Name: Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a detectar óxido nítrico en sangre mediante plaquetas usando la fosforilación de VASP. Este protocolo sensible permite estudios in vitro e in vivo en nanomolares.

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Este trabajo fue financiado por beca intramural NIH a Dr. Alan N. Schechter.

Nota: Se obtuvieron muestras de sangre de banco de sangre del NIH (IRB aprobó protocolo: CC-99-0168).
1. preparación de muestras de sangre de
Nota: Para evitar la activación plaquetaria, extraer la sangre lentamente y mezclar suavemente con el citrato invirtiendo el tubo varias veces.
<ol><li>
Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
	<ol>
<li>Dibujar 30 – 50 mL de sangre con una 20 G o aguja de diámetro más grande y añadir en un tubo que contiene citrato de sodio (3.8%) en una proporción 1:9 o dextrosa citrato ácido (ACD) (citrato trisódico 85 mM, 66,6 mM cítrico ácido, glucosa 111 mM, pH 4.5) en una proporción de 1:6.</li>
		<li>Alícuota 5 mL de sangre recién recolectado en tubos cónicos de 15 mL vacíos. Centrifugar sangre 120 x g por 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene las plaquetas (plasma rico en plaquetas, PRP) de la parte superior por una pipeta de transferencia plástica. Nota: PRP del paso 1.1.3 está listo para su uso en experimentos o para su posterior procesamiento preparar lava las plaquetas. El sedimento suave obtenido después de centrifugación (paso 1.1.2) contiene células de sangre rojas y células blancas y puede ser más purificado para obtener lavados glóbulos rojos (RBC): véase el paso 1.3. El experimento debe ser terminada dentro de 2 h después de extraer sangre. Al recoger el PRP (sobrenadante), evitar la colección de leucocitos que contiene la capa buffy acumulado en la interfaz PRP, gr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de plaquetas lavadas (opcional)
	<ol>
<li>Centrífuga recogido PRP a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y conservar los gránulos de la plaqueta.</li>
		<li>Lave suavemente las pelotillas añadiendo 5 mL de tampón CGS (glucosa trisodio de citrato y 30 mM de 12,9 mM, 120 mM NaCl, pH 6,5) y centrifugar a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Vuelva a suspender los pellets de plaquetas con 3 mL de buffer Tyrode modificado (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucosa pH 7.4).</li>
		<li>Diluir las plaquetas (1: 100, como ejemplo, 10 μl de las plaquetas en 990 μl de solución de Rees Ecker) con solución de Rees Ecker y cuenta por hemocitómetro.</li>
		<li>Ajustar la densidad de las plaquetas a 3 x 108 células/mL mediante la adición de buffer Tyrode.</li>
		<li>Incubar la suspensión de plaquetas a 37 ° C durante 1 hora antes de comenzar el experimento. Nota: Plaquetas lavadas son estables durante 5 – 8 h a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de lavado de glóbulos rojos (RBC)
	<ol>
<li>Después de la colección, centrifugar el sedimento suave obtenido en el paso 1.1.3 a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y lavar el pellet de RBC con 5 mL de PBS por centrifugación a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Repetir esta operación 3 veces.</li>
		<li>Descartar el PBS y los glóbulos rojos lavados para experimentos adicionales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. detracción de oxígeno
<ol><li>Añadir 1 mL de la mezcla de PRP (preparado en el paso 1.1.4. o 1.2.4.) y los glóbulos rojos (preparados en el paso 1.3.) en el hematocrito deseado en una botella de polipropileno cerrado con un tapón de caucho. Por ejemplo, en el 20% de hematocrito, añadir 200 μL de glóbulos rojos a 800 μl de PRP. Nota: Sugerido los hematocritos son de 0% hasta un 40%. No utilice una botella de cristal o frasco que las plaquetas se adhieren a la superficie de vidrio.</li>
	<li>Inserte la aguja conectada al tanque de gas de helio dentro de la botella cerrada y hacer la salida de gas inserción de una aguja de 26 G (figura 1).</li>
