Name: Prueba de enfoque in-pen no invasiva para cerdos alojados en laboratorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprende a realizar la prueba de aproximación humana en el corral de los cerdos para detectar déficits funcionales tras lesiones cerebrales subconcusivas. Este método no invasivo reduce el estrés animal y mejora el bienestar en investigación de neurotrauma.

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Los autores desean reconocer la financiación de la Oficina de Investigación Naval (Grant #12166253). Además, los autores agradecen amablemente al personal de cuidado de animales, veterinarios y estudiantes de la Universidad Estatal de Kansas y Virginia Tech por su apoyo durante el trabajo animal. Los autores también quisieran agradecer a Nadége Krebs por su asistencia técnica, y a los estudiantes Shelby Stair, Sarah Greenway y Mikayla Goering por su asistencia técnica y cuidado adicional de los animales.

El IACUC individual en cada ubicación (Universidad Estatal de Kansas y Virginia Tech University) aprobó el uso de instalaciones y procedimientos.
1. La configuración de las cámaras y bolígrafos y el establecimiento de una
<ol><li>Antes de colocar a los animales en sus plumas, fije las cámaras en un ángulo de 90o sobre cada pluma (consulte la Tabla de materiales para obtener un sistema de cámara sugerido).</li>
	<li>Grabar animales continuamente a 30 fotogramas /s (fps), ya sea durante el estudio o sólo durante las sesiones de prueba.</li>
	<li>Fije cuencos, resaparadores, esteras y juguetes con pernos y cadenas.</li>
	<li>Coloque las máquinas de sonidoque reproducen continuamente ruido blanco o rosado (por ejemplo, el sonido de las cascadas) en las instalaciones de los cerdos. NOTA: Los ruidos repentinos externos (por ejemplo, la apertura y el cierre de puertas) pueden causar un reflejo de sobresalto durante las sesiones23,24.</li>
	<li>Aleatorizar o estratificar los tratamientos por pluma en toda la instalación.</li>
	<li>
Establecer una rutina de cría de animales establecido. Esto ayudará a los cerdos a saber cuándo esperar que los humanos limpien las plumas, las alimenten y manipulen, y realicen la prueba.
	<ol>
<li>Usa un regalo familiar para permitir que los cerdos asocien a los humanos con una recompensa.</li>
		<li>Usa un clicker durante la recompensa para permitir que los cerdos asocien el sonido de clic con una recompensa. No utilice vocalizaciones ni señales visuales para familiarizar a los cerdos con la recompensa (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lleve a cabo las sesiones antes de la comida de la mañana o antes de colocar un nuevo alimento para cerdos alimentados con libitum ad libitum.</li>
</ol>2. Identificación de los Cerdos
<ol><li>Haga que los sujetos sean identificables en la fuente de vídeo, incluso si son de una sola casa.</li>
	<li>Asegúrese de que los observadores permanezcan ciegos a los tratamientos e imparciales durante la marca de tiempo con un sistema de marcado que no esté relacionado con los tratamientos. Utilice una cinta de grado médico (consulte Tabla de materiales)que se adhiera a una tira de cinta adhesiva de un color específico, forma redonda y patrón.</li>
	<li>Utilice un parche redondo para marcar la parte superior del cerdo y uno hacia abajo de cada lado (consulte la figura1, marcadores verdes y azules).</li>
	<li>Unta el cemento de etiqueta (menos de 0,35 g) en las esquinas de la cinta para ayudar a aumentar la longevidad de la adherencia. NOTA: Demasiado cemento de etiqueta no se secará muy rápidamente, haciendo que la cinta se caiga prematuramente.</li>
	<li>Solucionar problemas y personalizar la estrategia de marcado durante el período de aclimatación para que las pruebas oficiales se realicen de manera eficiente y sin mayor estrés a los cerdos.</li>
	<li>Utilice hojas de recopilación de datos para realizar un seguimiento de las marcas y la identificación del sujeto (consulte Archivo suplementario 1 para obtener una hoja de datos de ejemplo). NOTA: Para quitar la cinta, no rasgue la cinta porque causará dolor si se extrae algún cabello. Puede desprenderse por sí solo, un lubricante a base de agua puede ayudar a desalojarlo, o se puede afeitar con cortadoras. Si la cinta se desprende en momentos no deseados, prepare cinta adhesiva adicional y vuelva a aplicarla mientras el cerdo está comiendo una comida en lugar de restringir al cerdo.</li>
</ol>3. Sesiones HAT
