Name: Mecanismos subyacentes de la secreción de la hormona del intestino utilizando los aislados perfusión intestino de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende los mecanismos moleculares de secreción hormonal intestinal y absorción de nutrientes utilizando el intestino delgado aislado y perfundido de rata. Esta técnica fisiológica mantiene el tejido in situ para estudios detallados.

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Este trabajo fue financiado por una subvención sin restricciones de Prof. Jens Juul Holst Novo Nordisk del centro de la investigación metabólica básica (Novo Nordisk Foundation, Dinamarca), una subvención independiente de la Fundación de Novo Nordisk para hacer estudios de roedores de la perfusión (no de la concesión. NNF15OC0016574), una subvención a Prof. Holst desde el Consejo Europeo de investigación (Grant no.695069) y la Unión de la europea del séptimo programa marco de investigación, TechnologicalDevelopment y demostración (Grant no. 266408) así como postdoc conceder a Rune E. Kuhre de la Fundación Lundbeck (R264-2017-3492). Agradecemos a Jenna E. Hunt y Carolyn F. Deacon para la revisión cuidadosa.

Todos los estudios se llevaron a cabo con la autorización de la inspección de experimentos animales danés (2013-15-2934-00833) y el Comité de ética local, siguiendo las directrices de la legislación danesa sobre experimentación animal (1987) y el nacional Institutos de salud (número de publicación 85-23).
1. animales
<ol><li>Obtener las ratas macho Wistar (250 g) y casa 2 por jaula, con acceso ad libitum a chow estándar y agua y mantener en un 12:12 h ciclo de luz-oscuridad. Nuestras instalaciones de animales utiliza agua no tratada y Alrtromin chow roedor (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Dinamarca). Nota: Deje que los animales al menos una semana de aclimatación.</li>
</ol>2. preoperatorios preparados
<ol><li>Hacer buffer de perfusión: tampón bicarbonato de Krebs-Ringer suplementado con 0,1% BSA (fracción V), fumarato T-70, 3,5 mmol/L glucosa y piruvato de 5 mmol/L, 5% dextran y glutamato (si es necesario); pH 7.4.</li>
	<li>Prepare una cantidad suficiente de tampón de perfusión por filtración a través de un tamaño adecuado del filtro y ajustar el pH a ~7.5 por adición gota a gota de 5 M HCl.</li>
	<li>Añadir 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (si es necesario) directamente en el búfer en el día del estudio a una concentración final de 10 μm. Nota: IBMX es un inhibidor de la fosfodiesterasa que aumenta la [cAMP] y tal modo restaura la sensibilidad y la capacidad de respuesta de la tripa en cuanto a la secreción de hormonas a un estímulo secretor.</li>
	<li>Preparar soluciones de prueba. Preparar estímulos vasculares en un 20 x concentración más alta que la concentración final deseada en buffer filtrado y ajustar a pH de la perfusión. Preparar prueba luminal estímulos en solución salina isotónica en la concentración final.</li>
	<li>Disolver compuestos no fácilmente solubles en 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) y diluir en perfusión buffer o solución salina isotónica. Para estímulos vasculares, mantenga la concentración final de DMSO en el 1% o por debajo, como las concentraciones anteriores esto dañar el intestino y puede conducir a la secreción de la hormona intestinal inespecífica. Medir el pH y ajustar a ~7.5 si es necesario.</li>
</ol>3. funcionamiento y perfusión
Nota: Una ilustración de una configuración de perfusión se proporciona en la figura 1.
<ol><li>Anestesiar las ratas por el uso de un régimen anestésico que puede mantener la anestesia quirúrgica y analgesia durante 30-40 min por Hypnorm/Midazolam (0.3 ml/100 g peso y, ml: Hypnorm: fentanilo 0.08 mg, fluanisone 2,5 mg, 0.45 mg de parahidroxibenzoato de metilo, 0.05 mg Parahidroxibenzoato de propilo, Midazolam: 1,25 mg, matriz Pharmaceuticals, Hellerup, Dinamarca)</li>
	<li>Comprobar por falta de reflejos (pellizco del dedo del pie), colocar la rata en la mesa de operaciones climatizada y realizar una incisión de la piel para exponer el intestino.</li>
	<li>
Exponga la parte terminal del colon moviendo el intestino delgado a un lado tanto como sea posible. El lazo de la vasculatura a los dos puntos de abastecimiento y suprimir gradualmente a partir de la parte terminal del colon, hacia el intestino delgado.
