fracción (SVF) por la KFDA para inyecciones conjuntas en pacientes humanos. SVF autóloga derivadas de tejido adiposo contiene matriz extracelular (ECM) además de las células madre mesenquimales. ECM excreta diferentes citoquinas que, junto con el ácido hialurónico (ah) y plasma rico en plaquetas (PRP) activado por el cloruro de calcio, pueden ayudar a MSCs para regenerar el cartílago y mejorar las funciones de la rodilla. En este artículo, presentamos un protocolo para mejorar las funciones de la rodilla mediante la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes humanos con OA. El resultado del protocolo primero fue divulgado en 2011 seguido por algunas publicaciones adicionales. El protocolo consiste en la liposucción para obtener lipoaspirates autólogo que se mezclan con colagenasa. Esta mezcla de lipoaspirates-colagenasa es luego y homogeneizada para quitar tejido fibroso grandes que puede obstruir la aguja durante la inyección. Luego, la mezcla se incuba para obtener SVF derivadas de tejido adiposo. El SVF resultante derivadas de tejido adiposo, que contienen derivados del tejido adiposo MSCs y restos de ECM, se inyecta en las rodillas de los pacientes, combinados con HA y cloruro de calcio activado PRP. Incluyen tres casos de pacientes que fueron tratados con el protocolo dando por resultado la mejora del dolor de la rodilla, hinchazón y rango de movimiento junto con evidencia de MRI de tejido similar al cartílago hialino.

Tres pacientes (una mujer de 87 años de edad con la etapa 3 OA, un hombre de 68 años de edad con etapa 3 OA, y una mujer de 60 años de edad con etapa 3 OA) sin cualquier pasado significativo historial médico presentó a la clínica con dolor de rodilla persistente y deseado para potencial tratamiento SVF derivadas de tejido adiposo autólogo. Los tres pacientes tenían su rodilla examinada por un cirujano ortopédico y se ofrecieron a reemplazo total de rodilla (TKR) y eran reacios a la cirugí...

Aquí, presentamos un protocolo para producir una fracción vascular estromal derivadas de tejido adiposo y su aplicación para mejorar las funciones de la rodilla mediante la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes humanos con osteoartritis.

Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

La osteoartritis es uno de los trastornos debilitantes más comunes entre la población de edad avanzada. En la actualidad, no existe una cura definitiva para las causas subyacentes de la osteoartritis. Este protocolo clínico describe un procedimiento innovador para un tratamiento prometedor, mínimamente invasivo, y alternativo de la osteoartritis de rodilla humana mediante la regeneración del cartílago como el tejido.La osteoartritis es uno de los trastornos debilitantes más comunes entre la población de edad avanzada. En la actualidad, no existe una cura definitiva para las causas de subrayado de la osteoartritis. Este protocolo clínico es un procedimiento innovador para un tratamiento prometedor, mínimamente invasivo y alternativo de la osteoartritis de rodilla humana mediante la regeneración de tejido similar al cartílago.Lleve al paciente a un quirófano con una capucha de clase A de riesgo biológico y colóquelo en una posición supina. Limpie la zona abdominal del paciente con 5%betadine-povidine yodo y cubra al paciente utilizando la técnica estéril, exponiendo la zona limpia del abdomen para la liposucción. Aproximadamente cinco centímetros infero-lateralmente del umbilicus, anestesia dos sitios, uno a la izquierda y otro en el lado derecho del umbilicus de la incisión que se va a hacer.Usar dos mililitros de 2%lidocaína sin epinefrina con una aguja de 25 calibres de 1,5 pulgadas en una jeringa de cinco mililitros inyectando cada sitio a nivel epidérmico. Anestesice el lugar de la incisión que se realizará utilizando cinco mililitros de solución tumescente y jeringa de 10 mililitros y la aguja de 25 calibres 1,5 pulgadas. Haga dos incisiones de 0,5 centímetros aproximadamente cinco centímetros por debajo del umbilicus lateralmente pellizcando la piel para elevar la profundidad del nivel subcutáneo.Usando una hoja número 11, ayuda a la piel elevada a penetrar a través del nivel subcutáneo pero no a penetrar a través de la pared abdominal. Mediante el uso de cánula calibre 20 centímetros y 60, anestesia el nivel subcutáneo de toda la zona inferior del abdomen que se va a liposuplicar con 700 a 800 mililitros de la solución tumescente. Después de terminar la infiltración de todo el abdomen inferior con solución tumescente, preparar un aparato de liposucción conectando una cánula de 3,0 milímetros conectada a una jeringa de 60 mililitros o 30 mililitros para liposucción manual o especialmente diseñada cánula de 3,0 milímetros conectada a un kit centrífugo.Una jeringa de sistema cerrado desarrollada por nosotros mismos y aprobada por FDA CDRH con el propósito de mantener la esterilidad conectada a una máquina de vacío para liposucción asistida por vacío. Realizar liposucción para obtener 100 a 110 gramos de tejido adiposo excluyendo la solución tumescente. Al realizar la liposucción, se obtendrá tejido adiposo junto con solución tumescente, pero debe separarse y eliminarse.Para separar primero la solución tumescente por gravedad, el tejido adiposo del kit de centrífuga puede transferirse a una jeringa de 60 mililitros y colocar la jeringa hacia abajo. Por ejemplo, la parte de apertura de la jeringa está en la parte inferior. Al esperar de cinco a seis minutos, se separará el tejido adiposo y la solución tumescente.Retire el líquido de la parte inferior de la jeringa presionando en la parte superior del émbolo de la jeringa. Realice los pasos anteriores nueve a 11 hasta que se haya acumulado el total de 100 gramos a 110 gramos de lípido de tejido adiposo por rodilla. Después de separar la solución tumescente por gravedad y acumular de 50 gramos a 55 gramos de aspirado lipídico por cada sistema cerrado estéril del kit de centrífuga de 60 mililitros, coloque los dos kits de centrífuga en un cubo de recipiente centrífugo y gire a 1600 G durante cinco minutos, condensando el lípido y separando el líquido del tejido adiposo.Este proceso condensa aún más el aspirado lipídico y puede producir aceite graso en ciertos casos. Tenga cuidado de no agitar, retire la tapa de seguridad y el enchufe en la parte inferior del kit de centrífuga. Retire el líquido inferior empujando lentamente hacia abajo en la parte superior del émbolo del kit de centrífuga.En una jeringa separada de 60 mililitros, disuelva 10 miligramos de colagenasa, cinco miligramos de colagenasa específica para el tejido conectivo y cinco miligramos de colágeno específico para el tejido adiposo con 50 mililitros de solución salina normal. Mezclar aproximadamente 25 a 30 mililitros de lípido condensado con colágeno disuelto, cinco miligramos de colagenasa específica para el tejido conectivo, y cinco miligramos de colágeno específico para tejido adiposo en una proporción de uno a uno, volumen a volumen, conectando la jeringa de 60 mililitros a un kit centrífugo mediante el uso de un conector especializado. Mezclar a fondo para condensar el aspirado de preparación y la colagenasa empujando el contenido entre la jeringa de 60 mililitros y el kit de centrífugas utilizando una varilla o un empujador.Transfiera la mezcla del aspirado lipídico y la colagenasa de vuelta a la jeringa de 60 mililitros. Conecte cada jeringa de 60 mililitros que contenga la mezcla con el homogeneizador de tejido que contiene cuchillas. Conecte una jeringa vacía de 60 mililitros al otro extremo del homogeneizador.Empuje la mezcla a la otra jeringa de 60 mililitros a través del homogeneizador durante cuatro a seis veces, lo que resulta en el corte y la picadura del aspirador de lípidos. Transfiera el aspirado lipídico homogeneizado y la mezcla colagenosa de nuevo al kit de centrífuga de 60 mililitros a través de un conector especializado. Coloque los kits de centrífuga en un recipiente para colocar en una incubadora que haya sido precalentada a 37 grados centígrados.Incubar los dos kits de centrífugas con la mezcla homogeneizada a 37 grados celsius durante 40 minutos mientras se gira a 45 rpm. Después de 40 minutos de incubación, retire el recipiente de la incubadora de forma estéril. A continuación, retire los kits de centrífuga y colóquelos en una máquina centrífuga.Centrifugar las mezclas a 800 G durante