<ol><li>Haga que los humanos de prueba usen el mismo sombrero, tapa, botas, olores, etc. cada vez que se lleve a cabo la sesión.</li>
	<li>Realizar sesiones diarias, al menos 3 veces, antes del tratamiento y, luego, todos los días a partir de entonces.</li>
	<li>El cerdo puede estar en cualquier área de su pluma antes de comenzar la sesión. Para comenzar la sesión, pida al test-humano que deje caer la golosina en el tazón o delante de la pluma y haga clic en el clicker 3x.</li>
	<li>Los humanos de prueba necesitan poner sus manos fuera de la vista del cerdo y permanecer inmóviles durante la prueba. Pida a otro investigador que marque el inicio de la sesión en la hoja de datos e inicie un temporizador. Después de 120 s, el investigador señala silenciosamente al test-humano para pasar al siguiente sujeto y reiniciar la prueba.</li>
</ol>4. Establecimiento de etogramas HAT para software
<ol><li>Construir etogramas (ver Figuras 1 y 2 y Vídeo Suplementario 1) bajo un proyecto utilizando software especializado. NOTA: Los comportamientos espaciales son la ubicación del animal en relación con el ser humano. En los etogramas, las relaciones espaciales deben personalizarse en la pluma del animal y publicarse cada vez que se utiliza una nueva configuración de la pluma (Figura1). Dentro de esta categoría, los comportamientos se consideran mutuamente excluyentes. El espacio se divide en cuatro áreas, con diferentes niveles de enfoque (Figura1). Las áreas están estandarizadas en todos los tipos de alojamiento. Más cerca, o subir (Cl) significa que los cerdos pueden subir a la valla para tener acceso al ser humano; por lo tanto, la escalada se considera un comportamiento espacial que indica que el cerdo está buscando más activamente el contacto humano. Close (Co) denota el área dentro de 61 cm del ser humano. Mid (M) es el área dentro de 61-122 cm del ser humano. Lejos (F) es el área de 123 cm o más del ser humano.</li>
	<li>
Los comportamientos estructurales se centran en la orientación de todo el cuerpo o partes del cuerpo (Figura2). Crear dos categorías estructurales: 1) la posición de la nariz de cerdo y 2) el estado activo del cerdo. Utilice la Figura 2A para identificar la direccionalidad (la dirección 1 denota que el cerdo dirige su nariz hacia el ser humano; la dirección 2 significa que el cerdo dirige su nariz lejos del ser humano).</li>
	<li>Divida los comportamientos de actividad (Figura2B)en tres estados de enfoque mutuamente excluyentes: NNOB, stand o walk sin NNOB y descansando sin NNOB (consulte la codificación de color en los etogramas del video). NOTA: NNOB se utiliza para describir cuando un cerdo está usando su boca, hocivo o cara para lamer, oler, masticar, morder, frotar o rootear un objeto no nutritivo para buscar familiaridad o oportunidades novedosas. Por lo tanto, cuando está en este estado activo, está interesado en el ser humano, y en un estado de aproximación. Si las cámaras aéreas se utilizan en ángulos de 90o, la posición de la nariz del cerdo y el movimiento de la cabeza son indicadores de NNOB. Ocasionalmente, los cerdos chomp o sham-chew; la nariz se puede ver, pero la cabeza se mueve hacia arriba y hacia abajo. Pararse o caminar sin NNOB se utiliza para describir cuando el cerdo está en posición vertical, la cabeza está quieta, y la nariz no está tocando un sustrato o chomping, lo que significa que está en un estado menos de aproximación. Descansar sin NNOB se utiliza la describe cuando el cerdo está descansando acostado o sentado, que es el estado de menor acercamiento bajo esta categoría de comportamientos.</li>
</ol>5. Marca de tiempo de los vídeos para la eficiencia y la fiabilidad
<ol><li>En función de las horas de inicio grabadas por el recopilador de datos, edite el material de archivo en sesiones exactas de 3 minutos. El método de marca de tiempo tardará 9 minutos por sesión.</li>
	<li>Utilice solo hasta dos observadores entrenados para hacer una marca de tiempo de los vídeos. NOTA:: Si se utilizan dos observadores, la variación intraobservador debe cuantificarse, evaluarse, ajustarse y notificarse como coeficiente de correlación de Pearson después de que los observadores hayan realizado la marca del mismo vídeo de muestra (para los métodos, véase Martin y Bateson25).</li>
	<li>Ajuste la velocidad de reproducción a una velocidad regular de 1x (es decir, 30 fps). No pausar, rebobinar o marca de tiempo fotograma a fotograma.</li>
	<li>
Marca de tiempo de cada categoría de comportamientos mutuamente excluyentes por separado.
