Name: Bio-energética investigación de Candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende a medir la respiración mitocondrial y la función glucolítica en Candida albicans utilizando un analizador de flujo extracelular sin necesidad de purificar mitocondrias. Este método simplifica el estudio del metabolismo fúngico.

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Investigación en laboratorio de NC es apoyada por una subvención de los institutos nacionales de salud (NIH) R01AI24499 y una beca de la Fundación de salud de Nueva Jersey (NJHF), #PC40-18.

Nota: El protocolo paso a paso detallado del análisis se describe a continuación, y el protocolo esquemático se muestra en la figura 1.
1. las cepas de C. albicans y condiciones de crecimiento
<ol><li>Crecen las cepas de C. albicans en medio líquido de la dextrosa-peptona-Extracto de levadura (YPD) a 30 °C en un agitador incubador durante la noche. Nota: Mantener cepas de Candida como acción congelada y crecen en agar YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% dextrosa y agar al 2%).</li>
</ol>2. preparación de reactivos
<ol><li>Preparar el medio de ensayo como sigue:<ol>
<li>Para análisis de la función mitocondrial, disolver el polvo de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g y 2 g de glucosa (2%) en 90 mL de agua estéril y caliente los medios a 37 ° C. Ajustar el pH a 7.4 con 5 M NaOH y enrasar a 100 mL con agua estéril.</li>
		<li>Para análisis de estrés de glucolisis, disolver 1,04 g 1640 RPMI polvo en 90 mL de agua estéril, caliente los medios a 37 ° C y ajustar el pH a 7.4. Enrasar a 100 mL con agua estéril. RPMI 1640 polvo no tiene bicarbonato, que es fundamental para monitorear el cambio de pH como una medida de la glucólisis durante el ensayo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Compuestos de la inyección.<ol>
<li>Preparar caldo de glucosa de 1 M en agua estéril y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mM oligomycin stock en dimetil sulfóxido (DMSO), alícuota en volúmenes pequeños y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar acciones 100 mM antimicina en DMSO, alícuota en volúmenes pequeños y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mM stock SHAM (ácido salicylhydroxamic) en el etanol en el día del ensayo.</li>
		<li>Preparar 1 M KCN en agua estéril en el día del ensayo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. capa de la placa de ensayo con Poly-D-lisina (PDL)
Nota: Realice todos los pasos en una campana laminar.
<ol><li>D poli lisina en agua de calidad de cultivo de tejidos para hacer la concentración final de 50 μg/mL se disuelven. Mezclarlo bien y alícuota en un tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-20 ° C a largo plazo. Nota: se necesita 50 μL por pocillo, y 24 pozos, 1,2 mL se requiere. Por lo tanto, alícuota mínimo 1.3 mL por tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Añadir 50 μL por pocillo e incubar a temperatura ambiente con la tapa cubierta para 1-2 h.</li>
	<li>Aspirar la solución y enjuague una vez con agua de calidad de cultivo estériles para tejidos de 500 μl.</li>
	<li>Abra la tapa y deje que se sequen los pozos de aire. Utilizar la placa en el mismo día o a 4 ° C por un máximo de 2-3 días.</li>
</ol>4. hidratación de cartucho de sensor
Nota: Realice este paso un día antes del experimento.
<ol><li>Abrir el flujo adicional Kit de ensayo y retire el contenido. Coloque el cartucho de sensor boca abajo al lado de la placa de utilidad (figura 2).</li>
	<li>Llene cada uno bien de la placa de utilidad con 1 mL de calibrant y coloque el cartucho de sensor nuevo. Asegúrese de que los sensores que contengan fluoróforos (para medir el oxígeno y el pH) se introducen en el calibrant.</li>
	<li>Incubar el cartucho sensor durante la noche en una incubadora sin CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>5. cultivo y siembra de células en las placas recubiertas de PDL
<ol><li>Inocular de C. albicans en el caldo YPD y crecer durante la noche a 30 ° C en un agitador a 200 rpm. Nota: Basado en el diseño del ensayo y el interés, C. albicans puede también cultivarse en YPG o medio mínimo.</li>
	<li>En el día del ensayo, diluir un número apropiado de células en el medio de ensayo para obtener una concentración final de 100.000 células por μl 100.</li>
	<li>Añada 100 μl de las células diluidas en cada pocillo de la placa de ensayo excepto pozos A1, B4, C3 y D6, en el que añadir 100 μl del medio de ensayo para la corrección de fondo (figura 3).</li>
	<li>Transferir la placa a una incubadora sin CO2 a 37 ° C e incubar durante 60 minutos, lo que permitirá que las células se adhieren a la superficie de la placa.</li>
</ol>6. Protocolo
Nota: El protocolo descrito aquí es para el formato de 24 pocillos del instrumento. Volúmenes tendrá que ajustarse si se utiliza otro formato.
<ol><li>Análisis de la función mitocondrial<ol>
<li>Preparación de compuestos<ol>