	<ol>
<li>Si sólo una parte del intestino se requiere para perfusión (la mitad superior), impuestos especiales segmentos no necesaria después de atar apagado suministro de vasculatura. Para minimizar el daño a los tejidos, hidratar el intestino con solución salina isotónica y utiliza bastoncillos para eliminar tejido conectivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insertar un tubo de plástico (longitud: ~ 15 cm, diámetro externo: ~0.4 cm) en el lumen intestinal (en la parte proximal) y atar bien con suturas. Lavar cuidadosamente con solución salina isotónica (temperatura ambiente) para vaciar el lumen del quimo.</li>
	<li>Inundar el lumen con la solución salina isotónica a un flujo de 0.25 mL/min, utilizando una jeringa de 10 mL conectada a una bomba de jeringa.</li>
	<li>Mueva el intestino a un lado para que la arteria mesentérica superior es accesible y remover el tejido conjuntivo y grasa para exponer la arteria.</li>
	<li>Coloque dos suturas debajo de la arteria mesentérica utilizando pinzas de punta fina; una de las suturas es para levantar la arteria para control de sangrado una vez se ha cortado la arteria y el otro es para asegurar el catéter que debe ser colocado en la arteria. Tener cuidado de no perforar la arteria.</li>
	<li>Coloque dos suturas debajo de la vena porta para asegurar el catéter metálico que va a ser colocado en la vena para la recogida de efluentes de la perfusión.</li>
	<li>Antes de cortar el agujero en la arteria mesentérica, asegúrese de que el catéter que se va a insertar en la arteria es llenado con tampón de perfusión para evitar la formación de embolia de aire.</li>
	<li>Corte un pequeño agujero en la arteria mesentérica usando un par de tijeras quirúrgicas e inserte el catéter plástico inmediatamente después.</li>
	<li>Inmediatamente después de que el catéter ha sido asegurado, iniciar la perfusión del intestino a partir de la bomba de rodillos (caudal = 7,5 mL/min).</li>
	<li>Confirman que los vasos sanguíneos en el intestino gire claros en pocos segundos, y la vena porta se vuelve pálida.</li>
	<li>Inmediatamente después de la perfusión adecuada se ha establecido, corte un orificio de la vena porta, inserte el catéter metal y asegúrelo con la sutura. Nota: El catéter puede ser difícil de lugar pero levantando la vena tirando con cuidado de las ayudas más proximales de la sutura.</li>
	<li>Una vez que los catéteres están en lugar y salida de la perfusión es satisfactoria, mata a la rata por la perforación de la membrana, teniendo cuidado de no arrancar los catéteres.</li>
	<li>Recoge la salida de perfusión durante 1 min y medir el volumen. Empezar las adquisición/grabaciones de la presión de perfusión por haga clic en Ejecutar el experimento en el programa de grabación de presión.</li>
	<li>Cubra el intestino con tejido humedecido para evitar que se reseque durante el experimento.</li>
	<li>Asegúrese de que el extremo distal del intestino no está obstruido por lo que el efluente luminal puede salir, de lo contrario el intestino pasarán a engrosar, desarrollará edema, aumentará la presión de perfusión y salida de perfusión caerá.</li>
	<li>Dejar la preparación durante aproximadamente 30 minutos antes de iniciar el experimento. Nota: Las salidas secretoras de hormonas de la tripa son muy inestables para los primeros 15 minutos de perfusión, por lo que este paso equilibrado es necesario para obtener una línea base estable.</li>
</ol>4. el experimento
<ol><li>Después de aproximadamente 30 min de la perfusión, empezar el experimento por recoger la primera muestra de línea de base utilizando un colector de fracciones. Recoger las muestras en el intervalo de tiempo deseado (por ejemplo, generalmente se recoge cada min, 6.5-7.5 mL) y coloque en hielo dentro de pocos minutos.</li>
	<li>
Inspeccione periódicamente la trampa de la burbuja y, si vacía, llénelo con tampón de perfusión.
	<ol>
<li>Recoger el búfer a través de la polla-válvula de tres vías inmediatamente antes de entrar en el órgano y el catéter insertado en la vena porta (después de que ha sido inundada por el órgano) para confirmar que el órgano está metabólicamente activo. Recoger muestras al inicio y al final del experimento para evaluar viabilidad durante todo el experimento.</li>