	<li>Agite lentamente la botella a temperatura ambiente. Nota: No permita que el gas de la burbuja a través de la preparación de la sangre. Flujo de gas lento es preferible para este procedimiento, y flujo de gas de excesivamente rápida conduce a hemólisis creciente. El flujo de gas más eficiente debe determinarse por ensayo, ya que depende altamente de la geometría de la instalación experimental.</li>
	<li>Seguir periódicamente el proceso de desoxigenación mediante la medición de la presión parcial de oxígeno (pO2) con un cooxímetro. Nota: En nuestras manos, a 10 min de detracción de oxígeno disminuye pO2 a 25 mmHg que se requiere para la reducción de nitrito por gr. continuar desoxigenación adicional reducir pO2 a 10 mmHg; sin embargo, condujo al aumento de la hemólisis y aumento de hemoglobina libre (figura 2).</li>
</ol>3. glóbulos rojos nitrito reducción
<ol><li>Añadir 1 mL de PBS (pH 7.4) en 0,0345 g de NaNO2 500 mM solución stock de nitrito. Diluir 500 mM NaNO2 a 250 μm NaNO2 (25 x) por dilución seriada en PBS (pH 7.4).</li>
	<li>Usar una microjeringa, inyectar nitrito (40 μL) a través del tabique la desoxigenada muestra de PRP y los glóbulos rojos para obtener concentraciones finales de 10 μm en total 1 mL de muestra. Nota: En este experimento las concentraciones finales de nitrito usado es 10 μm.</li>
	<li>Incubar la muestra a 37 ° C durante 10 minutos o más. Nota: Ajuste la duración exacta de la incubación de RBC con nitrito necesaria para la reducción de nitrito máximo para diferentes tipos de experimentos.</li>
	<li>Retire el tapón y la pipeta 1 mL de la muestra en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugue a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con una pipeta 300 μL de la suspensión de plaquetas de la porción superior del sobrenadante y mezclar con ACD (pH 6.5) con una relación 1:9. Deseche los pellets de RBC.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de plaquetas a 500 x g durante 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregar 80 μl de tampón de lisis helada (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) con inhibidor de la proteasa bolitas de Cóctel III (1: 500) de las plaquetas.</li>
</ol>4. Western Blotting de VASP
<ol><li>Carga 15 μg de la proteína de cada muestra para 2 geles de SDS-PAGE 10% separados. Nota: Buffer extracción áspero, que contiene el b-mercaptoetanol, no puede quitar los anticuerpos P-VASPSer239 y VASP de la membrana; por lo tanto, P-VASP Ser239 y VASP deben realizarse por separado.</li>
	<li>Funcionan los geles 120 V para la 1,30 h y transferencia a la membrana de nitrocelulosa.</li>
	<li>Fijación no específica de bloque con 5% leche en polvo descremada.</li>
	<li>Incubar la membrana con P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) y GAPDH (1:1, 000) para pasar la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Incubar anticuerpo secundario de peroxidasa (HRP) de rábano con la membrana por 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Exponer la membrana con una máquina de imager y cuantificar la densidad de la banda con ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li>
<li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li>
<li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435(2014).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380(2012).</li>
<li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li>
<li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li>
<li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li>
<li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+%28P-VASPSer239%29+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).</li>
<li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs%3A+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li>
<li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letter%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li>
</ol>

