Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

Este protocolo se puede utilizar para preparar materiales fúngicos y vegetales para la resonancia magnética nuclear de estado sólido, o RMN, y la polarización nuclear dinámica, o DNP, experimentos para la caracterización compleja del biosistema. Esta técnica nos permite investigar biomateriales a un nivel de resolución atómica en su entorno nativo, por ejemplo, en células enteras. La adquisición de información estructural de alta resolución sobre materiales fúngicos ayudará en el desarrollo de fármacos antifúngicos.

El método proporciona información sobre la composición y la estructura de carbohidratos complejos en las paredes celulares de hongos y se puede aplicar a muchos organismos ricos en carbohidratos, incluyendo plantas, hongos, algas y bacterias. Algunos investigadores pueden tener problemas con la contaminación por hongos en sus cultivos celulares. Mi consejo es esterilizar el medio y el equipo a fondo antes de su uso para evitar esta contaminación.

Esta demostración ayudará a los investigadores con poca experiencia en RMN o cultivo celular a aprender cómo implementar estas técnicas en sistemas de hongos y plantas. Para preparar un medio de crecimiento líquido sin etiquetar, disolver 6,5 gramos de dextrosa de peptona de extracto de levadura o polvo de YPD en 100 mililitros de agua destilada, y luego autoclave la solución resultante durante 25 minutos a 134 grados Celsius. Para preparar un medio de crecimiento sólido sin etiquetar, agregue 6,5 gramos de polvo de agar YPD a 100 mililitros de agua destilada, y autoclave el medio durante 25 minutos a 121 grados centígrados, antes de enfriar el medio a aproximadamente 50 grados centígrados.

A continuación, transfiera de 13 a 15 mililitros del medio de crecimiento sólido fundido a platos Petri de plástico estéril individuales, e inmediatamente coloque las tapas en los platos. Para preparar el medio de crecimiento líquido con etiqueta de nitrógeno-13, nitrógeno-15, ajuste un volumen de 100 mililitros de isótopo medio mínimo que contenga un pH de 6,6 con ácido o base según sea necesario. A continuación, disolver las sales enumeradas en la tabla en 100 mililitros de agua destilada, añadir al medio de crecimiento líquido con etiqueta de carbono-13, nitrógeno-15, y autoclave la solución resultante durante 25 minutos a 121 grados Celsius.

Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, añada 100 microlitros de solución de oligoelementos a todo el volumen de carbono-13, nitrógeno-15-etiquetado medio mínimo. Para cultivar los materiales fúngicos, utilice un bucle de inoculación para transferir una pequeña cantidad de hongos del almacenamiento a una placa YPD, y el cultivo del hongo durante dos días en una incubadora de grados Celsius de 30 grados. Al final de la incubación, utilice un nuevo bucle de inoculación para transferir un borde de hongos de crecimiento activo al medio de crecimiento líquido con etiqueta de carbono-13, nitrógeno-15, y coloque el cultivo en 30 grados celsius y 220 rotaciones por minuto durante tres a cinco días en una incubadora de temblores.

Cuando grandes cantidades del hongo cubran el fondo del matraz y floten en el líquido, recoja los hongos por centrifugación y deseche el sobrenadante. Hidratar el pellet con una solución adecuada, y utilizar fórceps para recoger alrededor de 0,5 gramos del pellet bien hidratado para análisis de RMN y DNP. A continuación, mezcle el material restante con una solución de 20% de glicerol en un tubo cónico y coloque la muestra de hongos a menos 80 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.

Para preparar el A.fumigatus para el análisis de RMN de estado sólido, primero utilice una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 3.5-kilodalton para marcar la muestra de hongos con etiqueta de nitrógeno de 0,5 gramos de carbono-13 contra un litro de búfer de fosfato de 10 mililitrolares a cuatro grados Celsius durante tres días para eliminar moléculas pequeñas del crecimiento medio. Al final de la diálisis, transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros para centrifugación, y empaque de 70 a 80 miligramos de la pasta de muestra etiquetada uniformemente con carbono-13 y bien hidratada en un rotor de dióxido de circonio de cuatro milímetros. Utilice una varilla metálica para apretar suavemente y repetitivamente la muestra, utilizando papel para absorber el exceso de agua.

