Name: Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a medir el consumo de oxígeno en cardiomiocitos neonatales de ratón utilizando un analizador de flujo extracelular. Este protocolo permite evaluar la función mitocondrial en formato de 96 pocillos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a todo laboratorio Ross y miembros del laboratorio de Murphy. Este trabajo es apoyado por la Asociación Americana del corazón (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) y VA al mérito (BX003260) a R.S.R.

Para el trabajo con ratones neonatales, se refieren al conjunto de pautas locales Instituto adelante por los programas de cuidado de los animales y se adhieren a la institucional y otras regulaciones apropiadas. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por la UC San Diego Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) y adhieran a regulaciones federales y estatales.
1. preparación de reactivos
<ol><li>Preparar 25 mL de solución de digestión previa: HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +) complementada con tripsina (0.5 mg/mL). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión previa en el día del experimento. Nota: Es fundamental utilizar HBSS sin Ca2 + y Mg2 +, Ca2 + y Mg2 + hará que la contracción del miocito y la muerte subsecuente de la célula durante el aislamiento.</li>
	<li>Preparar 30 mL de tampón de digestión colagenasa: colagenasa (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) disuelto en tampón HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión de colagenasa en el día del experimento.</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de cultivo de cardiomiocitos (medios de cultivo): se mezclan 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de suero de caballo y 12,5 mL de SBF. Suplemento con penicilina de 1% y 1% solución de estreptomicina.</li>
	<li>Preparación de medio de prueba de estrés mitocondrial: hacer 200 mL de DMEM basado en prueba de esfuerzo suplementado (DMEM sin NaHCO3, véase Tabla de materiales) con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina y glucosa 10 mM y 2 mM Hepes. Nota: Hacer 1 L de medio con DMEM sin piruvato de sodio, L-glutamina, glucosa y Hepes, filtro estéril y almacenar a 4 ° C. Preparar el medio de prueba de esfuerzo en el día del ensayo mediante la adición de otros reactivos. Con DMEM medio sin NaHCO3 es fundamental.</li>
	<li>Ajustar el pH de los medios de prueba de estrés mitocondrial a 7.4 en el día de uso. Medios de comunicación tibia a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Preparar oligomycin: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar FCCP: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar la antimicina A: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar la rotenona: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C. Nota: Todos los reactivos y soluciones utilizadas en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1.</li>
</ol>2. recolección y pre digestión de corazones de ratones neonatales (día 1)
<ol><li>Autoclave tijeras, pinzas y una cuchara de Moria para esterilizar.</li>
	<li>Realizar todos los pasos en la campana de la cultura de célula para la esterilidad.</li>
	<li>5 mL alícuota de HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +) en cada pocillo de una placa de cultivo celular 6-bien; Coloque en hielo. Alícuota 10 mL de HBSS en una placa de cultivo celular de 10 cm.</li>
	<li>Prepare 20 mL de solución de la digestión de tripsina en un tubo cónico estéril de 50 mL. Mantenga todas las soluciones en el hielo.</li>
	<li>Rápidamente sumergir ratones recién nacidos (día 0) en la solución de etanol 70% para la esterilización.</li>
	<li>Decapitar a PUP utilizando tijeras estériles (recto) sin anestesia y luego abre el cofre a lo largo del esternón para permitir el acceso a la cavidad torácica y el corazón. (Figura 1A) Nota: 1) es importante utilizar ratones neonatales P0 para lograr viabilidad celular alta. 2) este método de eutanasia está permitida para los recién nacidos con arreglo a las pautas de NIH y la Asociación Médica Veterinaria americana 17.</li>
	<li>Extraer corazones del cuerpo con tijeras finas y transferencia inmediatamente en el plato de cultura de célula estéril con HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +) (figura 1B).</li>
	<li>Eliminar cualquier tejido pulmonar residual, los buques más grandes, etc. (y atria, si lo desea). Lavar el corazón en la solución HBSS con agitación suave.</li>
	<li>Cortar cada corazón con unas tijeras finas en 8 pedazos y transferir todo el tejido de corazón con unas pinzas en un pozo de una placa de cultivo celular 6-bien con HBSS (figura 1C y 1D).</li>
	<li>Lavar los corazones mediante la transferencia de los corazones de bien a bien en la placa de 6 pozos con HBSS, con una cuchara de Moria (figura 1). Nota: Transferencia de los corazones de bien a bien es suficiente para lavar la sangre. Puesto que la sangre interfiere con la digestión enzimática es importante lavar los corazones con HBSS y sacar sangre.</li>