Dr. Alan Schechter está catalogado como un coinventor en varias patentes publicadas a los institutos nacionales de salud para el uso de sales de nitrito para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Recibe a regalías basados en NIH licencias de las patentes para el desarrollo clínico, pero ninguna otra compensación.

Puesto que las plaquetas se activan fácilmente, suave manejo de plaquetas que contienen las muestras se requiere. Debe evitarse uso rápido y vigoroso. Plaquetarios tales como prostaciclina (PGI2) pueden utilizarse para prevenir la activación plaquetaria; sin embargo, esto puede afectar algunas vías de señalización dentro de las plaquetas. Para la preparación de gránulos de la plaqueta, añadir ACD a las suspensiones de plaquetas y utilizar centrifugación a baja velocidad.
Recién prep...

Las plaquetas son fragmentos de células pequeñas en forma de disco, derivados de megacariocitos que son cruciales para la coagulación de la sangre. La cascada de coagulación se inicia por diversas moléculas bioactivas (como colágeno o ADP), publicadas después de la lesión de pared vascular. El proceso de coagulación de la sangre puede ser modificada, entre varios generadores de óxido nítrico (NO). NO, producida naturalmente por las células de mamífero, es una de las señales fisiológicas más versátiles. Actúa como un potente vasodilatador, neurotransmisor y modulador inmune, por nombrar algunos de sus múltiples funciones. En el torrente sanguíneo, NO también ayuda a regular el grado de coagulación de la sangre al inhibir la agregación plaquetaria. Una de las fuentes más probables de NO en el torrente sanguíneo es el nitrito, un ion inorgánico que se ha demostrado para servir como un precursor del NO. Reaccionan con los glóbulos rojos (gr), nitrito se reduce a NO y deoxyHb se oxida a metahemoglobina (metHb)1. NO liberado de los glóbulos rojos es vasoactivo y causa vasorelaxation2. Esta vía de la reducción del nitrito es suplente NO generación, actuando junto con y no complementa el clásico ningún camino de generación de óxido nítrico sintasa endotelial en condiciones hipóxicas.
Las plaquetas no se son capaces de reducir el nitrito a NO, pero son muy sensibles a su presencia. En plaquetas intactas, NO en el nanomolar gama aumenta el GMPC (EC50 = 10 nM) y fosforilación de VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Por lo tanto, las plaquetas pueden servir como un excelente sensor de reducción de nitritos por los glóbulos rojos y no hay liberación en sangre. Hay varios métodos que pueden medir directamente el grado de activación de las plaquetas - Tromboelastografía (TEG) como aggregometry de4,5. Sin embargo, estos métodos requieren costosos instrumentos especializados y grandes cantidades de material. También es posible monitorizar eventos río abajo, después NO es liberado de los glóbulos rojos, con los cambios en la expresión de proteína de la superficie plaquetaria – tales como P-selectina6. NO también se conoce para aumentar la cantidad de GMPC en las plaquetas7. Anteriormente, solíamos cGMP no supervisar ninguna liberación en sangre después de la reducción de nitrito por desoxigenada RBC8. Esto resultó para ser un método muy sensible; sin embargo, cGMP es una molécula de breve duración y su detección implica mano de obra extensa. Otra posibilidad, descrito en el protocolo presentado, utiliza la fosforilación de la fosfo estimulada por vasodilatador (VASP)-proteína para detectar la presencia de NO en sangre. VASP es un sustrato de la activación de proteína quinasa G, que es fosforilado a la interacción con NO a la sGC/cGMP pathway9. Fosforilación de VASP detectarse ocurre en NO muy baja concentraciones, que podrían hacer que las plaquetas un detector muy sensible de NO presencia en la sangre. VASP se expresa altamente en las plaquetas, pero no en otras células de la sangre, que permite para seguir selectivamente los acontecimientos que involucran a las plaquetas10.
El objetivo principal de este protocolo es describir el método detalladamente para la detección de ninguna liberación en sangre entera mediante su interacción con las plaquetas mediante el control de VASP fosforilación11,12. El método descrito no permite la detección temprana de baja las concentraciones - teóricamente en el rango nanomolar que hace más sensible que la determinación de la cGMP, debido al uso de técnicas de Western blot estándar alcanzables en laboratorio la mayoría del presente Protocolo Configuración.

<table><tbody><tr><td>Citrato trisódico</td><td>Suministro por el banco</td><td></td><td></td>de sangre de los NIH</tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Suministro por el banco</td><td></td><td></td>de sangre de los NIH</tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl; cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S-7653 1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4; fosfato de sodio monobásico, monohidratado</td><td>Mallinckrodt Químico</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl; cloruro de potasio</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3; bicarbonato de sodio</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES; N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[-ácido etanosulfónico]</td><td>Sigma</td><td>H3375-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M); cloruro de magnesio Biología de</td><td>la calidad</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2; cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Botellas económicas de HDPE de boca estrecha</td><td>Nalgene</td><td>2089-0001</td><td></td></tr><tr><td>Tabique rojo tapón NO.29</td><td>Fisherbrand</td><td>FB57877</td><td></td></tr><tr><td>NaNO2-; nitrito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2252-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIZMA Base; Tris[hidroximetil]aminometano</td><td>Sigma</td><td>T8524-250G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-nonilfenil-polietilenglicol</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Juego de cócteles de inhibidores de proteasa III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Phospho-VASP (Ser239)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3114</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo VASP</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3112</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Conejo mAb</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-6250-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Sustrato</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060-200ml</td><td></td></tr><tr><td>CO-oxímetro (ABL 90 flex)Radiómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de vasp fosforilación

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Las plaquetas son los componentes de la sangre responsables de coagulación de la sangre adecuada. Su función es altamente regulada por diversas vías. Uno de los más potentes agentes vasoactivos óxido nítrico (NO), también puede actuar como un potente inhibidor de la agregación plaquetaria. Directo detección en sangre no es muy difícil debido a su alta reactividad con la hemoglobina libre que no limita Half-Life a la gama del milisegundo. Actualmente, ningún cambio después de las intervenciones sólo se calculan basado en los cambios medidos de nitrito y nitrato (miembros de la vía metabólica de nitrato-nitrito-NO). Sin embargo precisa, estas mediciones son más bien difíciles de no interpretar frente a real cambios, debido al nitrito inicial alto y niveles que son varios órdenes de magnitud mayores que los cambios esperados NO sí mismo del nitrato. Por lo tanto, el desarrollo de métodos simples y directos que le permiten detectar directamente NO es mucho. Este protocolo dirige a un potencial uso de plaquetas como altamente sensibles sin sensor en sangre. Califica de plasma rico en plaquetas inicial (PRP) y preparados de plaquetas lavadas y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos NO generadores. Fosforilación de la VASP en serina 239 (P-VASPSer239) se utiliza para detectar la presencia de NO. El hecho de que proteínas VASP se expresaron altamente en las plaquetas y que se fosforila rápidamente cuando NO está presente conduce a una oportunidad única para utilizar esta vía para detectar directamente la presencia en sangre.