		<li>Medir las muestras rápidamente, con un analizador de gases en el sangre automatizado, como contiene más plásticas/jeringas no son totalmente herméticas, dando lugar al intercambio con el aire atmosférico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de 10-15 min de colección de la línea de base, estimular con la sustancia primera. Administrar estímulos intra arteriales con una bomba de jeringa a través de una llave de tres vías (flujo = 0,350 mL/min).</li>
	<li>Realizar estímulos luminales por la inyección de un bolo inicial (2,5 mL/min durante los primeros 5 min) reemplazar la solución salina isotónica que ya está en la luz, seguido por la administración de la solución de prueba de un caudal inferior (0.5 mL/min).</li>
	<li>Para asegurarse de que la luz rápidamente se vacía de sustancia, una vez que el período de estímulo luminal, irrigue el lumen intestinal con solución salina isotónica, aplicando el mismo caudal que el anterior.</li>
	<li>Recoger muestras de línea de base por 15-30 min antes de administra la sustancia siguiente. Dependiendo del Protocolo, 2-3 prueba de estímulos generalmente pueden ser incluidos por experimento. Si el protocolo experimental incluye activación/inhibición de un determinado sitio molecular simultáneamente con la administración de un secretagogo dado, siempre pre-estimular con el activador/inhibidor 10-15 min antes de la administración de secretagogos de Asegúrese de que el sitio molecular es inhibido en el comienzo de la infusión de secretagogue.</li>
	<li>Al final del Protocolo, administrar (5-10 min) un adecuado control positivo para la prueba de capacidad de respuesta de la preparación y recoger muestras de referencia de 10-15 min después del período de estimulación. Nota: Varios prueba de sustancias pueden ser utilizadas como control positivo, por ejemplo, estímulos para el aumento [cAMP] (p. ej., foskolin o IBMX), [Ca2 +] (p. ej., bombesina y neuromedina C) agentes de despolarización (e.g., 30-50 mM KCl) o más estímulos relevantes fisiológicamente como macronutrientes: glucosa, aminoácidos, peptonas, etcetera. Sin embargo, la elección del control positivo depende de los resultados experimentales. Glucosa por ejemplo es un secretagogo de pobres colecistoquinina (CCK) mientras que bombesina no es un secretagogo robusto para insulinotrópico dependiente de glucosa de la secreción de péptidos (GIP)30.</li>
	<li>Tras el final del experimento, suprimir la perfusión intestinal, pesar y medir su longitud. Poner en paraformaldehido y almacene (4 ° C) por posibles más adelante el análisis histoquímico de integridad/daño de tejido, por ejemplo mediante tinción H & E.</li>
</ol>5. bioquímicas medidas
<ol><li>Cuantificar las concentraciones de péptidos secretados en el efluente venoso por medio de un interno o comercialmente disponible radioinmunoensayos (RIA) o análisis de ELISA. Estudios que investigan la absorción intestinal, cuantificar la molécula de interés, por ejemplo,, glucosa o aminoácidos, en el efluente venoso. Nota: La solución es generalmente un buen almacenador intermediario básico para la mayoría de los análisis, incluyendo los análisis que se basa en reacciones enzimáticas (por ejemplo, cuantificación de glucosa por el método de glucoseoxidase).</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Presentar datos de diferentes maneras, por ejemplo como un gráfico de tiempo-concentración que muestra la real salida secretoria (flujo x concentración) y como parcela de la columna que representa la salida durante los períodos de referencia y respuesta (generalmente puntos de tiempo de 10-15) secretora total.</li>
	<li>Parcela la concentración medida real de las hormonas respectivas como unidades de concentración. (pmol/L), Nota: Es preferible en lugar de otro expresar datos como salida (fmol/min) ya que con este modelo, en contraste con estudios in vivo, los valores obtenidos son el producto secretor real (debido a la constante recogida de efluentes de perfusión).</li>
	<li>Dependiendo del número de grupos a ser analizados estadísticamente, emparejado de uso dos colas prueba de t (dos grupos) o unidireccional ANOVA para medidas repetidas (más de dos grupos) seguido de una prueba post-hoc apropiado para comparaciones múltiples.</li>
</ol>