<li>Preparar compuestos en concentración de 10 x para análisis de la función mitocondrial: preparar 20 mM farsa, 100 μm Oligomycin, KCN, de 100 mM y μm Antimycin A 20 en el medio de ensayo correspondiente.</li>
			<li>Añadir 50 μl de simulacro en el puerto A, 55 μl Oligomycin en Puerto B, 62 μl de KCN al puerto C y μl Antimycin A 68 en Puerto D (figura 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensayo de tensión glucolisis<ol>
<li>Preparación de compuestos<ol>
<li>Preparar compuestos en concentración de 10 x para el ensayo de tensión glucolisis. Preparar 100 mM glucosa, 100 μm Oligomycin, 500 mM 2-deoxi glucosa (2DG) y 20 μm Antimycin A en el medio de ensayo correspondiente.</li>
			<li>Añadir glucosa μl 50 en Puerto A, 55 μl Oligomycin en Puerto B, 62 μl 2-DG en el puerto C y μl Antimycin A 68 en Puerto D.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar el analizador de flujo extra, el cual mide la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de células vivas en un formato de placa de 24 pozos. Configurar el protocolo de ensayo de antemano.</li>
	<li>Abra el analizador de flujo adicional y configurar la plantilla de ensayo mediante la ficha de asistente de análisis y seguir las instrucciones paso a paso para completar toda la información que sale durante la instalación. Generar el diseño de grupo como similar al mostrado en la figura 5. Configure el protocolo como se muestra en la tabla 1. Configurar estas plantillas bien adelante antes del ensayo y guardar en el ordenador. En el momento de análisis, restablecer el protocolo guardado abriendo el archivo correspondiente en la opción Abrir archivo en la pestaña Asistente de ensayo (figura 5).</li>
	<li>Carga de los compuestos de 10 x en los puertos respectivos del cartucho sensor hidratado que contiene el calibrant y cargue en la bandeja portadora del analizador de flujo extra. Comenzar la calibración pulsando el botón Start en la pantalla.</li>
	<li>Añadir 350 μl del medio de ensayo suavemente a la placa celular en el lado de los pozos para minimizar la alteración de la célula para llevar el volumen final a 450 μl.</li>
	<li>Vuelva a colocar la placa de utilidad que contienen calibrant con la placa de ensayo y continuar.</li>
	<li>Quite el cartucho de sensor y la placa una vez terminado el ensayo. Guarde el archivo en la carpeta de destino apropiado.</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>Utilice el área bajo la curva - análisis de varianza (ANOVA-AUC) análisis ficha en el software para calcular la diferencia significativa entre los grupos, seleccionando los parámetros respectivos (OCR o ECAR) como se muestra en la figura 6.</li>
	<li>Seleccione los grupos que deban compararse.</li>
	<li>Agregar a los grupos de análisis de ANOVA y haga clic en Aceptar. Nota: Este análisis ANOVA AUC agregará una nueva hoja para el archivo en el que las AUC es calculada para cada grupo y compara entre ellos por ANOVA. Esto le dará una tabla de valores de p para mostrar la importancia.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li>
<li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infection+rates+in+US+children%27s+hospitals%27+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li>
<li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Value+in+Health%22%5BJournal%5D)">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li>
<li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+candidemia%3A+risk+factors+and+attributable+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals%3A+epidemiology%2C+clinical+features+and+susceptibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li>
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<li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+fungal+pathogenesis%3A+drug+tolerance%2C+virulence%2C+and+potential+for+antifungal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li>
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<li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocytes+govern+the+transcriptional+response%2C+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li>
<li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li>
<li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li>
<li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
<li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandt%2C+ME+%22Candida+and+Candidiasis%22">Candida and Candidiasis</a>. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).</li>
<li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La bioenergética análisis de flujo extra sirven como una excelente herramienta para leer la función mitocondrial mediante la medición de fosforilación oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxígeno dependiente en tiempo real. Además, una función de glucolisis que es medida como una tasa de acidificación extracelular (cambio en el pH extracelular) también se puede investigar al mismo tiempo en el análisis en tiempo real.
Exitosa siembra de C. albicans en la placa de ensayo es uno de los pasos c...