Muestras de sangre venosa tienen valores de pO2 entre 50-80 mmHg. Desoxigenación por helio disminuye rápidamente la pO2 a 25 mmHg dentro de 10 minutos mayor detracción de oxígeno tiempo un poco más disminuciones pO2. Sin embargo, aumento del tiempo de detracción de oxígeno conduce también a significativamente mayores niveles de hemoglobina libre (determinada por co-oximetría, visualmente vista en la figura 2 como coloración ca...

Aquí, presentamos un protocolo para abordar el uso potencial de las plaquetas como un sensor altamente sensible de óxido nítrico en la sangre. Describe la preparación de plaquetas inicial y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos como generadores de óxido nítrico.

Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Este protocolo aborda el uso potencial de plaquetas como sensor de óxido nítrico altamente sensible tanto in vitro como in vivo dentro de la sangre. Aumento de la fosotilproteína fosforilada-estimulada o serina P-VASP 239 en plaquetas el óxido nítrico tiene algunas ventajas, incluyendo la capacidad de detectar la presencia de óxido nítrico en linajes nanomolares. Dentro de las dos horas siguientes a la recolección de 30 a 50 mililitros de sangre entera de un donante sano, agregue cinco mililitros alícuotas de sangre en el número adecuado de tubos cónicos de 15 mililitros para la centrifugación.Utilice una pipeta de transferencia de plástico para recoger cuidadosamente el plasma rico en plaquetas de la parte superior de los sobrenadantes. Pele el plasma de plaquetas con una segunda centrifugación y lave suavemente los pellets en cinco mililitros de tampón CGS. Centrifugar a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Al final de la centrifugación, resuspender los pellets en tres mililitros de tyrode tyrode modificado. Utilice un hemocitociómetro para contar y ajuste la densidad de las suspensiones plaquetarias a tres veces 10 a las octavas células por mililitro en el tampón Tyrode fresco. Luego incubar las suspensiones plaquetarias durante una hora a 37 grados Centígrados.Mientras tanto, recoger los glóbulos rojos de las capas plasmáticas libres de placas de toda la muestra de sangre por centrifugación seguido de cuatro lavados en cinco mililitros de PBS por lavado. Después del último lavado, deseche los sobrenadantes y mezcle los glóbulos rojos con un mililitro de plaquetas ricas en plasma en el hematocrito experimental adecuado en botellas de polipropileno cerradas con tapones de goma. Inserte una aguja conectada a un tanque de gas helio en cada septo e inserte agujas de calibre 26 para hacer salidas de gas.A continuación, gire lentamente las botellas a temperatura ambiente y utilice un oxímetro para medir la presión parcial de oxígeno para el monitoreo del proceso de desoxigenación. La tasa de disminución del oxígeno depende del caudal de helio y de la velocidad de agitación. Por lo tanto, el tiempo de la oxigenación debe optimizarse antes de comenzar un experimento, ya que esto depende en gran medida de la geometría de la configuración experimental.Para la reducción de nitrito de glóbulos rojos, utilice un microsyringe para inyectar nitrito a través del tabique en las muestras desoxigenadas de PRP y RBC de modo que se alcance una concentración final de 10 micromolares. Incubar las muestras durante al menos 10 minutos a 37 grados centígrados y transferir un mililitro de cada muestra a un tubo de microcentrífuga para centrifugación. Transfiera 300 microlitros de suspensión plaquetaria de la parte superior de los sobrenadantes a nuevos tubos de microcentrífuga y agregue dextrosa de citrato ácido a cada tubo en una proporción de uno a nueve.Centrifugar las plaquetas de nuevo y resuspender los pellets en 80 microlitros de tampón de lysis helada que contiene inhibidor de la proteasa cóctel tres a cada tubo. A continuación, cargue 15 microgramos de proteína de cada muestra en dos geles separados de 10%SDS-PAGE. Ejecute los geles a 120 voltios durante 1,3 horas.Al final de la carrera, transfiera los geles a membranas individuales de celulosa nitrosa y bloquee cualquier unión inespecífico con un volumen adecuado de 5% de leche seca sin grasa. Incubar las membranas con los anticuerpos primarios apropiados durante la noche a cuatro grados centígrados seguidos de etiquetado con un anticuerpo secundario de rábano de rábano de caballo apropiado durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, exponga las membranas con un imager para cuantificar la densidad de la banda con un programa de análisis de imagen adecuado.Las muestras de sangre venosa saludables tienen valores parciales de presión de oxígeno entre 50 y 80 milímetros de mercurio. La desoxgenación por helio disminuye rápidamente la presión parcial del oxígeno a 25 milímetros de mercurio en 10 minutos. Se puede lograr una mayor disminución de la presión parcial de oxígeno con un mayor tiempo de desoxigenación.El aumento de la desoxigenación conduce a un aumento de los niveles de hemólisis como se indica en el plasma de color rojo. Este es un efecto de la desoxigenación y no es causado por agitarse como lo indica la falta de hemólisis en las muestras agitadas sin helio. Tanto los niveles de expresión de fosfoproteína espirituosatoria-estimulada por vasodilatadores como VASP y fosforilado-VASP en plaquetas disminuyeron con el aumento del hematocrito en muestras desoxigenadas detectadas por la mancha occidental.El tratamiento con un donante de óxido nítrico de corta duración aumenta la expresión de fosfoproteína estimulada por vasodilatador fosforilado en las plaquetas dentro de los 10 segundos del tratamiento. Además, los niveles de Fosforilado-VASP o P-VASP se mantuvieron estables hasta 10 minutos después de la incubación del donante NO con plasma rico en plaquetas, lo que indica que hay tiempo suficiente para separar los glóbulos rojos de las plaquetas sin afectar los niveles existentes de P-VASP. El nitrito también aumenta los niveles de P-VASP de plaquetas en presencia de glóbulos rojos desoxigenados.Aquí la relación de P-VASP al VASP total depende del nivel de hematocrito. VASP está muy expresado en plaquetas y se fosforila rápidamente en presencia de óxido nítrico. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método para estudiar la inducción de óxido nítrico por diversos estímulos fisiológicos.Con este método, hemos utilizado con éxito el aumento de P-VASP en plaquetas como un marcador de estimulación de óxido nítrico por nitrito inhalado in vivo. No olvide que el trabajo con plaquetas con una muestra biológica siempre debe realizarse utilizando el equipo de protección personal adecuado.