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<li>Bak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+commercially+available+assays+for+glucagon-like+peptide-1+%28GLP-1%29%3A+implications+for+GLP-1+measurements+in+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies.</a> Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).</li>
<li>Jacobsen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gastric+bypass+surgery+on+glucose+absorption+and+metabolism+during+a+mixed+meal+in+glucose-tolerant+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals.</a> Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).</li>
</ol>

Los autores de este trabajo no declaran posibles conflictos de interés relevante a este artículo.

El intestino aislado de rata perfundidos es una herramienta potente que permite la dinámica y mecanismos moleculares subyacentes la secreción de la hormona del intestino que se estudiarán en detalle. El paso más crítico para el éxito de la producción de datos con este modelo es la intervención quirúrgica. Manejo del intestino inevitablemente causará algún daño en el intestino y debe por tanto mantenerse en un absoluto mínimo. Más importante aún, la velocidad de operación es clave, especialmente en el momento de la coloca...

El intestino es el órgano endocrino más grande del cuerpo, produciendo más de 15 diferentes las hormonas peptídicas que regulan la absorción de nutrientes y eliminación de nutrientes, crecimiento intestinal y modulan apetito1. Las hormonas del intestino, por lo tanto, participan en muchos procesos fisiológicos fundamentales, y entender estos patrones de secreción y los detalles moleculares que controlan la secreción de las hormonas respectivas así es importante para nuestra básica fisiológica comprensión y para abordar aspectos traslacionales de la acciones de la hormona del intestino; pero, ¿cómo puede uno estudiar los mecanismos de detección moleculares subyacentes la secreción de la hormona intestinal? En general, la secreción de la hormona puede estudiarse en organismos intactos (los seres humanos o animales de experimentación), preparaciones de intestino aislado o de culturas de célula primaria secretor de hormona del intestino o inmortalizado células culturas2,3, 4 , 5 , 6. nuestro modelo preferido es el intestino aislado de rata perfundidos, que es un modelo fisiológico relevante que permite la secreción de hormonas del intestino que se estudiarán en detalle con una resolución de tiempo óptimo (secreción de tasas se pueden determinar con cualquier tiempo en la base hasta el segundo), y los resultados son probablemente transferibles a una situación en vivo7. Aquí proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo realizar este procedimiento, pero primero vamos a comentar otros métodos para estudiar la secreción de la hormona intestinal, incluyendo los beneficios y limitaciones de estos modelos en comparación con el intestino aislado de rata perfundidos.
Si se desea establecer si un compuesto específico regula la secreción de ciertas hormonas del intestino, estudios en seres humanos son el objetivo final. Así, si un compuesto muestra grandes efectos sobre la secreción de una o varias hormonas del intestino en roedores (en vivo o perfusiones) o de hormonas secretoras células (líneas celulares o células primarias), este efecto sólo es relevante a la medicina y la fisiología humana puede confirmarse en los seres humanos. Sin embargo, hay límites claros para el tipo de estudios que pueden realizarse en seres humanos, y estudios in vivo en animales experimentales suelen ser, por lo tanto, la segunda mejor opción para este tipo de estudios. Ratones y ratas son los animales experimentales más utilizados presumiblemente debido a su tamaño conveniente, bajo costo y la opción de modificar genéticamente los genes sospechados de participar en las preguntas de estudio específico (por ejemplo, golpear de un transportador de algunos o receptor). En general, modelos en vivo se benefician de ser fisiológicamente intacta, pero también tienen varias limitaciones. Lo más importante, el tamaño pequeño de los roedores, especialmente ratones, es un factor limitante, como la mayoría los análisis para la cuantificación de la hormona intestinal requieren por lo menos 20 μl de plasma (y a menudo mucho más), lo que significa que al menos 100 μl de sangre debe ser retirado para hacer un duplicado cuantificación. Por lo tanto, sólo es posible obtener muy pocas muestras correspondientes a las muestras de línea de base y uno o dos post estimulación (el volumen total de sangre en un ratón de 20 g es de ~1.4 mL). En consecuencia, posibles respuestas secretoras (e.g., rápidamente o tardía de las respuestas) por lo tanto puede ser faltada.