	<ol>
<li>Comportamientos espaciales demarca de tiempo . Reinicie el vídeo.</li>
		<li>Comportamientos estructuralesde marca de tiempo . Reinicie el vídeo.</li>
		<li>Marca de tiempo para comportamientos estructurales/de posición de nariz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice la duración de cada resultado de comportamiento (consulte Videos suplementarios 2 y 3) para resumir datos. Las mediciones de duración deben convertirse en un porcentaje de tiempo por categoría.</li>
</ol>6. El índice de aproximación
<ol><li>Aplique la fórmula (Figura 3) para que cada comportamiento estructural y espacial se combine para crear una IA (Figura3, Figura 4). La IA se utiliza además de los comportamientos de notificación y categorías por separado como figuras (Figura 5) o en forma tabular. NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener más información sobre el software. Dentro de cada categoría, las duraciones de comportamiento se convierten primero en porcentajes (la duración de los comportamientos dividido por la duración total de la sesión de prueba). Cada comportamiento se pondera en función del nivel de enfoque (Figura 3). Comportamientos de evitación (el porcentaje de tiempo en el área lejana, descansando, con la nariz alejada) se multiplican por 0. Comportamientos de enfoque moderado (el porcentaje de tiempo en el área media, girado hacia el humano, y de pie con la cabeza quieta) se multiplican por 1. El mayor nivel de comportamientos de aproximación (el porcentaje de tiempo en el área cercana y cercana y que muestra NNOB) se multiplica por 2. A continuación, cada categoría se pondera aún más 3, 2 y 1 para el espacio, la orientación de la nariz y la actividad, respectivamente. Se aplica una constante (0,10) para crear una escala de porcentaje. Por ejemplo, si el cerdo se enfrenta al humano, se encuentra en el área más cercana/cercana y realiza NNOB durante toda la sesión de prueba, tenga en cuenta que la IA es del 100% (el cerdo rojo en la Figura3). Por el contrario, si el cerdo está en la zona más lejana, no está frente al humano, y permanece en la posición de reposo durante toda la sesión de prueba, la IA es 0% (el cerdo negro en la Figura 3). Los cerdos en la zona cercana pueden tener la misma IA que un cerdo que realiza NNOB en la zona media si se alejan del ser humano y están de pie con la cabeza quieta (los cerdos naranjas en la Figura3).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las lesiones leves en el cerebro que no resultan en cambios anatómicos y estructurales y ondificantes detectables con imágenes de última generación pueden ser difíciles de identificar y tratar28. Sin embargo, los pacientes con mTBI son especialmente vulnerables a insultos adicionales que pueden causar daños significativos en el cerebro, y por lo tanto, es importante que esta población sea identificada. Las pruebas conductuales desarrolladas en un modelo de mini-cerdo de mTBI son especialmente relevantes para los pacientes humanos mTBI porque los cerdos tienen una fisiología similar a los humanos y expresan estados afectivos similares, como la anhedonia8,9,10 ,20. Aquí, hemos desarrollado una prueba conductual no invasiva, en la pluma (el HAT), y hemos demostrado que es lo suficientemente sensible como para distinguir los cerdos mTBI de los cerdos falsos. Además, se desarrolló un índice ponderado (la IA) para comportamientos observados durante el HAT que son omnipresentes entre los tipos de vivienda y cerdo.
Modificaciones y solución de problemas:
Las metodologías para el HAT se establecieron sobre la base de las directrices de etología25 yvarias estrategias de ensayo y error para mejorar la fiabilidad, repetibilidad y validez de la prueba 6. Las medidas de fiabilidad ayudaron a identificar las fortalezas y limitaciones de la prueba. La fiabilidad define hasta qué punto la medición es repetible y consistente y libre de errores aleatorios28,29. Hemos informado previamente sobre la fiabilidad intra e interobservador del HAT, y con los etogramas estructurales adicionales, las relihabilidades son igualmente altas (R2 > 0,90) de Pearson para la duración6. Las medidas de frecuencia y latencia requieren observadores capacitados, mientras que las medidas de duración son menos dependientes de los observadores y, por lo tanto, más fiables en todos los laboratorios30.
La fiabilidad dentro de un laboratorio y la repetibilidad en todos los laboratorios dependen de los métodos. En nuestro laboratorio, el sistema de vídeo grabado continuamente, los archivos se almacenaron inicialmente como archivos de 5 minutos, y algunas sesiones HAT se produjeron a través de dos archivos. Se cometieron menos errores cuando se utilizó la hora exacta de la hoja de datos para recortar y combinar los videos. Antes de desarrollar el etograma, se permitió a los observadores pausar, detener y rebobinar el material de archivo de vídeo para marcar la hora de todos los comportamientos en todo el etograma. Este método no sólo causó variación en la marca de tiempo de cada muestra, que oscilaentre entre 3 min y 20 min, sino que la confiabilidad entre y dentro del observador también era pobre para la mayoría de los comportamientos. Por lo tanto, establecemos la velocidad de reproducción y tuvimos observadores marca de tiempo cada categoría a la vez. Por lo tanto, cuando la fiabilidad era baja en una sola categoría, los observadores retimestamparon independientemente solo la categoría en lugar de todo el ethogram, después de consultar las definiciones y el material de archivo juntos. Los métodos set playback y category permitieron una predicción coherente de cuánto tiempo se necesitaba para hacer una hora de tiempo en cada muestra. Para los proyectos que abarcan más de un mes, es importante medir la revisión rutinaria de los vídeos codificados y la fiabilidad dentro del observador.
Otro factor que reduce la fiabilidad y la repetibilidad es la configuración de vídeo. Inicialmente, se utilizaron una cámara de mano y un trípode, que se movieron de la pluma a la pluma. Cuando se utilizó este método, los cerdos necesitaban ser introducidos en el trípode y la cámara antes del HAT; de lo contrario, los cerdos parecían reaccionar al trípode y el movimiento más que al humano de prueba. Además, los ángulos de cámara no sobrecargados limitaron la vista del observador durante la marca de tiempo y la percepción de profundidad del espacio aumentó la variación dentro y entre observadores en las medidas de comportamiento espacial; por lo tanto, desarrollamos el protocolo con cámaras fijas. Cuando se utiliza este método, se necesita un cuidado adicional para asegurarse de que la cámara se coloca correctamente antes de cada prueba, y se necesita más tiempo para la configuración entre la sesión de cada cerdo. Sin embargo, nos enteramos de que el sistema de sobrecarga de vídeo continuo necesitaba iniciar su grabación inicial a medianoche al menos 24 horas antes del primer HAT. La visualización de la marca de tiempo para muchos sistemas de vídeo no es precisa y está sincronizada con el fotograma; por lo tanto, ya no dependemos de los tiempos de visualización. Los inicios de medianoche permiten la captura exacta de fotogramas y la edición de vídeo, y no se utilizó la visualización de la marca de tiempo.