	<li>Transferir el corazón con una cuchara de Moria en un tubo cónico que contiene 20 mL de tripsina (0.5 mg/mL) e incubar con agitación suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).</li>
</ol>3. prepare una placa de cultivo de 96 pocillos (día 1)
<ol><li>Preparar 5 mL de solución de recubrimiento: PBS con 0,5% gelatina (autoclave antes de su uso) y fibronectina solución al 1%. (por ejemplo, 5 mL de solución de gelatina y 50 μl de solución de fibronectina)</li>
	<li>Alícuota de 50 μl de solución de recubrimiento en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 96 pozos (véase Tabla de materiales). Si las burbujas están presentes, eliminarlos utilizando una pipeta de 20 μl para aspirar las burbujas hacia fuera. Nota: Es importante cubrir toda la superficie de cada pocillo con la solución de recubrimiento.</li>
	<li>Incube la placa en una incubadora de cultura de célula de 37 ° C durante 1 h o más para permitir el secado de la capa de matriz.</li>
	<li>Aspirar cualquier solución de capa residual antes de sembrar de cardiomiocitos.</li>
</ol>4. enzimática digestión y galjanoplastia de células (día 1)
<ol><li>Caliente previamente la solución de digestión de colagenasa en un baño de agua de 37 ° C. Nota: Este paso es importante para lograr la digestión enzimática eficiente.</li>
	<li>Mover el tubo cónico que contiene corazones y solución de digestión antes de 4 ° C a una campana de cultivo celular. (Figura 1F)</li>
	<li>Deja que el corazón se hunde hasta el fondo del tubo y retirar la solución de la digestión mediante el uso de una pipeta serológica de 10 mL (1 a 2 mL del medio de aislamiento puede permanecer en el tubo).</li>
	<li>Añadir 10 mL de HBSS en el tubo. Vuelva a suspender los corazones con HBSS 2 - 3 veces a lavar con una pipeta serológica de 10 mL de tripsina. Aspirar HBSS (1 a 2 mL puede permanecer en el tubo).</li>
	<li>Añadir 10 mL de solución de digestión con colagenasa en el tubo con el corazón. (Figura 1)</li>
	<li>Incubar el tubo con el corazón en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos sin agitación (1 º digestión).</li>
	<li>Después de la 1 º digestión, mueva el tubo a la campana de la cultura de célula. Suavemente triturate corazones por volver a suspender los corazones dentro del tubo suavemente 10 veces usando una pipeta serológica de 10 mL. Esto permitirá que corazones para dispersar y células liberadas del tejido cardíaco. (Figura 1 H) Nota: Cardiomiocitos son frágiles, trituración suave es importante para lograr alta viabilidad.</li>
	<li>Que el tejido no digerido fregadero, transferencia digerido solución enriquecida en cardiomiocitos (aproximadamente 9-10 mL) a un tubo cónico nuevo y añadir la misma cantidad de medios de cultivo celular para detener la digestión de la colagenasa.</li>
	<li>Añadir 10 mL de solución de digestión de colagenasa en el tubo que contiene el tejido restante del corazón sin digerir.</li>
	<li>Incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min (2 º digestión).</li>
	<li>Repita el procedimiento 4.7 y 4.8. Nota: Si hay tejido todavía mucho no digerida, repita una vez más la digestión. Sin embargo, en la mayoría de los casos, dos digestiones son suficientes para dispersar la mayoría de las células de los tejidos del corazón.</li>
	<li>Coloque un filtro de células estéril (malla de nylon de 100 μm) en un tubo cónico estéril 50 mL nuevo. Humedezca previamente el filtro de la célula con 2-3 mL de medio de cultivo celular y pasar las células a través de la coladera de la célula. Enjuague el colador celular con 2-3 mL de medio de cultivo celular. (Figura 1I)</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico que contiene cardiomiocitos durante 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspirar el sobrenadante (figura 1 K), que contienen restos de tejidos celulares y Resuspenda el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo celular (figura 1 L).</li>
	<li>Resuspender las células y las células de la placa sobre una placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún tipo de recubrimiento de plástico) e Incube por 1 h en una incubadora de cultivo celular (pre-placas 1) (figura 1 M). Este paso de la pre-galjanoplastia permite no cardiomiocitos, como fibroblastos y células endoteliales, a adherirse a la placa de cultivo de células sin recubrimiento. Nota: En este punto, cardiomiocitos son típicamente una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. (Figura 1N).</li>
	<li>Después de la incubación de 1 h, suavemente agite la placa, lave las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm y Resuspenda las células mediante pipeteo repetidamente el medio de cultivo celular sobre el plato con una pipeta serológica de 10 mL. Luego, transferir las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún recubrimiento de plástico) e incubar durante una 1 h adicional en una incubadora de cultivo celular (placas previos 2 º). Nota: Las células que se adhieren a la placa sin revestimiento son dominantemente no cardiomiocitos: fibroblastos y células endoteliales, que pueden visualizarse bajo el microscopio (figura 1O).</li>