A continuación, tapone firmemente el rotor e inserte la muestra en el espectrómetro para la caracterización de RMN de estado sólido. Para preparar el A.fumigatus para el análisis de DNP, agregue 100 microlitros de matriz DNP en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por muestra de hongos con etiqueta de carbono-15 y disuelva 0,7 miligramos de agente polarizador a cada tubo para formar una solución de stock radical de 10 milificaciones. Después de vórtices durante dos a tres minutos para asegurar que los radicales se disuelvan completamente en la solución, remoje 10 miligramos de carbono-13 dializado, muestra de hongos etiquetada con nitrógeno-15 en 50 microlitros de la solución del agente polarizador, y utilice un pestillo y un mortero para moler suavemente la mezcla para asegurar la penetración de los radicales en las paredes celulares porosas.

Agregue otros 30 microlitros de la solución radical al pellet molido para hidratar aún más la muestra de hongos, y empaquete el pellet en un rotor de zafiro de 3,2 milímetros. Apriete suavemente y retire el exceso de disolvente DNP como se ha demostrado, y agregue un tapón de silicona de 3,2 milímetros para evitar la pérdida de hidratación. A continuación, añada el rotor a un espectrómetro de RMN para un experimento de rutina o un espectrómetro DNP para la medición del espectro mejorado por DNP bajo irradiación de microondas.

Para preparar materiales vegetales para estudios DNP, utilice una cuchilla de afeitar para cortar el material vegetal etiquetado uniformemente con carbono-13 en piezas de uno a dos milímetros. Utilice un mortero y un mortero para moler las piezas en partículas más pequeñas hasta que el polvo final tenga un aspecto homogéneo. Añadir 40 microlitros de solución de stock radical de 10 mililitros al material vegetal, y moler ligeramente la muestra durante cinco minutos adicionales para asegurar una mezcla homogénea con el radical.

Hidratar la muestra de tierra con otros 20 microlitros de solución de stock radical, y empaquetar la muestra de planta equilibrada en un rotor de zafiro de 3,2 milímetros para el análisis DNP. A continuación, inserte un tapón de silicona para evitar la pérdida de hidratación y cargue la muestra en el espectrofotómetro DNP. El etiquetado de isótopos mejora sustancialmente la sensibilidad a la RMN y permite medir una serie de espectros de correlación de carbono-13-carbono-13 y carbono-13-nitrógeno-15 bidimensionales para analizar la composición, hidratación, movilidad y embalaje de los polímeros para su integración para la construcción de un modelo tridimensional de arquitectura de pared celular.

Si las señales fuera de la diagonal son difíciles de obtener en el espectro 2D de carbono-13-carbono-13, el etiquetado estadístico podría haber ocurrido. Los dos picos de carbono-13 de 96 y 92 partes por millón son señales de carbono-1 de la firma de glucosa. Por lo tanto, sus intensidades fuertes en los espectros cuantitativos de polarización directa de carbono-13 medidos con largos retrasos de reciclaje de 35 segundos suelen indicar el dominio de moléculas pequeñas debido a la diálisis o lavado incompletos.

Con muestras bien etiquetadas, las correlaciones de largo alcance se pueden medir aún más para detectar las proximidades espaciales de las biomoléculas y para construir un modelo estructural de las paredes celulares intactas. Esta técnica permite explorar la función de la estructura en muchos materiales naturales y diseñados, facilitando estudios futuros de biomateriales ricos en carbohidratos y polímeros funcionalizados. Como algunos hongos pueden causar infecciones o enfermedades sistemáticas en los seres humanos, asegúrese de manejar materiales fúngicos en una capucha de flujo laminar para protegerse y minimizar la exposición.