Además, la aclimatación de los cerdos y la configuración de una rutina era importante a la hora de solucionar este problema de esta prueba. En imágenes de cerdos que no estaban bien aclimatados a sus ambientes, se observó ritmo durante el HAT. Este es un indicador de que el cerdo puede estar en un estado agitado31 en lugar de en un estado exploratorio32. Los períodos de aclimatación de tres o más semanas pueden reducir el número de cerdos que aceleran en un experimento. Sin embargo, si el ritmo persiste a lo largo de todos los períodos de muestreo, este etograma puede necesitar ser ajustado para incluir paseos y permanecer quieto.
La validez es la medida en que una medida representa el alcance previsto de la pregunta que se formula25. Al desarrollar por primera vez el HAT, usamos sólo un etograma espacial. Las definiciones de comportamiento etograma espacial describen con precisión y específicamente la proximidad a los sujetos humanos y le dicen al observador directamente cuánto espacio deja el cerdo entre sí y un humano. Sin embargo, una vez que estos métodos son necesarios para ser aplicados a una nueva configuración de laboratorio, reconocimos que los etogramas espaciales son específicos del laboratorio. Las dimensiones de la pluma y la colocación de otros objetos influyen en el resultado del etograma espacial; por lo tanto, será necesario publicar un diagrama con medidas y detalles de la pluma si la configuración de la pluma no se ha notificado previamente. Además de informar sobre el entorno de la pluma, los comportamientos estructurales se agregaron al etograma. A diferencia de los comportamientos espaciales, los comportamientos estructurales se pueden evaluar más fácilmente en todos los laboratorios; estos comportamientos tienen validez porque describen específicamente el nivel de estado activo del cerdo. Cuando un cerdo está descansando, es probable que no esté motivado para acercarse y es incapaz de cambiar de posición para acercarse tan rápido como un cerdo de pie. Del mismo modo, un cerdo que muestra NNOB está en un estado exploratorio, pero un cerdo con la cabeza quieta mientras está de pie es más probable en un estado catatónico. La orientación de la nariz ayuda con la validez porque la nariz, las orejas y luego los ojos son lo que el cerdo utiliza para recopilar información sobre el ser humano.
Limitaciones de la Técnica:
Una preocupación potencial con esta técnica es la variabilidad en las respuestas de los cerdos al test-humano. Además, los cerdos mirarán las manos del humano de prueba, lo que puede causar indicaciones involuntarias por parte de esa persona. Por lo tanto, estas limitaciones se expresaron mediante la prueba experimental de 1) las respuestas de los cerdos a un ser humano familiar y desconocido, y 2) estandarizando que, después de que el pellet se deja caer, los puestos humanos de prueba se detienen y colocan sus manos fuera de la la vista del cerdo. Los datos mostraron que no hubo tratamiento o tratamiento x diferencias de tiempo durante el HAT (Tabla 2), lo que sugiere que el HAT podría ser administrado por seres humanos familiares o desconocidos. Otros investigadores sugieren que los cerdos tienden a generalizar sobre los seres humanos sobre la base de interacciones anteriores11,12,13; por lo tanto, las experiencias previas de un cerdo con los seres humanos deben ser positivas. Este desafío también se puede remediar con un diseño experimental vigilante; para cada bloque, se necesita un número suficiente de unidades experimentales representadas para cada tratamiento de interés.
En este estudio, aunque sólo había dos observadores experimentados marcando la marca de todos los videos para los tres tipos de alojamiento, hubo diferencias entre los tipos de alojamiento para resultados de comportamiento específicos (Tabla1). Por ejemplo, los cerdos de la vivienda tipo B entraron en la zona más cercana con más frecuencia que los de las clases de alojamiento A y C. Esto es probablemente debido a una diferencia en el material de la pluma; en la carcasa tipo B, la parte delantera de la pluma era una puerta ligada a una cadena con barras horizontales que permitían al cerdo subir la puerta durante el HAT. Los tipos de carcasa A y C, por otro lado, tenían barras verticales y menos superficies horizontales para que los cerdos se subieran. Esta variabilidad se puede remediar añadiendo el gasto de duración en las áreas cercanas y más cercanas antes de compararlas entre los tipos de vivienda (Tabla 1; P > 0,10). Sin embargo, los cerdos de la vivienda tipo C pasaronmás tiempo en la zona más alejada que los de los tipos de alojamiento A y B (Tabla 1; P < 0.05), que probablemente se debió a la colocación de riegoes en la parte posterior de la pluma en lugar de en la parte delantera de la pluma. Esta es una limitación que se puede remediar si los laboratorios deciden estandarizar la colocación de regaderos, cuencos y juguetes y asegurarse de que estén fijos para que el cerdo no mueva el objeto a otra área.