cinco minutos para separar el SVF derivado del tejido adiposo. Después de la centrífuga, el sobrenadante, que incluye colagenasa y tejido adiposo digerido, se extrae de cada kit de centrífuga quitando la tapa de la jeringa en la parte superior del émbolo y colocando una jeringa de 30 mililitros en la abertura del émbolo a través de una conexión de bloqueo de jeringa. Presione lentamente hacia abajo en la parte del barril de la jeringa de 30 mililitros para que el sobrenadante se llene en la jeringa de 30 mililitros.Presione hacia abajo el barril de la jeringa de 30 mililitros hasta los últimos tres a cuatro mililitros de la parte inferior del kit de centrífuga, dejando sólo los últimos tres a cuatro mililitros de SVF derivado del tejido adiposo. El sobrenadante es descarte. Retire la jeringa de 30 mililitros de la parte superior del émbolo y llene la jeringa con una solución de timbre lactado de 5% dextrosa, también conocida como D5LR.Al fijar la jeringa de 30 mililitros llena de D5LR en la parte superior de la abertura del émbolo, llene los kits de centrífugas que contienen de tres a cuatro mililitros de SVF derivado del tejido adiposo con D5LR hasta 55 mililitros. A continuación, retire la jeringa de 30 mililitros, tape la abertura del émbolo y centrifugar de nuevo los kits de centrífuga a 300 G durante unos cuatro minutos. Repita los pasos del número 17 al número 21 para un total de cuatro lavados.Después de la cuarta centrífuga, con el fin de obtener el SVF final para inyección, retire la tapa de seguridad y el enchufe en la abertura inferior del kit de centrífuga sin agitar o girar el kit de centrífuga. Conecte una jeringa de 20 mililitros a la abertura inferior del kit de centrífugas utilizando un conector especialmente diseñado. Tire del émbolo de la jeringa de 20 mililitros varias veces hacia adelante y hacia atrás para agitar las células que se han asentado en la parte inferior del kit de centrífuga.Elimine el volumen total deseado del SVF que contiene tanto los AST como el ECM junto con otras células y tejidos. Por lo general, alrededor de tres a cuatro mililitros de cada kit de centrífuga para inyecciones de articulaciones de rodilla. Hicimos 30 mililitros de sangre autóloga junto con 2,5 mililitros de solución anticoagulante de dextrosa de citrato.Luego, la sangre extraída fue transferida a los kits de barriles de centrífuga de 60 mililitros. Luego fue centrifugado a 730 de gravedad durante cinco minutos. Y el sobrenadante fue removido y puesto en un nuevo kit de barril centrífugo de 60 mililitros.El sobrenadante fue centrifugado a 1350 de gravedad durante cuatro minutos, obteniendo 4,4 mililitros de PRP. Limpie la rodilla del paciente con 5%betadina y colótela de forma estéril. Palpa la parte anterior de la rodilla para el espacio articular entre los huesos tibiales y femorales.Anestesiar el lugar de inyección superficialmente con lidocaína diluida, un mililitro de 1%lidocaína diluido con cuatro mililitros de solución salina normal, desde la piel hasta justo fuera de la cápsula articular. A continuación, anestesiar el interior de la cápsula articular con ropivacaína diluida, un mililitro 0,75% ropivacaína diluida con tres mililitros de solución salina normal. Mezclar dos mililitros de HA en el mililitro de SVF contenido en una jeringa de 20 mililitros a través de una jeringa para el conector de la jeringa.Mediante el uso de una jeringa para el conector de la jeringa, añadir 0,4 mililitros de cloruro de calcio a los tres o cuatro mililitros de PRP autólogo que ya se ha preparado y estar listo en una jeringa de cinco mililitros. Combine de 3,5 a 4,5 mililitros de cloruro de calcio PRP en una jeringa de cinco mililitros con ocho a 10 mililitros de mezcla HA-SVF en una jeringa de 20 mililitros a través de una jeringa y un conector de jeringa. Inyecte inmediatamente la mezcla, de unos 12 a 15 mililitros, lentamente en la articulación tibial-femoral anterior de la rodilla, utilizando una aguja de calibre 38 milímetros de 18 milímetros con o sin la guía de ultrasonido.Después de la inyección, venda el lugar de inyección a presión doblando la gasa de algodón 4x4 cuatro veces y colocando cintas sobre la gasa 4x4 plegada. Indique al paciente que permanezca inmóyo durante 60 minutos para permitir la fijación celular. Indique al paciente que limite las actividades por un mínimo de una semana después del alta de la clínica.Vuelva a la clínica para tres inyecciones adicionales de PRP activadas por cloruro de calcio durante tres semanas. El paciente con OA en etapa tres recibió el tratamiento como se describe en la sección de protocolo. Después de la segunda semana de la inyección de mezcla ASV-ECM, el dolor y la ROM del paciente mejoraron.Para la semana 16, el dolor y la ROM del paciente mejoraron significativamente más del 70%De la rmN de tratamiento posterior, tomada después de la semana 16, mostraron el mayor grosor del tejido similar al cartílago en el lado medial de la rodilla. Otro paciente con OA en etapa tres recibió el tratamiento como se describe en la sección de protocolo. Después de la segunda semana de la inyección de mezcla ASV-ECM, el dolor y la ROM del paciente mejoraron.Para la semana 18, el dolor y rom mejoraron significativamente a 80%Rmn repetida tomada después de la semana 18 mostró un aumento en la altura del tejido similar al cartílago en el lado medial anterior de la rodilla. El tercer paciente con OA en la etapa tres recibió el tratamiento descrito en la sección de protocolo. Después de la segunda semana de inyección de mezcla ASV-ECM, el dolor y la ROM del paciente mejoraron en aproximadamente 50%Por la semana 22, el dolor y la ROM mejoraron significativamente más del 80%De la resonancia magnética repetida tomada después de la semana 22 mostró un aumento en la altura del tejido similar al cartílago en el lado medial de la rodilla.Actualmente no hay terapia curativa disponible para el tratamiento de OA. Sin embargo, la inyección percutánea de terapia con células madre con ASCs y ECM homogeneizado junto con HA y PRP análogo activado con cloruro de calcio pueden proporcionar una alternativa a la terapia de tratamiento actual del tratamiento de la OA de rodilla.