En el modelo de perfusión, es superar este problema, como muestra grandes volúmenes se obtienen (caudal: 7,5 mL/min) y los intervalos de colección pueden ajustarse según sea necesario para asegurar que no falten las respuestas rápidas y corta duración (recoge muestras cada minuto)7 . Otro tema con en vivo los estudios en roedores es que la mayoría de las hormonas intestinales es aún más rápidamente eliminado o metabolizada que en los seres humanos8,9,10, que puede complicar el posterior análisis bioquímico. Por ejemplo, hemos demostrado que el GLP-1 se metaboliza en ratones a un ritmo incluso más rápido que en los seres humanos (donde T1/2 es 1-2 min11) y, más importante, que consiste en la separación de GLP-1 en ratones, además de escote N-terminal por dipeptidil-peptidasa-4 (DPP4) (que es la principal enzima degradante de la GLP-1 en los seres humanos), más escote por la enzima endopeptidasa neutral 24.1112. En consecuencia, actuales ensayos comerciales para la cuantificación de GLP-1, que se basan ya sea en la isoforma intacta de la GLP-1 (7-36amide) o el isoform de la DPP-4 troceados (9-39amide), enormemente subestiman la secreción de GLP-1 en ratones y resultan engañosa resultados 12. en el intestino aislado de rata perfundidos, la mayor parte del metabolismo de las hormonas secretadas es eliminado o reducido marcado, ya que se evita la degradación mediada por el plasma, y se previene la extracción o degradación del hígado, riñón, pulmón porque ( solución es de recogida ya que deja el intestino).
Por supuesto, penetración importante puede ser generada por el uso de animales genéticamente modificados, por ejemplo,, sodio glucosa transportador-1 nocaut ratones13, pero requiere de una evaluación detallada de los sensores moleculares implicados en la secreción de a menudo consideración de múltiples sitios moleculares, que van desde transportadores moleculares en canales del ion y de diversos receptores g-proteína-juntados a las proteínas intracelulares. Por ejemplo, hemos dirigido la actividad de los nueve diferentes sitios moleculares cuando desentrañar los sensores moleculares responsables de la secreción de GLP-1 estimula la glucosa7. Una investigación similar no sería posible en vivo como algunos de los compuestos usados tienen inespecíficas o efectos nocivos/letales. Por ejemplo, cuando se utiliza la perfusión intestinal, fue posible evaluar la función del metabolismo intracelular de la glucosa para la secreción de GLP-1 y neurotensin bloqueando la formación de ATP con 2-4-dinitrofenol7,14 , así como el papel de los canales de calcio voltaje-bloqueado de ácidos biliares estimulan la secreción de GLP-1, NT y PYY3. De hecho, el tetrodotoxin de bloqueador de canal de sodio altamente tóxico puede ser aplicado con éxito en los estudios de perfusión. Por último, en el modelo de perfusión se puede ser directamente evaluada donde en el intestino un cierto compuesto estimula la secreción de ciertas hormonas, como el investigador puede simplemente elegir y preparar la región deseada para perfusión, y al mismo tiempo puede ser investigado Si un estímulo provoca secreción mediante la activación de sensores moleculares del lado luminal o vascular del intestino3,15,16.
Los mecanismos secretores de hormona intestinal subyacente también puede ser estudiado por el uso de piezas de tejido del intestino (incluyendo tejidos humanos), hormona de cultivos intestinales primarios (generalmente de ratones), inmortalizadas secretoras de líneas celulares (de ratón o de origen humano), por tripa tejido montada en usar cámaras u organoides (tanto más a menudo de ratones)2,3,4,5,6,17,18. En comparación con perfusiones intestinales, estudios en cultivos celulares primarios, líneas celulares y pedazos de intestino humano son técnicamente fáciles de realizar y son una forma más rápida y más barata de generación de datos, pero por supuesto el estudio de pedazos de intestino requiere acceso al intestino humano fresco muestras. Sin embargo, en estos modelos la polarización normal de las células de la tripa es inherentemente perdida, lo que significa que estos modelos no se puede utilizar para evaluar la activación normal de los sensores moleculares, y también no pueden estudiarse los procesos de la absorción. Por otra parte, estos estudios generalmente emplean incubaciones estática (de hasta varios h) que es altamente no-fisiológico y nada tiene que ver con dinámicas de secreción normal de las células, ya que no se quita el producto secretado y así puede influir en la regeneración la secreción de hormonas. En cambio, en el perfusión del intestino, secretadas y absorbentes moléculas son eficientemente eliminadas mediante la microcirculación mucosa como son en vivo, asegurando que los gradientes de la vía transmucosa se mantienen para que la absorción y la secreción pueden ocurrir a un ritmo normal. Además, pueden haber dedifferentiated cultivos celulares desde su origen células enteroendocrinas nativo, lo que significa que ya no son representante de las células nativas en cuanto a contenido del péptido y la expresión de sensores moleculares, aunque pueden todavía secretan la hormona en cuestión. Esto es, por ejemplo, el caso de GLP-1 células secretoras líneas19.