	<li>Después de 2 º pre-galjanoplastia, suavemente agitar la placa, lave las células no adherentes (cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm, luego transferir los cardiomiocitos en un nuevo tubo cónico de 50 mL.</li>
</ol>5. recuento de células y células de revestimiento en una placa de cultivo celular de 96 pozos (día 1)
<ol><li>Contar las células usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Las células de la placa en una placa de cultivo celular de 96 pozos matriz extracelular revestido con una densidad entre 10 – 30 x 103 células/pocillo utilizando una pipeta multicanal en un volumen final de 200 μl (figura 1 P). Utiliza pozos A1, A12, H1 y H12 para fondo: Añadir 200 μL de medio de cultivo como otros pozos en estos pozos (sin células). Incube la placa en una incubadora de 37 ° C de la célula cultura. Nota: En este estudio, el consumo de oxígeno fue probado mediante el uso de densidades de diferentes células como 10 x 103, 20 x 10330 x 103 células/pocillo. (Figura 2A). También, como arriba, cardiomiocitos inmediatamente después del aislamiento suelen ser una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. Células viables se aplanen en 16-24 h de cultivo.</li>
</ol>6. oxígeno consumo ensayo utilizando un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos (día 2)
Nota: Ensayo de consumo de oxígeno puede llevar a cabo un día después de las células de la galjanoplastia o posterior. Cardiomiocitos neonatales cultivados utilizando este protocolo puede sobrevivir hasta 7 días post aislamiento.
<ol><li>Un cartucho de sensor de flujo analizador del hidrato (véase Tabla de materiales) durante al menos 3 horas, pero ideal para un día completo, antes de la prueba. Añadir 200 μL de solución Calibrant (véase Tabla de materiales) en cada pocillo de la placa de la utilidad, el cartucho de sensor vuelva a colocar la placa de la utilidad e incubar en una incubadora de 37 ° C sin CO2 o O2 suplementación.</li>
	<li>Cambiar los medios de cultivo celular al medio de prueba de estrés de las mitocondrias una hora antes del ensayo. Cardiomiocitos son frágiles. Por lo tanto, suavemente quitar los medios de cultivo celular mediante una pipeta multicanal y lavan las células con 200 μL de los medios de prueba de estrés mitocondrial precalentado dos veces. Después del segundo lavado, añadir 175 μl de los medios de prueba de estrés con las mitocondrias y las células en una incubadora de 37 ° C sin CO2 o O2 suplementos de la cultura.</li>
	<li>Preparar compuestos de prueba concentrado. Para prueba de esfuerzo de las mitocondrias, preparar 3,0 mL de 16 oligomycin μm, μm 9 FCCP y una mezcla de 20 rotenona μm y 20 μm antimicina A, todo en medio de la prueba de estrés mitocondrial. Nota: Cada compuesto en la concentración que se describe ha sido probado. Sin embargo, es necesario valorar la concentración de cada compuesto en laboratorio propio.</li>
	<li>Carga 25 μl de cada compuesto en los orificios del inyector del cartucho sensor utilizando una pipeta multicanal (figura 1Q). El volumen y la concentración final se describen en la tabla 2.</li>
	<li>Configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular. El programa se describe en tabla 3.
</li>
	<li>Inicie el programa. En primer lugar, ponga el cartucho de sensor en la máquina de calibración (figura 1R). Reemplazar el calibrant para la placa de ensayo una vez hecho el paso de calibración. Nota: Utilizando el software proporcionado por el fabricante, indican grupos de pozos y cada uno de ellos y el puerto.</li>
	<li>Si lo desea, después del ensayo, deseche cuidadosamente todo medio de ensayo usando una pipeta multicanal y almacenar la microplaca de la cultura de célula a-20 ° C para la normalización de la futura célula usando análisis de proteína.</li>
	<li>Medir el contenido de proteína. Añadir 50 μl de solución de lisis de la célula RIPA estándar (véase Tabla de materiales). Incubar la placa de hielo durante 30 minutos completamente Lyse las células. Transferir todo el material para una nueva placa de ensayo bien fondo claro plano 96.</li>
	<li>Medir la concentración de proteína por ensayo BCA según protocolo del fabricante. Nota: Recubrimiento del pozo con matriz extracelular resulta en una concentración de proteínas en cada pozo. Por lo tanto, restar la cantidad de pozos fondo (sin células) para obtener la concentración de la proteína de la célula real. La concentración de proteína derivada de células es baja en una placa de cultivo de 96 pozos. Además, la concentración de proteína puede variar de pozo a pozo debido a la capa de matriz extracelular. Por lo tanto, se sugiere usar numero de celular para normalizar el OCR.</li>
</ol>