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Investigación

JoVE Journal

Medicine

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Este protocolo describe el aislamiento de tejido adiposo derivado de células estromales de lipoaspirado y la creación de un 4 mm de tamaño crítico defecto craneal para evaluar la regeneración esquelética.

La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

El objetivo de este estudio es reportar un protocolo para el tratamiento artroscópico de las lesiones osteocondrales del astrágalo mediante microfractured y las células progenitoras derivadas de adiposo purificadas.

Microfractured autólogo y purificada del tejido adiposo para manejo artroscópico de las lesiones osteocondrales de astrágalo

Aquí, presentamos un protocolo para obtener la fracción vascular estromal de tejido adiposo a través de una serie de procesos mecánicos, que incluyen múltiples centrifugados y emulsificación.

Micronización mecánica de Lipoaspirates para la terapia regenerativa

El presente protocolo describe una metodología mejorada para el aislamiento de ADSC que resulta en un tremendo rendimiento celular con ganancia de tiempo en comparación con la literatura. Este estudio también proporciona un método sencillo para obtener un número relativamente grande de células viables después de la criopreservación a largo plazo.

Técnica para la obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo y caracterización de fracciones vasculares estromales en criopreservación a largo plazo

La fracción vascular estromal (FSV) aislada mecánicamente en combinación con un hidrogel de fibrina ofrece un portador fácil y eficiente de células estromales viables derivadas del tejido adiposo para diversas indicaciones, incluida la ingeniería de tejidos o la cicatrización de heridas. Aquí, presentamos la preparación de una construcción mecánica de hidrogel de fibrina SVF (mSVF) para investigación traslacional y aplicación clínica.

La combinación de fracción vascular estromal aislada mecánicamente e hidrogel de fibrina: un protocolo de procesamiento

Aquí, presentamos un protocolo que puede transformar el tejido adiposo autólogo en varias sustancias componentes adiposas con diferentes propiedades y funciones fisicoquímicas.

Innovador fraccionamiento de tejido adiposo para transformar la grasa en componentes especializados

Carcinoma asociados fibroblastos (CAF), rica en miofibroblastos presentes en el estroma tumoral, juegan un papel importante en la conducción de la progresión del tumor. Hemos desarrollado un modelo de tumor coimplantation xengraft para generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos humanos mamarios. El protocolo describe cómo establecer miofibroblastos CAF que adquirir la capacidad de promover la génesis tumoral.

Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Aprende a producir fracción vascular estromal de tejido adiposo para regenerar cartílago en pacientes con osteoartritis de rodilla. Este protocolo mínimamente invasivo mejora la función articular.

Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

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