Esta prueba tiene una gran accesibilidad para laboratorios de todo tipo, pero, como se mencionó anteriormente, el etograma espacial estampado manualmente y las mediciones variarán más entre los laboratorios. Sin embargo, los etogramas estructurales del cuerpo y la cabeza son omnipresentes. Los laboratorios que tienen acceso a un seguimiento automatizado y validado para cerdos pueden beneficiarse al tener el ethogramespacial rastreado automáticamente en lugar de manualmente porque la distancia movida y la tasa de movimiento pueden ser resultados adicionales de las medidas de comportamiento de el HAT. Las limitaciones de la configuración en la pluma y las tecnologías tradicionales en lugar de las áreas de prueba y las tecnologías de seguimiento automático pueden solucionarse mediante la adaptación de la fórmula de IA. La IA proporciona mediciones estandarizadas y terminología de cómo los cerdos individuales utilizan su espacio de pluma y expresan interés en un ser humano. Este cálculo, derivado de medidas de comportamiento comunes, es sensible a los modelos porcinos de mTBI subconcusivo y, posiblemente, otros estados de lesión subclínica o enfermedad. Además, la IA reduce las variaciones aleatorias durante la experimentación y puede compararse más fácilmente entre experimentos y laboratorios que los métodos que se basan en mediciones más específicas del experimento. Los comportamientos estructurales proporcionaron la base para esta fórmula, porque estos comportamientos son mediciones estándar en todos los tratamientos, mientras que los comportamientos espaciales dependen de la configuración de la pluma, el número de cerdos en un lápiz y el sistema de seguimiento. Por ejemplo, observamos que cuando dos cerdos sanos son probados en un bolígrafo, realizarán comportamientos espaciales similares acercándose juntos, pero el cerdo que sigue al primero puede orientar su nariz más hacia su pequera que hacia el humano y expresar más NNOB , porque el cerdo que lleva sirve como centinela. Sin embargo, la IA ayuda a reducir esta variación incluso de comportamientos emparejados.
Aunque la IA es un excelente conjunto de herramientas para estandarizar la prueba en todos los laboratorios, los investigadores todavía pueden querer examinar los resultados de comportamiento específicos de la prueba dentro de un laboratorio o experimento, especialmente si tienen suficiente potencia (es decir, unidades experimentales y pruebas repetidas) en un solo experimento. Por lo tanto, la Tabla 1, que contiene todos los resultados del comportamiento, la varianza, la distribución y una prueba calculada para el número de animales para cada comportamiento específico, se incluyó aquí. Por ejemplo, si los investigadores tienen entornos de pluma que permiten a los cerdos subir constantemente durante el HAT y saben que su tratamiento causa más de una diferencia del 75% en los comportamientos de escalada, entonces pueden justificar el número de animales en función de la varianza medida. Si se añaden nuevos comportamientos al etograma, los científicos tendrán que justificar qué comportamientos son indicativos de enfoque o retirada antes de incorporarlos al índice. Por ejemplo, si la mayoría de los animales dentro de un ritmo de experimento a lo largo de las paredes de la pluma (es decir, thigmotaxis)32, la duración de este comportamiento podría incorporarse a la categoría de etograma estructural del cuerpo. El comportamiento podría representarse en el gráfico de barras apiladas detallado (es decir, la figura5) o en la forma tabular y, a continuación, se puede resumir con stand-still antes de aplicar el cálculo del índice. La IA, por lo tanto, puede representar comportamientos que son omnipresentes entre los laboratorios, pero los comportamientos únicos adicionales todavía se pueden representar por separado.
Importancia con respecto a los métodos existentes:
Se establecieron los métodos existentes para la HAT para que los cerdos de las granjas comerciales evaluaran el bienestar animal. Aquí, se ha establecido un protocolo para cerdos de laboratorio, que puede ayudar a los investigadores a evaluar el bienestar animal y distinguir los cerdos mTBI de los cerdos tratados con farsa. Una prueba tradicional alternativa podría ser utilizar una prueba de campo abierto. Esta prueba se utilizó anteriormente para evaluar la emocionalidad y el bienestar del cerdo33. Las pruebas de campo abierto fueron diseñadas originalmente para probar los estados afectivos de los roedores midiendo su aversión natural al espacio abierto y la luz. Por el contrario, los cerdos sanos pueden ver los mismos estímulos que los10appetitivos, y después de una enfermedad, lesión o tratamiento de estrés, es probable que expresen miedo. Esta prueba requiere más espacio de laboratorio y requerirá que los cerdos se aclimaten a ser manipulados y colocados en un campo abierto. Si los laboratorios tienen espacio y existen protocolos para el manejo de los cerdos, las sesiones repetidas de HAT, además de una prueba de campo abierto, pueden ayudar a distinguir aún más a los animales tratados de los animales tratados con esham.
