Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación

Este protocolo aborda el uso potencial de plaquetas como sensor de óxido nítrico altamente sensible tanto in vitro como in vivo dentro de la sangre. Aumento de la fosotilproteína fosforilada-estimulada o serina P-VASP 239 en plaquetas el óxido nítrico tiene algunas ventajas, incluyendo la capacidad de detectar la presencia de óxido nítrico en linajes nanomolares. Dentro de las dos horas siguientes a la recolección de 30 a 50 mililitros de sangre entera de un donante sano, agregue cinco mililitros alícuotas de sangre en el número adecuado de tubos cónicos de 15 mililitros para la centrifugación.

Utilice una pipeta de transferencia de plástico para recoger cuidadosamente el plasma rico en plaquetas de la parte superior de los sobrenadantes. Pele el plasma de plaquetas con una segunda centrifugación y lave suavemente los pellets en cinco mililitros de tampón CGS. Centrifugar a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la centrifugación, resuspender los pellets en tres mililitros de tyrode tyrode modificado. Utilice un hemocitociómetro para contar y ajuste la densidad de las suspensiones plaquetarias a tres veces 10 a las octavas células por mililitro en el tampón Tyrode fresco. Luego incubar las suspensiones plaquetarias durante una hora a 37 grados Centígrados.

Mientras tanto, recoger los glóbulos rojos de las capas plasmáticas libres de placas de toda la muestra de sangre por centrifugación seguido de cuatro lavados en cinco mililitros de PBS por lavado. Después del último lavado, deseche los sobrenadantes y mezcle los glóbulos rojos con un mililitro de plaquetas ricas en plasma en el hematocrito experimental adecuado en botellas de polipropileno cerradas con tapones de goma. Inserte una aguja conectada a un tanque de gas helio en cada septo e inserte agujas de calibre 26 para hacer salidas de gas.

A continuación, gire lentamente las botellas a temperatura ambiente y utilice un oxímetro para medir la presión parcial de oxígeno para el monitoreo del proceso de desoxigenación. La tasa de disminución del oxígeno depende del caudal de helio y de la velocidad de agitación. Por lo tanto, el tiempo de la oxigenación debe optimizarse antes de comenzar un experimento, ya que esto depende en gran medida de la geometría de la configuración experimental.

Para la reducción de nitrito de glóbulos rojos, utilice un microsyringe para inyectar nitrito a través del tabique en las muestras desoxigenadas de PRP y RBC de modo que se alcance una concentración final de 10 micromolares. Incubar las muestras durante al menos 10 minutos a 37 grados centígrados y transferir un mililitro de cada muestra a un tubo de microcentrífuga para centrifugación. Transfiera 300 microlitros de suspensión plaquetaria de la parte superior de los sobrenadantes a nuevos tubos de microcentrífuga y agregue dextrosa de citrato ácido a cada tubo en una proporción de uno a nueve.

Centrifugar las plaquetas de nuevo y resuspender los pellets en 80 microlitros de tampón de lysis helada que contiene inhibidor de la proteasa cóctel tres a cada tubo. A continuación, cargue 15 microgramos de proteína de cada muestra en dos geles separados de 10%SDS-PAGE. Ejecute los geles a 120 voltios durante 1,3 horas.

Al final de la carrera, transfiera los geles a membranas individuales de celulosa nitrosa y bloquee cualquier unión inespecífico con un volumen adecuado de 5% de leche seca sin grasa. Incubar las membranas con los anticuerpos primarios apropiados durante la noche a cuatro grados centígrados seguidos de etiquetado con un anticuerpo secundario de rábano de rábano de caballo apropiado durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, exponga las membranas con un imager para cuantificar la densidad de la banda con un programa de análisis de imagen adecuado.

Las muestras de sangre venosa saludables tienen valores parciales de presión de oxígeno entre 50 y 80 milímetros de mercurio. La desoxgenación por helio disminuye rápidamente la presión parcial del oxígeno a 25 milímetros de mercurio en 10 minutos. Se puede lograr una mayor disminución de la presión parcial de oxígeno con un mayor tiempo de desoxigenación.

El aumento de la desoxigenación conduce a un aumento de los niveles de hemólisis como se indica en el plasma de color rojo. Este es un efecto de la desoxigenación y no es causado por agitarse como lo indica la falta de hemólisis en las muestras agitadas sin helio. Tanto los niveles de expresión de fosfoproteína espirituosatoria-estimulada por vasodilatadores como VASP y fosforilado-VASP en plaquetas disminuyeron con el aumento del hematocrito en muestras desoxigenadas detectadas por la mancha occidental.

El tratamiento con un donante de óxido nítrico de corta duración aumenta la expresión de fosfoproteína estimulada por vasodilatador fosforilado en las plaquetas dentro de los 10 segundos del tratamiento. Además, los niveles de Fosforilado-VASP o P-VASP se mantuvieron estables hasta 10 minutos después de la incubación del donante NO con plasma rico en plaquetas, lo que indica que hay tiempo suficiente para separar los glóbulos rojos de las plaquetas sin afectar los niveles existentes de P-VASP. El nitrito también aumenta los niveles de P-VASP de plaquetas en presencia de glóbulos rojos desoxigenados.

Aquí la relación de P-VASP al VASP total depende del nivel de hematocrito. VASP está muy expresado en plaquetas y se fosforila rápidamente en presencia de óxido nítrico. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método para estudiar la inducción de óxido nítrico por diversos estímulos fisiológicos.

Con este método, hemos utilizado con éxito el aumento de P-VASP en plaquetas como un marcador de estimulación de óxido nítrico por nitrito inhalado in vivo. No olvide que el trabajo con plaquetas con una muestra biológica siempre debe realizarse utilizando el equipo de protección personal adecuado.