Las infecciones fúngicas invasivas mata a más 1,5 millones de personas al año en todo el mundo. Este número va en aumento debido a un aumento en el número de personas con inmunidad comprometida, incluyendo los bebés prematuros, ancianos, trasplantados y cáncer pacientes1. C. albicans es un hongo patógeno humano oportunista que es una parte de la microflora humana. También habita las superficies mucosas y el tracto gastrointestinal como un organismo comensal. C. albicans produce enfermedad sistémica seria en personas con inmunodeficiencias, que han sometido a cirugía o que han sido tratados con cursos largos de antibióticos. El rango de especies de Candida entre las causas de la tapa tres de las enfermedades infecciosas nosocomiales (NID) en los seres humanos2,3,4,5,6,7. Se estima el número global de infecciones de la sangre de Candida ~ 400.000 casos, con mortalidad asociada de 46-75%1. La mortalidad anual a causa de la candidiasis es de aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos. El grado de NID causada por hongos también se refleja en gastos astronómicos de paciente5. En los Estados Unidos, el gasto anual para el tratamiento de las infecciones fúngicas invasivas supera los $ 2 billones, añadiendo una gran tensión al sistema de salud ya sobrecargado. En la actualidad, terapias antihongos estándar disponibles son limitadas debido a toxicidad, resistencia a los medicamentos cada vez más frecuentes y las interacciones de fármacos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar nuevas dianas de antimicóticos que se traducirá en mejores opciones de tratamiento para pacientes de alto riesgo. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos fármacos que actúan sobre dianas fúngicas es complicado porque los hongos son eucariotas. Grandemente, esto limita el número de dianas farmacológicas de fungicidas específicos.
Estudios recientes han indicado que las mitocondrias son un contribuyente fundamental a la virulencia de hongos y la tolerancia a drogas antihongos ya que las mitocondrias son importantes para la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico y no glucolisis son esenciales para la supervivencia de C. albicans en el huésped mamífero12,13,14,15,16. Además, varios mutantes de C. albicans que carece de proteínas mitocondriales, como la Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. han demostrado ser defectuoso en la filamentación, un factor importante de virulencia de C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Además, estos mutantes también fueron demostrados para ser atenuada para difusión de virulencia en un modelo murino de candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Así, las mitocondrias hongos representan un atractivo destino para el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, el estudio de la función mitocondrial en C. albicans es difícil debido a que C. albicans es petite negativa23, que significa que no puede sobrevivir sin el genoma mitocondrial.
Aquí, describimos un protocolo que puede utilizarse para investigar la función mitocondrial y glucolisis en C. albicans sin necesidad de purificar las mitocondrias. Este método también se puede optimizar para investigar el efecto de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolisis en C. albicans.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de estrés Mito</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sodio</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo de tejidos</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF solución calibrante de ensayo</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura Peptona Dextrosa</td><td>Fisher scientific,BP2469</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Extracto de levadura Peptona Dextrosa Agar Sigma</td><td></td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura Peptona Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

bio-energética investigación de candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Las mitocondrias son organelos esenciales para el metabolismo celular y la supervivencia. Una variedad de eventos clave llevará a cabo en la mitocondria, como la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis. En consecuencia, la disfunción mitocondrial se divulga a jugar un papel importante en la tolerancia de antimicóticos y la virulencia de hongos patógenos. Datos recientes también han contribuido al reconocimiento de la importancia de la mitocondria como un contribuyente importante para la patogénesis fúngica. A pesar de la importancia de la mitocondria en biología fúngica, métodos estandarizados para entender su función están poco desarrollados. Aquí, presentamos un procedimiento para estudiar la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), una medida de la respiración mitocondrial y las tasas de acidificación extracelular (ECAR), una medida de la función glucolisis en cepas de C. albicans . El método descrito en este documento puede aplicarse a cualquier Candidaspp. cepas sin la necesidad de purificar las mitocondrias de las células fúngicas intactas. Además, este protocolo puede también ser modificado para requisitos particulares para detectar inhibidores de la función mitocondrial en cepas de C. albicans .

El objetivo de este protocolo es determinar las funciones bioenergéticas de C. albicans por analizador de flujo adicional. Un mutante de C. albicans que carece de proteína mitocondrial Mam33 también está incluido junto con su variedad de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para el estudio de los efectos de la eliminación de una proteína mitocondrial en OCR y ECAR. MAM33 codifica para una proteína supuesta matriz mitocondrial de ácidos y su función en la Ca...

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para investigar la respiración mitocondrial y la función glucolisis en Candida Albicans utilizando un analizador de flujo adicional.