<ol><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li>
<li>Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction%2C+growth%2C+and+survival+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li>
<li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116(2015).</li>
<li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+College+Cardiololgy%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li>
<li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).</li>
<li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document%3A+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li>
<li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recounting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li>
<li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vissualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li>
<li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+basal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li>
<li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).</li>
<li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013).</li>
<li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li>
<li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells%3A+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li>
<li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+%28Drp1%29-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li>
<li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li>
<li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart%2Fmuscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li>
<li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li>
<li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+extracellular+flux+%28XF%29+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li>
<li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li>
<li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+cardiomyopathy%3A+every+substrate+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li>
<li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

En este estudio, hemos establecido un protocolo simple para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mediante el uso de estos cardiomiocitos, hemos optimizado también las condiciones para medir la tasa de consumo de oxígeno mediante un sistema de analizador de flujo extracelular. El protocolo permite utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como un modelo de sistema para examinar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en las células principales del trabajo del corazón, simil...

Para mantener una función contráctil cardiaca continua, cardiomiocitos deben mantener un suministro constante de energía celular principalmente en forma de ATP1. En el corazón, se genera aproximadamente el 95% de ATP por las mitocondrias, principalmente a través de la fosforilación oxidativa, mostrando que las mitocondrias desempeñan un papel crucial de la bioenergético en la función cardiaca2,3. Apoyo a esta noción es que la desregulación de la función mitocondrial puede conducir a cardiomiopatía e insuficiencia cardíaca4,5. Por el contrario, restauración de la función mitocondrial se ha demostrado para mejorar la función cardiaca de la falla del corazón6,7. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de la bioenergética mitocondrial y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial en los cardiomiocitos no sólo revela ideas mecanicistas de la producción energética cardiaca pero también pueden proporcionar la penetración que desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades del corazón6,8.
Comparado con el corazón entero, que contiene una mezcla de miocitos y miocitos no9, cultivos de cardiomiocitos son extremadamente puro, con la mínima contaminación de no miocitos del corazón, tales como fibroblastos y células endoteliales10. Además, aislar los cardiomiocitos de los cachorros neonatales permite cultivar un gran número de células en una pequeña cantidad de tiempo, comparado con el aislamiento de las células de corazones adulto10,11. Lo más importante, ratón adulto culto primario cardiomiocitos tienen supervivencia corta veces (p. ej. 24 h) y en tiempo de puntos de diferencian. Cardiomiocitos neonatales ratón pueden sobrevivir y ser manipulada por más de 7 días en cultivo, lo que es ideal para probar los efectos de los compuestos de drogas y manipulación de genes en la función de la mitocondria en cardiomiocitos10. Por supuesto, existen diferencias biológicas importantes entre las células de adulto y neonatales, pero la duración más larga disponible para el cultivo de células neonatales los hace apropiados para diferentes tipos de estudios, los de la función mitocondrial incluidos.
Hasta la fecha, cardiomiocitos neonatales cultivados primarias de la rata y ratón se han utilizado como modelos para estudiar bioenergética cardíaca12,13. En los últimos años, estudios utilizan un analizador de flujo extracelular para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y evaluar la capacidad oxidativa en ratón y rata cardiomiocitos neonatales14,15. Mientras que en comparación con las ratas, la viabilidad celular de cardiomiocitos neonatales de ratón es menor y tiene una mayor variabilidad16. Además, la capacidad para el estudio de células a partir de modelos de ratón modificados genéticamente hace muy importante el modelo de célula de ratón. Dado que estudios de OCR son tan sensibles a la célula número y densidad de siembra, es necesario el desarrollo de un protocolo simple, reproducible y confiable para lograr la viabilidad y rendimiento constante de la célula.
Aquí, Divulgamos un protocolo optimizado que se ha desarrollado que utiliza ratón cultivados cardiomiocitos neonatales junto con un analizador de flujo extracelular 96-bien-formato para el análisis de OCR. Este protocolo aumenta la reproducibilidad del ensayo. Además, el Protocolo no sólo proporciona un método reproducible para el análisis de OCR y novela, sino que también podría adaptarse a una cultura más grande de tamaño para propósitos experimentales, como la que puede ser necesario estudiar las funciones miofibrilar e intracelular vías de señalización.
En particular, este protocolo describe un procedimiento de un día para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón en una placa de cultivo celular de 96 pozos. Además, describe el procedimiento para medir el consumo de oxígeno usando un analizador de flujo extracelular. Todas las soluciones utilizadas son estériles o filtrado estéril. Todas las herramientas son esterilizadas por el etanol del 75%. Le ofrecemos una Tabla de materiales para diferentes partes del procedimiento. Para el cultivo de cardiomiocitos, todos los procedimientos y pasos se llevan a cabo en una campana de la cultura de célula estándar. Este protocolo está desarrollado para el aislamiento de corazones de ratón neonatal de una camada (aproximadamente 8-10 crías). Sin embargo, el protocolo también puede adaptarse para aislar cardiomiocitos de camadas múltiples.