Por lo tanto, es nuestra opinión que las culturas de célula primaria o célula línea de estudios son más adecuados para fines de investigación y para realizar experimentos de tipos que no pueden ser realizados en vivo o en el intestino aislado perfundido. Por ejemplo, una verdadera fuerza de las culturas de célula primaria y cultivos de la línea de celulares es eso secundario intracelular mensajeros (por ejemplo Ca2 +, campamento, NAD(P)H) puede ser monitoreado en tiempo real, y eléctrico de señalización de la hormona que secreta las células puede ser investiga20,21,22. Además, caída de siRNA puede hacer, que es especialmente útil si inhibidores específicos no están disponibles20,21,22,23,24. Tejido intestinal de los ratones montados en cámaras de usar recientemente se ha utilizado para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes estimulada secreción de GLP-1 ácido de bilis, mientras organitas intestinal (de ratones) y pedazos de intestino humano también han sido utilizados para el estudio de la detalles moleculares de tripa hormona secreción17,25. Mientras que los anteriores beneficios de ser polarizaron2 todos estos modelos implican incubaciones estática. Estudios en piezas del intestino humano, sin embargo, beneficiarán del uso de tejido humano, en lugar de roedores, lo que es importante puesto que la diferencia de especies en la expresión de tejido de receptores 7TM y transportadores moleculares podrán resultar en diferentes vías moleculares de detección entre especies. De hecho, más datos en este campo ha sido generados por estudios en cerdos, ratones o ratas, y sigue siendo difícil de alcanzar si estos resultados pueden ser transferidos a los seres humanos. Sin embargo, es reconfortante que los mecanismos de detección moleculares que subyacen la glucosa estimula la secreción de GLP-1 parecen ser similar entre ratón, rata, hombre, y transcriptómicos y perfiles de peptidomic de ratón y células humanas de L revelaron fuerte global semejanzas entre las dos especies7,18,26,27.
El intestino aislado de rata perfundidos, sin embargo, también tiene algunas limitaciones que deben ser considerados. Lo más importante, es imposible determinar si una determinada respuesta secretora resulta de activación directa por la sustancia de las células productoras de hormonas específicas o, más bien es causada por un mecanismo indirecto. Por ejemplo, KCl al instante aumenta la secreción de GLP-1 de la perfusión del intestino7, pero se desconoce si esto es consecuencia de la despolarización directa de la célula de L o resulta de la despolarización de las neuronas cerca de las células de L o los efectos de simultáneamente lanzó estimuladores/inhibidores de paracrina. Datos derivados de estudios con el perfusión del intestino que pretenden dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la secreción, por lo tanto, siempre se pongan en contexto con datos obtenidos de otros modelos más específicos para aumentar la capacidad de establecer causalidad. Por ejemplo, estimulada por la glucosa la secreción de GLP-1 de la línea celular secreción de GLP-1 GLUTag28,29 y de primario de ratón células de L depende de la actividad de los transportadores de glucosa (SGLT1 y GLUT2). Bloqueo de estos transportadores en el intestino de rata perfundidos también atenúa la secreción20, lo que significa que es probable que glucosa estimula la secreción de GLP-1 es mediada en gran parte por acciones directas de la glucosa en la célula de L. Otra limitación importante del intestino aislado perfundido es que algunos de los lípidos son difíciles de estudiar debido a su hidrofobicidad. Aunque es posible investigar los productos finales de la digestión de lípidos (ácidos grasos, diacil gliceroles, lysophosphatidylglycerols, etc.) y a pesar de la preparación puede ser capaces de volver a esterificar los lípidos intra cellularly y tal vez el paquete en quilomicrones, el transporte de los quilomicrones en las células y su posterior absorción por el quilífero de las vellosidades se interrumpe, ya que el flujo de linfa en el intestino aislado no puede fijarse. Por lo tanto, muy probablemente, absorción de los lípidos se detiene una vez que los productos absorbidos comienzan a acumularse en las células. Los sistemas celulares in vitro son aún menos adecuados para estudios de lípidos debido a su carencia de la polarización. Obviamente, esta limitación sólo es relevante para los lípidos que son absorbidos y transportados vía el quilífero, que los absorben a través de los vasos sanguíneos intestinales suelen ser manejado normalmente.