Bio-energética investigación de Candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Este protocolo es significativo para determinar la función glucolítica y la respiración mitocondrial en Candida albicans. La principal ventaja de esta técnica es que permite medir la función mitocondrial sin necesidad de purificar las mitocondrias de Candida albicans. Este método se puede optimizar para investigar los efectos de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolíticas en Candida albicans u otros patógenos fúngicos.Esta técnica es relativamente simple. O dependiendo del organismo, su uso puede ayudar a optimizar el número de células y la concentración de inhibidores mitocondriales en su ensayo. En una campana de flujo laminar, disolver Poli-D-lisina en el agua de la rejilla de tejido a una concentración final de 50 microgramos por mililitro.Mezcle bien la solución y aliquotándola en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, asegurándose de alicuervar al menos 1,3 mililitros por tubo. Añadir 50 microlitros de esta mezcla a cada pozo de la placa de ensayo, cubrir la tapa e incubar a temperatura ambiente durante una o dos horas. A continuación, aspirar la solución.Enjuague los pozos de la placa de ensayo una vez con 500 microlitros de agua de grado de cultivo de tejido estéril, abra la tapa y deje que los pozos se sequen al aire. Si no utiliza la placa el día que se prepara, guárdela a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos a tres días. El día antes del experimento, abra el kit de ensayo de flujo adicional y retire el contenido.Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicio. Llene cada pozo de la placa de servicio con un mililitro de calibrador y luego coloque el cartucho del sensor de nuevo. Asegúrese de que los sensores que contienen fluoróforos estén sumergidos en el calibrador.Incubar el cartucho del sensor a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante la noche. El día antes del ensayo, inocular los C albicanos preparados en el caldo YPD y crecer durante la noche a 30 grados celsius en una coctelera a 200 rpm. El día del ensayo, diluir un número adecuado de células en el medio de ensayo para producir una concentración final de 100.000 células por cada 100 microlitros.Agregue 100 microlitros de las células diluidas en cada pozo de la placa de ensayo excepto los pozos A1, B4, C3 y D6. A estos pozos, agregue sólo 100 microlitros de medio de ensayo para la corrección de fondo. Incubar la placa a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante 60 minutos para dejar que las células se adhieran a la superficie de la placa. Preparar los compuestos para el ensayo de función mitocondrial a una concentración de 10 veces en el medio de ensayo correspondiente, tal como se describe en el protocolo de texto.Añadir 50 microlitros de SHAM en el puerto A, 50 microlitros de oligomicina en el puerto B, 62 microlitros de cianuro de potasio en el puerto C, y 68 microlitros de Antimicina A en el puerto D.Next, preparar los compuestos para el ensayo de tensión glucolítica a 10 veces concentración en el medio de ensayo correspondiente descrito en el protocolo de texto. Agregue 50 microlitros de glucosa al puerto A, 55 microlitros de oligomicina en el puerto B, 62 microlitros de 2-DG en el puerto C y 68 microlitros de Antimicina A al puerto D.Antes del ensayo, abra el analizador de flujo adicional y configure la plantilla de ensayo utilizando la pestaña del asistente de ensayo. Siga las instrucciones paso a paso y rellene toda la información que aparece durante la configuración.Genere un diseño de grupo y configure el protocolo como se describe en el protocolo de texto. Guarde estos diseños antes del ensayo. En el momento del ensayo, restaure el protocolo guardado abriendo el archivo correspondiente en la opción abrir archivo en la pestaña del asistente de ensayo.A continuación, cargue los compuestos 10X en los puertos respectivos del cartucho del sensor hidratado que contiene el calibrador. Cargue el cartucho del sensor en la bandeja portadora del analizador de flujo adicional. Inicie la calibración haciendo clic en el botón de inicio de la pantalla.A continuación, agregue suavemente 350 microlitros del medio de ensayo a la placa celular a lo largo del lado de las paredes para minimizar la perturbación celular, lo que eleva el volumen final a 450 microlitros. Sustituya la placa de utilidad que contiene el calibrador por la placa de ensayo y continúe con el ensayo. Una vez completado el ensayo, retire el cartucho del sensor y la placa.Guarde el archivo en la carpeta de destino adecuada. En este estudio, las funciones bioenergéticos de los C albicans son evaluadas por un analizador de flujo adicional. También se incluye un mutante que carece de la proteína mitocondrial mam33 junto con su cepa de complemento para estudiar los efectos de la deleción de una proteína mitocondrial en la tasa de consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular.El tipo salvaje C albicans muestra una tasa de consumo de oxígeno de 145 picomoles por minuto que está dentro del rango óptimo para cualquier ensayo de flujo extracelular. La tasa de consumo basal de oxígeno del tipo salvaje, mamelado33 mutante y mam33 cepas complementadas no muestran diferencias. Del mismo modo, no se observan diferencias significativas en las tasas basales de acidificación extracelular entre las cepas.Sin embargo, al inhibir complejo-IV con cianuro de potasio, el tipo salvaje y mam33 mutante, cepas complementadas mam33 muestran un cambio significativo hacia la glucólisis. Sin embargo, la cepa mutante mam33 no mostró un cambio glucolítico compensatorio que sugiere que la vía dependiente del compuesto IV está deteriorada en esta cepa. En la prueba de esfuerzo glucolítico, las células se mueren de hambre de glucosa durante una hora y se mide la tasa de consumo basal de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular.Tras el hambre, la cepa mutante mam33 muestra un consumo de oxígeno significativamente menor y tasas de acidificación extracelular en comparación con las otras cepas. Esto sugiere un deterioro de la utilización de glucosa para la respiración y la glucólisis cuando las células se ven forzadas a la condición de inanición. Después de inyectar glucosa, todas las cepas muestran estimulación tanto de su tasa de consumo de oxígeno como de su tasa de acidificación extracelular.El recubrimiento de la placa de ensayo permite que las células de Candida albicans se adhieran a la placa. La adherencia incorrecta de las células albicans de Candida afectará el resultado del ensayo. Después del desarrollo de esta técnica, se ha empleado en una amplia gama de tipos de células y enfermedades que abordan cómo funcionan las mitocondrias durante las condiciones fisiológicas y patológicas.Por ejemplo, empleando células derivadas del paciente y de control en este ensayo, es posible abordar las preguntas específicas de cómo se altera la función mitocondrial. Se debe tener cuidado mientras se preparan inhibidores mitocondriales como el cianuro de potasio y la antimicina A, ya que estos compuestos son extremadamente venenosos.