Pasos críticos dentro del protocolo:
Los tres primeros pasos del protocolo son los más críticos para las medidas HAT exitosas. Las sesiones por cerdo solo tardan 3 minutos; sin embargo, una preparación adecuada ayudará a que esta prueba sea confiable. Como se indicó anteriormente, la ubicación de la cámara y la configuración de grabación es crucial para la claridad y la replicación. Los ángulos de cámara incorrectos pueden limitar la visión del observador, lo que añadirá errores a las mediciones. Otro paso a menudo pasado por alto es la fijación de los objetos en la pluma. El cerdo moverá objetos no fijos, y esto puede afectar su motivación para acercarse al ser humano. El sistema de configuración y gestión es importante porque los cerdos deben aclimatarse a sus entornos antes de poder realizar la prueba de forma coherente. Los cerdos que no están bien aclimatados a sus bolígrafos caseros o rutina o que están experimentando estrés defecarán en otras áreas en lugar de en la parte posterior de la pluma34. El área de defecación puede afectar su motivación para acercarse. Desde la vista de la cámara, el observador debe ser capaz de identificar cerdos individuales; sin embargo, es importante que el esquema de marcado no proporcione información sobre el tratamiento del animal, ya que esto sesgará al observador25.
Identificar cerdos es muy importante para obtener los datos de comportamiento correctos para el cerdo adecuado, incluso cuando son de una sola casa. Los cerdos a menudo son movidos para sus tratamientos, y una marca reasegura al observador que están observando el mismo cerdo después de que ha sido removido y colocado de nuevo en su pluma. Los cerdos pueden ser alojados en parejas, como en la vivienda tipo C, y por lo tanto, se vuelve muy importante identificar a los cerdos. Las pinturas y marcadores de marcado de ganado requieren aplicación diaria; por lo tanto, este protocolo requiere el uso de una cinta de grado médico y un frotis de cemento de etiqueta. La cinta se pega mejor a los cerdos con el pelo más largo. Los cerdos con el pelo corto y la piel seca se desprenden de la cinta con más frecuencia que los cerdos con el pelo más largo.
Aplicaciones futuras:
En resumen, la prueba DE HAT en la pluma no invasiva que se describe aquí es lo suficientemente sensible como para detectar cambios dependientes leves y temporales en cerdos después de mTBI. Además, hemos desarrollado un índice ponderado llamado IA para evaluar los cambios en los cerdos alojados en diferentes tipos de plumas, así como en diferentes tipos de cerdos. Aunque el HAT se ha utilizado para detectar cambios en los cerdos expuestos a mTBI, esta prueba de comportamiento puede ser útil para detectar cambios de comportamiento medibles en animales que experimentan estrés o condiciones prepatológicas.

MTBI humano se define a menudo por déficits funcionales a pesar de la ausencia de cambios estructurales globales o edema significativo en el cerebro1,2,3. De hecho, en algunos pacientes mTBI, la característica característica de esta lesión es un cambio en su estado psicológico en ausencia de cualquier cambio neuroanatómico4,5. Utilizamos un modelo porcino de mTBI6 porque los cerebros de cerdo están anatómica y fisiológicamente más cerca de los seres humanos que los roedores7,y las mediciones correspondientes podrían proporcionar un conjunto relevante de elementos de datos comunes con los seres humanos.
En los últimos años, el modelo porcino ha ganado el interés de los científicos del neurotrauma y las partes interesadas del mTBI para las investigaciones preclínicas; sin embargo, a diferencia de los modelos de roedores de TBI, sólo hay algunas pruebas de comportamiento estandarizadas publicadas que permiten la evaluación del estado afectivo del cerdo de laboratorio (es decir, estado psicológico)7,8,9, 10. Un objetivo a largo plazo para nuestro laboratorio es desarrollar varios conjuntos de herramientas conductuales complementarias que sean lo suficientemente sensibles como para medir cuando los cerdos están experimentando enfermedad subclínica o cuando los animales están en un estado prepatológico relacionado con el estrés.
Las pruebas de comportamiento repetidas que miden el cambio de estado afectivo en un cerdo de laboratorio pueden ser buenas candidatas para distinguir a un animal con una condición prepatológica de los animales sanos. Por ejemplo, se utilizaron HAT en la pluma para la producción comercial de cerdos para ayudar a los agricultores a seleccionar cerdos sanos con buen temperamento o modificar estrategias de gestión y vivienda que causaron angustia, lesiones y enfermedades11,12. Estas pruebas se utilizaron para cuantificar la motivación y el estado afectivo general de un cerdo o un grupo de cerdos13.