<table><tbody><tr><td>Productos químicos para tampón de perfusión</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Merck</td><td>1.12018.0500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 x 2 H2O)</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>Pharmacosmos</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de ácido fumárico (C44H2Na2O4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9642</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (C6H12O6)</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio hepatahidrato (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4)</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico sal sódica (C3H3NaO4)</td><td>Merck</td><td>106619</td><td></td></tr><tr><td>Sodio bicarbonato (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamato de sodio monohidratado (C5H8NNaO4 x H2O)</td><td>Merck</td><td>106445</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Perfusion equitmentment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión universal</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>732316 UNIDAD BÁSICA UNIPER UP-100, TIPO 834</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de rodillos, con cuatro canales</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730100</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>732068</tr><tr><td>Circulador termostático, volumen de baño 3L, 230V / 50Hz</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>730125</tr><tr><td>Mesa de operaciones, calefactada sobre soporte de trípode, tipo 873</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>733776</tr><tr><td>Cánula con sol, diámetro exterior = 2,0 mm, diámetro interior = 1,0 mm</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>733313</tr></tbody></table>

mecanismos subyacentes de la secreción de la hormona del intestino utilizando los aislados perfusión intestino de rata

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

El intestino es el órgano endocrino más grande del cuerpo, produciendo más de 15 diferentes las hormonas peptídicas que regulan el apetito e ingesta de alimentos, digestión, absorción de nutrientes y distribución y excursiones de glucosa post-prandial. Comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la secreción de la hormona intestinal es fundamental para entender y traducir la fisiología de la hormona intestinal. Tradicionalmente, los mecanismos subyacentes a la secreción de hormona intestinal tampoco se estudiaron in vivo (en animales o seres humanos) utilizando o mucosa primaria secretor de hormona de tripa cultivos celulares de células. Aquí, presentamos un intestino aislado de rata perfundidos como un método alternativo para el estudio de secreción de la hormona intestinal. Las virtudes de este modelo son que se basa en el intestino intacto, lo que significa que recoge la mayoría de los parámetros fisiológicamente importantes responsables de la secreción en estudios in vivo, incluyendo mucosa polarización, paracrina relaciones y vías de exposición de perfusión/estímulo. Además y a diferencia de los estudios in vivo, el intestino aislado de rata perfundidos permite casi completo control experimental y evaluación directa de la secreción. En contraste con estudios in vitro, es posible estudiar la magnitud y la dinámica de la secreción y para responder preguntas importantes, como qué estímulos provocan secreción de hormonas intestinales diferentes, de qué lado de la tripa (luminal o vascular) es la secreción de estimulado y analizar en sensores moleculares detalle subyacente de la respuesta secretora. Además, la preparación es un poderoso modelo para el estudio de la absorción intestinal y detalles con respecto a la dinámica de la absorción intestinal, incluyendo los transportadores de la responsables.

La capacidad para determinar si un determinado estímulo provoca la secreción de la hormona intestinal de interés se basa en una secreción basal constante. Además, si no hay respuesta al estímulo se observa una respuesta secretora robusta para el control positivo debe ser evidente para excluir que la falta de respuesta al estímulo de prueba no refleja una falta general de capacidad de respuesta. Figura 2A y 2B se muestra un ejemplo de datos de...

Aquí, presentamos un modelo potente y fisiológico para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes la secreción de la hormona intestinal y la absorción intestinal: el intestino aislado de rata perfundidos.

Mecanismos subyacentes de la secreción de la hormona del intestino utilizando los aislados perfusión intestino de rata