<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td><td>Inhibe el complejo III de las mitocondrias</td></tr><tr><td>Filtro de células 100 &mu; m poros</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Para capturar tejido no digerido</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Para hacer colagenasa solución de digestión</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>SIGMA</td><td>75351</td><td>Para hacer medio de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa</td><td>Life technologies</td><td>11965-092</td><td>Para hacer medio</td></tr> <tr><td>de cultivo celularDMEM sin NaHCO3, glucosa, piruvato, glumanina y hepes</td><td>SIGMA</td><td>D5030-10X1L</td><td>Para hacer el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>FCCP (Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Desacopla la respiración mitocondrial</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>26140-079</td><td>Para hacer medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Fibronectina a partir de plasma bovino</td><td>SIGMA</td><td>F1141-5MG</td><td>Para hacer la solución de recubrimiento para placas de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencias finas</td><td>14060-10</td><td>Para la disección de corazones</td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Para hacer solución de recubrimiento para placas de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>HBSS (solución salina equilibrada de Hank, sin Ca2+, Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>Para lavar corazones y hacer solución de predigestión y digestión de colagnasa</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher scientific</td><td>15630080</td><td>Para hacer medio de prueba de esfuerzo mitocodnrial</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Life technologies</td><td>26050-088</td><td>Para hacer medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>SIGMA</td><td>G-3126</td><td>Para hacer medio de prueba de esfuerzo mitocodnrial</td></tr><tr><td>M-199</td><td>Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td>Para hacer sustrato celular</td></tr><tr><td>Cuchara Moria</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9190356</td><td>Para lavar corazones&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>SIGMA</td><td>75351-5MG</td><td>Inhibe la ATP sintasa mitocondrial</td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Fisher scientific</td><td>89900</td><td>Para lisar las células para el ensayo de proteínas</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Inhibe el complejo I de las mitocondrias Caballito</td></tr><tr><td>de mar XFe96 Analizador de flujo extracelular </td><td>Agilent</td><td></td><td>Dispositivo utilizado para analizar la tasa</td></tr> <tr>de consumo de oxígeno<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Paquete de placas de cultivo del analizador de flujo, cartuchos de sensor y calibrante</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Para hacer el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>Tijeras rectas</td><td>Herramientas de ciencias finas</td><td>91401-12</td><td>Para la disección de corazones</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.2 &mu; tamaño</td><td></td><td></td> m <td>Para la filtración estéril del medio de digestión</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>USB Corporation</td><td>22715 25GM</td><td>Para hacer la solución de predigestión</td></tr></tbody></table>

analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Mitocondrias y metabolismo oxidativo son críticos para mantener la función del músculo cardiaco. Investigaciones han demostrado que la disfunción mitocondrial es un factor importante que contribuye al deterioro de la función cardiaco en insuficiencia cardíaca. Por el contrario, la restauración de la función mitocondrial defectuosa puede tener efectos beneficiosos para mejorar la función cardiaca en el corazón de la falla. Por lo tanto, estudiar los mecanismos de regulación y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial pueden proporcionar la penetración que podría utilizarse para desarrollar nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades del corazón. Aquí, la respiración mitocondrial del miocito cardiaco se analiza mediante un sistema de cultivo de célula única. En primer lugar, se ha optimizado un protocolo para aislar rápidamente y cultura alta viabilidad neonatal ratón cardiomiocitos. Entonces, un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos se utiliza para evaluar la tasa de consumo de oxígeno de estos cardiomiocitos. De este protocolo, optimizar las condiciones de siembra y demostró que tasa de consumo de oxígeno de cardiomiocitos de ratón neonatal puede evaluarse fácilmente en un analizador de flujo extracelular. Por último, observamos que nuestro protocolo se puede aplicar a un tamaño más grande de la cultura y análisis de la función de otros estudios, como la señalización intracelular y contráctil.

Mediante el protocolo descrito, corazones fueron aislados de los cachorros neonatales día 0. se obtuvieron 5 x 105 células/pup y cardiomiocitos fueron sembrados a densidades de 10 x 103, 20 x 103o 30 x 103 células/pocillo, en placas bien 96 (figura 2A). Después de la cultura durante la noche, se encontraron cardiomiocitos bien adheridos a la superficie recubierta de plástico y había muy pocas células sueltas (las cé...