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Este protocolo proporciona un enfoque bioquímico para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de células leucémicas primarias con ensayo de flujo extracelular. La evaluación del perfil metabólico de estas células ayuda a caracterizar sus demandas, lo que conduce a una terapia personalizada.

Ensayo de flujo extracelular: un método para medir el perfil metabólico de las células

Este video muestra el método para analizar el metabolismo energético en células NK humanas activadas utilizando un analizador de flujo extracelular. Diferentes inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones influyen en la síntesis de ATP, que se mide a través de la tasa de consumo de oxígeno u OCR, lo que proporciona información sobre el metabolismo celular y la bioenergética.

Monitorización en tiempo real del metabolismo energético en células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular

Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Estos protocolos ayudarán a los usuarios a sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides derivados de líneas celulares de cáncer 3D utilizando el análisis de flujo extracelular Seahorse.

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

El abuso del alcohol perjudica la inmunidad de los macrófagos alveolares (AM) debido a la supresión de la respiración mitocondrial y la bioenergética. Recientemente demostramos que la exposición al etanol (EtOH) aumenta la dependencia de la glutamina para la respiración mitocondrial en los AM. En este artículo, se proporcionan métodos para determinar el uso de glutamina para la respiración mitocondrial en AM tratados con EtOH utilizando un bioanalizador de flujo extracelular.

Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Este protocolo emplea un reportero bioluminiscente, lo que permite mediciones de la actividad transcripcional en Saccharomyces eubayanus para monitorear la transición de glucosa a maltosa, lo que permite el análisis en tiempo real de las adaptaciones metabólicas y apoya la optimización de la cepa para la fermentación industrial en diversas condiciones.

In vivo Monitorización de la actividad transcripcional durante la transición metabólica mediante un reportero bioluminiscente en levadura

Este protocolo describe una forma rentable de realizar una prueba de esfuerzo de glucólisis para cuantificar la reprogramación metabólica en microglías primarias del ratón. Tras el aislamiento y la estimulación inflamatoria, se mide la tasa de acidificación extracelular (ECAR) utilizando reactivos recién preparados y ajustados con pH, seguida de la normalización de proteínas para permitir una evaluación precisa y reproducible de los desplazamientos glicolíticos.

Investigación de la glucólisis en la microglía primaria mediante ensayo de flujo extracelular

Aprende a medir la respiración mitocondrial y la función glucolítica en Candida albicans utilizando un analizador de flujo extracelular sin necesidad de purificar mitocondrias. Este método simplifica el estudio del metabolismo fúngico.

Bio-energética investigación de Candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis

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