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

El método que hemos desarrollado aquí ha resultado ser extremadamente útil en nuestro trabajo, tratando de averiguar los mecanismos moleculares de la secreción de hormonas del intestino, pero también la absorción de nutrientes, y el acoplamiento entre los dos. La principal ventaja de esta técnica altamente fisiológica es que el intestino se deja in situ, mientras que permite estudios detallados que generalmente sólo se realizan dentro de los modelos In Vitro. Primero coloque la rata en una mesa de operaciones calentada, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del final, y haga una escisión de la piel y el peritoneal para exponer la cavidad abdominal.Mueva el intestino delgado hacia un lado para exponer la región terminal del colon. Y ligar la vasculatura de suministro al colon. Extraje gradualmente el colon, comenzando de la región terminal, y moviéndose hacia el intestino delgado, hidratando el tejido con solución salina isotónica, y usando hisopos de algodón para eliminar el tejido conectivo según sea necesario.Cuando se haya eliminado todo el colon, inserte una pieza de 15 centímetros de tubo de plástico en el extremo proximal del pequeño lumen intestinal, y asegure el tubo con suturas. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros y una bomba de jeringa para lavar cuidadosamente el intestino delgado con solución salina isotónica a temperatura ambiente a un caudal de 25 mililitros por minuto. Cuando el tejido haya sido vaciado de quimo, ajuste los tejidos de modo que la arteria mesentérica superior sea accesible y retire el tejido conectivo y el tejido graso para exponer la arteria.Use fórceps de punto fino para colocar dos suturas debajo de la arteria mesentérica y dos suturas debajo de la vena porta. Llene un catéter de plástico de calibre 22 unido a una bomba rodante con tampón de perfusión y utilice un par de tijeras quirúrgicas para cortar un pequeño agujero en la arteria mesentérica, insertando inmediatamente el catéter en la incisión. Inserte el catéter dentro de los dos minutos de cortar un agujero en la arteria, de lo contrario el intestino probablemente sufrirá de daño isquémico.Tan pronto como el catéter se haya asegurado con una sutura, inicie la bomba de rodadura para iniciar la perfusión a un caudal de 7,5 mililitros por minuto. Cuando los vasos sanguíneos en el intestino y la vena porta se vuelvan pálidos, corta un agujero en la vena porta. Inserte un catéter metálico y asegure el catéter metálico con otra sutura.Tenga cuidado al insertar el catéter en la vena porta, ya que la vena está de paredes delgadas. Sin embargo, como la guardia se está perfundiendo, la inserción rápida no es crucial. Después de recoger la salida de perfusión durante un minuto, mida el volumen y haga clic en ejecutar experimento en el programa de grabación de presión para iniciar las grabaciones de adquisición de presión de perfusión.Luego cubra el intestino con un tejido de laboratorio humedecido para evitar que se seque, y confirme que el extremo distal del intestino no está bloqueado, y puede salir un haploid luminoso. Para medir la presión parcial de oxígeno y dióxido de carbono, recoja el tampón de perfusión a través de una válvula de tope de tres vías inmediatamente antes de que entre en el órgano, después de aproximadamente tres minutos de perfusión, y desde el catéter insertado en la vena porta. Coloque las muestras sobre hielo y utilice un analizador automatizado de gases sanguíneos para medir las muestras poco después de la recolección.Utilice un recopilador de fracciones para obtener las primeras muestras de línea base. Después de 10 a 15 minutos de la recolección basal, utilice una bomba de jeringa para administrar el primer estimulante de prueba intraarterial a través de un tope de tres vías a un caudal de 35 mililitros por minuto. Realizar estimulaciones luminales mediante una inyección inicial de boas de estimulación suministrada a un caudal de 2,5 mililitros por minuto durante los primeros cinco minutos de la estimulación, seguida de la administración de la solución de prueba a un caudal de 5 mililitros por minuto.Tan pronto como termine un período de estimulación luminal, enjuague el lumen con solución salina isotónica a un caudal de 2,5 mililitros por minuto durante cinco minutos. A continuación, recoja muestras de línea base a 5 mililitros por minuto durante 15 a 30 minutos antes de administrar la siguiente sustancia de ensayo. Al final del experimento, administre un control positivo adecuado para comprobar la capacidad de respuesta de la preparación durante cinco a 10 minutos, recogiendo y adicionalmente de 10 a 15 minutos de muestras de línea base al final del período de estimulación de control positivo.Aquí se muestra un ejemplo de datos de buena calidad, demostrando péptido-1 o GLP-1 similar a glucagón, secreción de un intestino delgado de rata perfundido aislado recogido en intervalos de un minuto. En condiciones basales, la secreción fue constante mientras que antes y después de la administración del estímulo de la prueba y el control positivo, una respuesta secretora robusta era evidente. Estos datos de secreción de GLP-1 obtenidos de un intestino delgado de rata perfundido aislado son de mala calidad con una secreción inestable medida en condiciones basales que se desvió hacia arriba a lo largo de las pruebas de una manera que parecía no estar relacionada con las administraciones de sustancias de ensayo o con el control positivo.Por lo tanto, es imposible concluir si el aumento de la secreción de GLP-1 observada al final de la estimulación de la fructosa vascular fue una respuesta mediada por fructosa. Al intentar este procedimiento para cuidar los catéteres correctamente y para limpiar a fondo el equipo de perfusión como el tampón de perfusión proporciona un excelente medio para el crecimiento bacteriano. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como estudios in vitro sobre líneas celulares secretoras de hormonas de cultivos celulares intestinales primarios, para investigar directamente la producción intracelular de AMP cíclico o calcio intracelular.Así que ya hemos utilizado el método ahora para la elucidación de una serie de procesos detrás de la absorción de nutrientes y el mecanismo de secreción de las hormonas y ha resultado ser extremadamente útil. No olvide que trabajar con bloqueadores o activadores de sitios moleculares puede ser extremadamente peligroso y precauciones como el uso de una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad, siempre se debe tomar una campana de humo mientras se realiza este procedimiento.

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