El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Este protocolo nos permite aislar y cultivar alto bi-BBT, conocido sólo por los cardiomiocitos de ratón. Para evaluar la función mitocondrial, la tasa de consumo de oxígeno de los cardiomiocitos puede ser analizada por un analizador de flujo de plata real. Una de las ventajas de esta técnica es que el consumo de oxígeno de los cardiomiocitos se puede medir fácilmente en su estado adherente en formato de 96 pozos, lo que permite realizar pruebas de múltiples condiciones con un gran número de réplicas.Este buque proporciona información importante sobre el área de investigación de cardiología. Además del consumo de oxígeno, también podemos estudiar otros parámetros metabólicos, como las greygrices y la epoxidación perácea. Lograr una alta variabilidad de los cardiomiocitos es fundamental para este experimento.Esto requiere una digestión eficiente de los corazones. Dado que los cardiomiocitos neonatales son muy frágiles, también es importante un manejo suave de los cardiomiocitos. En la capucha de cultivo celular, aliquot 5ml de HBSS a cada pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos y colóquelo en hielo.Además, alícuota 10ml de HBSS a un plato de cultivo celular de 10 cm, luego, preparar 20 ml de solución de predigestión de trippsina en un tubo cónico estéril de 50 ml. Mantenga todas las soluciones en hielo. A continuación, extraiga el corazón y transfiéralo inmediatamente al plato de cultivo celular estéril que contiene HBSS.Retire cualquier tejido pulmonar residual y vasos más grandes. Lave el corazón con HBSS con agitación suave. Posteriormente, cortar el corazón con tijeras finas en 8 piezas y transferir el tejido cardíaco con fórceps en un pozo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con HBSS.Usando una cuchara de moria, lave el tejido cardíaco transfiriéndolo de pozo a pozo en el plato de 6 pozos lleno de HBSS. Luego transfiera el tejido cardíaco a un tubo cónico que contenga 20 ml de Tripppsin e incubar con agitación suave a 4 grados centígrados durante 4 horas. En este procedimiento, precalienta la solución de digestión de colagenasa en un baño de agua a 37 grados centígrados.Transfiera el tubo cónico que contiene tejido cardíaco y la solución de predigestión de 4 grados centígrados a una capucha de cultivo celular. Deje que el tejido cardíaco se hunda hasta la parte inferior del tubo y retire la solución de predigestión utilizando una pipeta serológica de 10 ml. A continuación, agregue 10 ml de HBSS en el tubo.Resuspender el tejido cardíaco con HBSS 2 a 3 veces para lavar Trypsin con una pipeta serológica de 10 ml. Aspirar HBSS y añadir 10 ml de solución de digestión de colágeno precalentado en el tubo con tejido cardíaco. Para la primera digestión, incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos sin agitación.Después, transfiera el tubo a la campana de cultivo celular. Triturar el tejido resuspendiéndolo suavemente 10 veces usando una pipeta serológica de 10 ml. Esto permitirá que el corazón se disperse y que las células se liberen del tejido cardíaco.Deja que el tejido no digerido se hunda. Transfiera la solución digerida enriquecida en cardiomiocitos a un nuevo tubo cónico e inmediatamente agregue una cantidad igual de medio de cultivo celular para detener la digestión de la colagenasa. A continuación, agregue 10 ml de solución de digestión de colagenasa en el tubo que contiene el tejido cardíaco no digerido restante.Para la segunda digestión, incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 10 minutos. Repita los procedimientos de la primera digestión y transfiera la solución digerida enriquecida en cardiomiocitos a un nuevo tubo cónico antes de detener la digestión de la colagenasa. A continuación, coloque un colador celular estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.Pre-humedecer el colador celular con 2 a 3 ml de medio de cultivo celular y pasar las células a través del colador celular. Posteriormente, enjuague el colador celular con un medio de cultivo celular. Luego, centrifuga el tubo cónico que contiene cardiomiocitos durante 5 minutos a 180 veces la gravedad.Después de 5 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 10 ml de medio de cultivo celular. Ina las células en un plato de cultivo celular de 10 cm e incubarlas durante una hora. Después, agita suavemente el plato.Lavar las células no adherentes y resuspender las células pipeteando repetidamente el medio de cultivo celular sobre el plato usando una pipeta serológica de 10 ml. Luego, transfiera las células no adherentes a un nuevo plato de cultivo celular de 10 cm e incubarlas durante otra hora. Después de una hora, agitar suavemente el plato y lavar las células no adherentes.Transfiera los cardiomiocitos a un nuevo tubo cónico de 50 ml. A continuación, prepare una placa de cultivo de 96 pozos alí citando 50 microlitros de solución de recubrimiento en cada pozo de la placa de cultivo celular de 96 pozos. Si hay burbujas, retírelas con una pipeta de 20 microlitros.Incubar la placa a 37 grados centígrados durante al menos una hora para permitir el secado del recubrimiento de la matriz. Luego, cuente las células usando un hemocicómetro. Placar las células en la matriz extra-celular recubierto placa de cultivo celular de 96 pozos a una densidad entre 10 a 30 mil células por pozo.Y coloca las células en la incubadora. Para preformar el ensayo de consumo de oxígeno, hidrate un cartucho de sensor de analizador de flujo durante al menos 3 horas, agregue 200 microlitros de solución calibradora en cada pozo de la placa de servicio. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de identificación e i incubar en 37 grados centígrados sin suplementos de CO2 u O2 durante al menos 3 horas.Una hora antes del ensayo, retire suavemente el medio de cultivo celular y lave las células con 200 microlitros de medio de prueba de esfuerzo mitocondrial precalentado dos veces. Después del segundo lavado, agregue 175 microlitros de medio de prueba de esfuerzo mitocondrial precalentado. Luego cultiva las células a 37 grados centígrados sin suplementos de dióxido de carbono ni oxígeno.Preparar 3ml de cada uno de los compuestos de prueba en medio de prueba de esfuerzo mitocondrial. Cargue 25 microlitros de cada compuesto en los puertos del inyector del cartucho del sensor utilizando una pipeta multicanal. El estado de las células y los pretratamientos pueden afectar a la restauración máxima provocada por la inyección del desacoplador FCCP.La sensibilidad celular al desacoplador también puede cambiar, por lo tanto, es fundamental optimizar la concentración de trabajo de FCCP para cada tratamiento en particular. Posteriormente, configure el protocolo de ensayo de flujo extracelular e inicie el programa. En primer lugar, coloque la cartiridge del sensor en la máquina para su calibración.Sustituya el calibrador de la placa de ensayo una vez que se haya realizado el paso de calibración. Si lo desea, después del ensayo, deseche cuidadosamente todo el medio de ensayo utilizando una pipeta multicanal. Y almacene el mircoplate de cultivo celular a 20 grados celsius negativos para la normalización celular futura usando el ensayo de proteínas.Mediante el uso del protocolo descrito, los corazones fueron aislados del día 0 cachorros neonatales y cardiomiocitos fueron sembrados a densidades de 10, 20 o 30 mil células por pozo en placas de 96 pozos. Después del cultivo nocturno, los cardiomiocitos se encontraron bien unidos a la superficie de plástico recubierta y había muy pocas células no conectadas. En este punto, la contraer espontáneamente cardiomiocitos era fácilmente visible.Una densidad de siembra de 30.000 células por pozo mostró confluencia un día después de la siembra a medida que las células se propagan. Los cardiomiocitos fueron inmunosutenidos con un anticuerpo contra la actinina alfa sarcomérica, un marcador específico de cardiomiocitos. Como se muestra aquí, la mayoría de las células mostraron tinción positiva de actinina alfa que indica la alta pureza del aislamiento de cardiomiocitos.Aquí se muestra un esquema de una prueba de esfuerzo mitocondrial típica. La prueba de esfuerzo mitocondrial comienza con una medición de la línea base de la tasa de consumo de oxígeno, esto es seguido por la inyección de miosina oligo que inhibe ATPA. Entonces, el agente de desacoplamiento FCCP fue inyectado para medir la tasa máxima de consumo de oxígeno.Finalmente, con la inyección de dos inhibidores complejos de transporte de electrones, la respiración mitocondrial se detiene por completo y el OCR disminuye a su nivel más bajo. Para obtener resultados consistentes y reproducibles. Es fundamental lograr una alta supervivencia.Por lo tanto, es importante utilizar neonatos recién nacidos y manejar suavemente los tejidos cardíacos en cardiomiocitos. Mediante el uso de líneas de ratón nuevas o existentes manipuladas genéticamente, este método se puede traducir fácilmente a datos que pueden conducir a la comprensión de nuevos mecanismos para la regulación bioenergética en el corazón. Los mitocondriales desempeñan un papel clave en la función cardíaca.Esperamos que este método ayude a identificar nuevos reguladores y vías que regulan el metabolismo oxidante y encontrar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.