Nuestro laboratorio y otros investigadores midieron la motivación en los cerdos mediante la cuantificación de tres categorías de comportamientos: 1) estados exploratorios que se expresan a través de comportamientos orales no nutritivos (NNOB), donde el cerdo utiliza su boca, hocico, o cara para oler, lamer, masticar, y enraizar un sustrato, o picar sin un sustrato14,15; 2) relaciones espaciales del cerdo con un objeto o tener16años; 3) dirección de la nariz, que se utiliza en lugar del contacto visual porque los cerdos tienen visión monocular17,pero miope, y priorizan su sentido del olfato sobre la visión18. Si un cerdo sano asocia a los humanos con estímulos gratificantes, expresan una alta frecuencia de NNOB, dirigen su nariz hacia el ser humano, y buscan acercarse más a los humanos11,16. Sin embargo, después de la enfermedad, lesión, o una experiencia angustiosa, la motivación para buscar incluso estímulos placenteros se reduce, y por lo tanto, estos comportamientos medibles son probablemente reducidos19. Los investigadores de comportamiento porcino señalaron que la anhedonia, la falta de motivación para experimentar estímulos placenteros, es reconocible y medible en cerdos dentro de sus ambientes domésticos20. Por lo tanto, los HAT repetidos (antes y después del tratamiento) pueden servir como medida sensible para distinguir los cerdos de laboratorio tratados con mTBI subconcusivo de sujetos tratados con farsa (solo anestesia). La anhedonia es un estado afectivo que los pacientes con TBI pueden experimentar21. El HAT utilizado aquí tiene el potencial de ayudar a agilizar la traducción de los hallazgos conductuales de un modelo animal al trabajo clínico. Los THA se pueden administrar diariamente en el transcurso de un experimento, que también puede ayudar a estandarizar el cuidado de los cerdos de laboratorio para optimizar el bienestar animal y la cría22.
Aquí, usando el HAT, se sondean las diferencias de comportamiento resultantes de mTBI en mini-cerdos. Minimizar la variabilidad conductual se logró mediante la utilización de medidas no invasivas del HAT y permitiendo que los cerdos se aclimataaaaaa a sus bolígrafos caseros, manejo de rutina y un placer diario. Tradicionalmente, un campo de prueba se utiliza para medir comportamientos (por ejemplo, prueba de campo abierto). Una prueba en la pluma puede ser útil en laboratorios que tienen espacio limitado. Mover y manipular cerdos en una arena de prueba puede causar una respuesta de tensión (angustia o eutata) y potencialmente aumentar la variación de las respuestas a la prueba. Una prueba en la pluma elimina ese componente de manipulación y, por lo tanto, probablemente reduce la variación de la tensión de manipulación17. Por estas razones indicadas anteriormente, desarrollamos un HAT diario en la pluma para este modelo mTBI.
Las medidas estandarizadas y cuantificadas que definen adecuadamente el estado afectivo del animal son aspectos importantes en el desarrollo de una nueva prueba de comportamiento. Además, las pruebas deben ser repetibles en varios laboratorios. Aquí, para el desarrollo de este protocolo, el HAT fue probado en tres sistemas de vivienda diferentes de laboratorios. Se crearon tres subethogramas para marcader comportamientos específicos de vídeos de muestra. A continuación, se creó una fórmula ponderada para incorporar los tres etogramas y permitir el uso de HATs en múltiples laboratorios. Aunque esta prueba fue desarrollada y utilizada específicamente para minicerdos tratados con mTBI subconcusivo, los métodos y el protocolo desarrollados aquí tendrán aplicaciones para distinguir la diferencia entre un cerdo subclínicamente lesionado/enfermo o en apuros y un cerdo sano.
Los resultados del comportamiento pueden ser influenciados por la vivienda de un solo frente al grupo, la asignación de espacio libre, el tipo de piso utilizado, el tipo de cerca utilizada, la ubicación de la alimentación y el agua, el área de defecación y la ubicación de enriquecimiento ambiental. Por lo tanto, seexaminaron tres tipos de viviendas (Figura 1): el tipo de vivienda A se encontraba en la Universidad Estatal de Kansas (Manhattan, KS); vivienda tipo B y C fueron en Virginia Tech University (Arlington, VA). El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en cada lugar aprobó el uso de las instalaciones y procedimientos.
Para el desarrollo del etograma de la vivienda tipo A (Figura1A),Mini-cerdo sintero -cross de Minnesota (boars 7, dorado a 1; Centro Nacional de Recursos de Investigación porCina, Columbia, MO; la edad de 25,6 a 3,66 años [media de desviación estándar (SD)] se alojaba en interiores en bolígrafos individuales con pisos aptos para animales (IACUC #3881). A los cerdos utilizados para este protocolo se les adeleaba no se les aplicaban tratamientos. Para el desarrollo del protocolo para la vivienda tipo B, los minicerdos de Yucatán (edad 25,3 a 2,80 semanas [media de SD] fueron de una sola casa (Figura 1B)en las instalaciones de Virginia Tech (IACUC #15-060). Los tratamientos en animales se describen en otros lugares29 e incluyen la inducción de mTBI subconcusivo mediante sobrepresión de ondas explosivas o controles falsos (solo anestesia). Para el desarrollo del protocolo de la vivienda tipo C, cinco hembras de mini-cerdos de Gotinga (edad 23,7 a 1,18 semanas [media de SD]) fueron alojados en Virginia Tech en un bolígrafo grande (Figura1C; IACUC #15-060). Los dos primeros entornos de alojamiento son típicos de alojamiento de laboratorio o contienen cerdos de una sola casa. La vivienda tipo C es un entorno de vivienda atípico que puede albergar dos o más cerdos y puede considerarse más un entorno enriquecido que la carcasa de laboratorio estándar. Este protocolo se puede utilizar entre tipos de carcasa si se siguen los siguientes métodos.