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JoVE Journal

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Medicina

Un procedimiento no invasivo para evaluar la función endotelial se demuestra con el 2000 Endo-PAT.

Valoración de la función endotelial vasodilatador con el 2000 Endo-PAT

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

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La función de las células vasculares depende de la actividad de los mensajeros intracelulares.  Aquí se describe un método de imagen ex vivo de dos fotones que permite la medición de los niveles intracelulares de calcio y óxido nítrico en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos en células endoteliales y musculares lisas individuales de una aorta aislada.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

La captura de los cambios dinámicos en la activación proteica de los glóbulos rojos enucleados plantea desafíos metodológicos, como la preservación de los cambios dinámicos en los estímulos agudos para su posterior evaluación. El protocolo presentado describe las técnicas de preparación y tinción de muestras que permiten la preservación y el análisis de los cambios proteicos relevantes y su posterior detección.

Detección de alteraciones dinámicas en las proteínas de los glóbulos rojos basada en inmunotinción

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

La generación de anión superóxido es esencial para la estimulación de las plaquetas y, si está desregulada, es fundamental para las enfermedades trombóticas. En este trabajo se presentan tres protocolos para la detección selectiva de aniones superóxido y el estudio de la regulación plaquetaria dependiente de redox.

Métodos alternativos para la detección de la generación de aniones superóxido en plaquetas 

Se proporciona un protocolo detallado para obtener imágenes de plaquetas migratorias individuales utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD con densidad sintonizable, que revela que las plaquetas generan suficiente fuerza para romper el enlace avidina-biotina.

Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Este protocolo describe el Ensayo de Hemostasis de Nimega, que permite la medición simultánea y temporal de la generación de trombina y plasmina para proporcionar una evaluación integrada de la coagulación y la fibrinólisis. El ensayo tiene como objetivo mejorar la caracterización del equilibrio hemostático en entornos de investigación y clínicos más allá del alcance de las pruebas hemostáticas convencionales.

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Aprende a detectar óxido nítrico en sangre mediante plaquetas usando la fosforilación de VASP. Este protocolo sensible permite estudios in vitro e in vivo en nanomolares.

Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación

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