analyzing-oxygen-consumption-rate-primary-cultured-mouse-neonatal

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste video explica cómo se utiliza el flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células de mamíferos vivas y permeabilizadas. Demuestra el uso secuencial de digitonina, sustratos metabólicos, ADP, un desacoplador y un inhibidor para caracterizar diferentes estados respiratorios. El perfil de flujo de oxígeno resultante revela la función mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento...

Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

La glucólisis es un marcador metabólico definitorio en múltiples sistemas biológicos. El monitoreo de la glucólisis mediante la medición del flujo extracelular de H+ es común, pero requiere una corrección para que sea cuantitativa e inequívoca. Aquí, demostramos cómo recopilar y corregir datos de flujo extracelular para distinguir entre las fuentes respiratorias y glucolíticas de acidificación extracelular.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

La tasa de consumo de oxígeno (OCR) es un indicador común de la función mitocondrial y se puede utilizar para estudiar diferentes modelos de enfermedades. Desarrollamos un nuevo método utilizando un analizador Seahorse XF para medir directamente el OCR en rodajas estriatales agudas de ratones adultos que es más relevante fisiológicamente que otros métodos.

Medición de la tasa de consumo de oxígeno en rodajas estriatales agudas de ratones adultos

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Presentamos un protocolo para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, permitiendo la administración dirigida de sustratos e inhibidores para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en células cultivadas, superando las barreras de transporte de la membrana plasmática que normalmente dificultan dichos análisis. Utilizando esta técnica, demostramos cómo la función de OXPHOS es modulada por agonistas y antagonistas muscarínicos.

Modulación dependiente del ligando colinérgico del acoplamiento fosforilado oxidativo en células neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

En este artículo, describimos un protocolo detallado para cuantificar la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular de los ventrículos de pez cebra adultos ex vivo, con el fin de caracterizar su capacidad metabólica oxidativa y glicolítica.

Evaluación de la actividad metabólica de ventrículos de pez cebra regenerador ex vivo mediante un ensayo de flujo extracelular

Aprende a medir el consumo de oxígeno en cardiomiocitos neonatales de ratón utilizando un analizador de flujo extracelular. Este protocolo permite evaluar la función mitocondrial en formato de 96 pocillos.

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular (Video) | JoVE Journal

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

Explorar más videos