<table><tbody><tr><td>Cámaras domo de 3.0 megapíxeles con lentes de 2.8-12 mm configuradas entre 2.8-3.2 mm</td><td>Puntos North Surveillance, Auburn, ME</td><td>CDL7233S</td> Se <td>necesitan lentes de menor tamaño para bolígrafos de perfil bajo</td></tr><tr><td>Kit de brazo de fricción Manfrotto 244</td><td>B& H Foto</td><td>B& H # MA244; MFR # 244</td><td>Para montar y asegurar cámaras en un ángulo de 90 grados.</td></tr> Sistema de <tr><td>grabación de video</td><td>Points North Surveillance, Auburn, ME</td><td>NVR-RACK64</td><td>NVR está personalizado</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva coloreada y estampada unida a una cinta de grado médico de doble cara</td><td>&nbsp; MBK Tape Solutions, Chatsworth, CA</td><td>3M 1522H</td><td>Marcaje sostenible de cerdos Índice de</td></tr> enfoque <tr><td>Generador de fórmulas</td><td>Dinasym, Manhattan, KS</td><td>Approach Formula</td><td>Company personalizará las macros para las necesidades específicas del laboratorio</td></tr><tr><td>Geovision Software</td><td>Points North Surveillance, Auburn, ME</td><td>Software Geovision</td><td>para editar el tiempo de video en clips de 180 s</td></tr><tr><td>Clicker</td><td>Petco</td><td>Good2Go Clicker de entrenamiento para perros</td><td></td></tr><tr><td>Golosina de recompensa (pellet de alimento, chip de algarroba, pasa, malvavisco)</td><td>Variable</td><td>N/A</td><td>Dependiendo de la exposición previa, los cerdos adultos son muy&nbsp; neofóbicos cuando se introduce un nuevo alimento. Los cerdos alimentados con límite pueden ser alimentados con unos pocos pellets de alimento.</td></tr><tr><td>Sistema de Análisis Estadístico (SAS)</td><td>SAS Institute, Cary, Carolina del Norte</td><td>SAS 9.0</td><td>La preferencia de nuestros laboratorios por el análisis de modelos mixtos y medidas repetidas</td></tr><tr><td>Software Observer 11.5</td><td>Noldus Information Technology, Leesburg, VA</td><td>Software Observer 11.5</td><td>para marcar manualmente la hora de los clips de vídeo</td></tr></tbody></table>

prueba de enfoque in-pen no invasiva para cerdos alojados en laboratorio

Noninvasive, In-pen Approach Test for Laboratory-housed Pigs

Las incidencias de lesiones cerebrales traumáticas (TBI) han aumentado tanto en las poblaciones civiles como en las militares, y muchos investigadores están adoptando un modelo porcino para la TBI. A diferencia de los modelos de roedores para TBI, hay pocas pruebas de comportamiento que se han estandarizado. Un animal más grande requiere un manejo más invasivo en áreas de prueba que los roedores, lo que potencialmente añade estrés y variación a las respuestas de los animales. Aquí, se describe la prueba de enfoque humano (HAT), que fue desarrollada para ser realizada frente a la pluma casera de los cerdos de laboratorio. No es invasivo, pero lo suficientemente flexible como para permitir diferencias en las configuraciones de la vivienda.
Durante el HAT, se desarrollaron tres etogramas conductuales y luego se aplicó una fórmula para crear un índice de enfoque (IA). Los resultados indican que el HAT y su índice, la IA, son lo suficientemente sensibles como para detectar alteraciones leves y temporales en el comportamiento de los cerdos después de un TBI leve (mTBI). Además, aunque los resultados de comportamiento específicos dependen de la vivienda, el uso de una IA reduce la variación y permite mediciones consistentes en todos los laboratorios. Esta prueba es confiable y válida; HAT se puede utilizar en muchos laboratorios y para varios tipos de modelos porcinos de lesiones, enfermedades y angustia. Esta prueba se desarrolló para un método de marca de tiempo manual optimizado de modo que el observador no pasa constantemente más de 9 minutos en cada muestra.

Este protocolo describe una nueva prueba de comportamiento, la prueba de enfoque humano en la pluma de los cerdos, para detectar déficits funcionales en cerdos de laboratorio después de una lesión cerebral traumática subconmosiva.

Prueba de enfoque in-pen no invasiva para cerdos alojados en laboratorio

Traumatic brain injury (TBI) incidences have increased in both civilian and military populations, and many researchers are adopting a porcine model for ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, particularmente sobre el neurotrauma. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere una arena o manejo adicional del sujeto. Mi equipo de investigación puede ser visto demostrando procedimientos a lo largo del protocolo. Esto incluye a Eduarda Bortoluzzi, Mikayla Goering, Luke Ruiz, Jared Mumm y Morgan Coffin.Antes de colocar a los animales en sus bolígrafos arreglar cámaras en un 90

noninvasive-in-pen-approach-test-for-laboratory-housed-pigs

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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Técnicas de Cirugía Básica en el minipig Göttingen: intubación, cateterización de la vejiga, el cateterismo femoral del buque, y perfusión Transcardial

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