Name: Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a preparar hongos y plantas para RMN de estado sólido con polarización nuclear dinámica. Este método permite caracterizar biosistemas complejos a resolución atómica en su entorno nativo para estudios estructurales.

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Este trabajo fue financiado por National Science Foundation a través de OIA NSF-1833040. El laboratorio nacional de campo magnético alto (NHMFL) es apoyado por la National Science Foundation a través del DMR-1157490 y el estado de Florida. El sistema MAS-DNP en el NHMFL es financiado en parte por los NIH S10 OD018519 y NSF CHE-1229170.

1. crecimiento de 13C, 15N-labeled Aspergillus fumigatus medio líquido
<ol><li>Elaboración de etiqueta y 13C, 15medio marcado con N Nota: Ambos medio de levadura extracto peptona dextrosa (YPD) y la media mínima mejora43 se utilizaron para el mantenimiento de la cultura fungicida. Se realizan todos los pasos después de autoclavar en campana de flujo laminar para reducir al mínimo la contaminación.<ol>
<li>Preparación de medio líquido sin etiqueta: Disolver 6,5 g de YPD polvo en 100 mL de agua destilada y luego autoclave durante 25 minutos a 134 ° C.</li>
		<li>Preparación de medio sólido sin etiqueta<ol>
<li>Añadir 1,5 g de agar y 6,5 g de YPD polvo en 100 mL de agua destilada.</li>
			<li>Autoclave el medio durante 25 minutos a 121 ° C y luego enfriar hasta aproximadamente 50 ° C.</li>
			<li>13-15 mL del medio de transferencia en cada plato de Petri de plástico previamente estéril y cubrir el plato con una tapa inmediatamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparación de 13C, medio líquido marcado con N 15 Nota: Para prepararse la solución crecimiento para Isótopo etiquetado, un medio mínimo que contiene 13C-glucosa y nitrato de 15N-sodio y una solución de elementos traza son preparados por separado y luego mezclados antes de su uso.<ol>
<li>Preparar 100 mL de medio mínimo que contiene el isótopo que se enumeran en la tabla 1. Ajustar el pH a 6,6 con solución de HCl (1M) o NaOH (1 M).</li>
			<li>Autoclave el medio mínimo durante 25 minutos a 121 ° C.</li>
			<li>Preparar 100 mL (1, 000 x) de la solución de elementos traza, disolver las sales que se enumeran en la tabla 2 en el agua destilada. Autoclave de la solución durante 25 minutos a 134 ° C. Enfriar y almacenar la solución a 4 ° C para uso a corto plazo. El pH será de 6.5 y puede comprobarse utilizando un medidor de pH.</li>
			<li>Añadir 0,1 mL de solución de elementos traza a 100 mL de 13C, 15marcado con N un medio mínimo que se enumeran en la tabla 2 antes de usar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crecimiento de los hongos materiales<ol>
<li>Transferir una pequeña cantidad de hongos de almacenamiento en un plato YPD utilizando un asa de inoculación en una campana de flujo laminar. Conservar el cultivo a 30 º C durante 2 días en una incubadora.</li>
		<li>Utilizar un asa de inoculación para transferir un activo crecimiento hongos borde a 13C,15etiquetado N solución en campana de flujo laminar. Conservar el cultivo a 30 º C durante 3-5 días a 220 rpm en un incubador de agitación.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g durante 20 min retirar el sobrenadante y recoger el diábolo.</li>
		<li>Utilizar una pinza para recoger ~0.5 g de pellets bien hidratado (> 50 wt % la hidratación) estudios NMR. Pérdida de hidratación en cualquier momento empeora sustancialmente la resolución espectral. Nota: Si es necesario, una cantidad pequeña (0.1 g) de micelio hidratada puede ser separada y secada completamente bajo flujo de gas N2 en una campana o un liofilizador para estimar el nivel de hidratación y calcular el porcentaje de masa secando. Generalmente, un pellet que contiene ~0.3 g masa seca puede obtenerse después de 3 días. Si el experimento NMR a llevarse a cabo es largo (> 7 días) o si el estado de los hongos tiene que ser fijo, el material fungoso se puede ser profundamente congelado en líquido N2 10-20 min antes de proseguir. Si el experimento va a ser corta (3-6 días), la congelación puede ser saltada para que la muestra puede permanecer fresca.</li>
		<li>Mezclar el material en exceso con el 20% (v/v) de glicerol en un tubo de centrífuga y guardarlo en un congelador de-80 ᵒC para el almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de a. fumigatus para NMR de estado sólido y los estudios de DNP
<ol><li>Preparación de a. fumigatus para experimentos de NMR de estado sólidos<ol>
<li>Dializan 13C, 15N etiquetado hongos muestra (paso 1.2.4.) contra 1 L de 10 mM de tampón fosfato (pH 7.0) a 4 ° C utilizando una bolsa de diálisis con un 3.5 kDa de peso molecular límite para eliminar moléculas pequeñas desde el medio de crecimiento durante un período total de 3 días. Cambiar la memoria intermedia dos veces al día. Nota: Alternativamente, la muestra podría ser lavada para 6 - 10 veces con agua desionizada para eliminar moléculas pequeñas residual.</li>
		<li>Transferir la muestra en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 minutos (10.000 x g) utilizando una centrífuga de sobremesa. Quite el sobrenadante y recoger el resto de los materiales fungicida.</li>
		<li>Paquete de 70-80 mg de la uniforme 13muestra C-etiquetados y bien hidratada pasta en ZrO2 rotor de 4 mm o 30-50 mg a rotores de 3,2 mm para experimentos de NMR. Repetitivamente apriete la muestra suavemente con una varilla de metal y absorber el exceso de agua utilizando papel.</li>
		<li>Firmemente la tapa del rotor e Inserte la muestra en el espectrómetro para la caracterización de NMR de estado sólido. Nota: Los rotores nuevo se sugieren para minimizar la posibilidad de bloqueo de rotor y muestra derrame en el espectrómetro de RMN. Si es necesario, puede utilizarse un implantable desechable de Kel-F con tornillos de estanqueidad para servir como un contenedor secundario dentro del rotor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de muestras de a. fumigatus para experimentos DNP<ol>
<li>Preparar 100 μl de DNP solventes29,44 (también conocida como la matriz de la DNP) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para 13C,15muestras de hongos N-labeled. Esta matriz DNP contiene una mezcla de d8-glicerol/D2O/H2O (30/60/10 Vol %). Nota: Si muestras ser investigado, luego preparar la matriz DNP mediante 13C-agotado d8-glicerol (12C3, 99.95%; D8, 98%) y D2O H2O para evitar 13C señal contribución de los solventes.</li>
		<li>Se disuelven 0,7 mg de AMUPol45 en 100 μl de solventes DNP para forma 10 mM radical solución. Vortex por 2-3 min para asegurarse de que los radicales se disuelven completamente en la solución.</li>
		<li>Remojar 10 mg del dializado 13C, 15N etiquetado hongos materiales como se describe en los pasos anteriores (pasos 2.1.1 y 2.1.2) en 50 μl de solución AMUPol y moler suavemente la mezcla utilizando un mortero y una maja para asegurar la penetración de los radicales en la pared celular porosa. Nota: Para reducir la tasa de pérdida de hidratación, el rectificado también puede tener lugar en un tubo de microcentrífuga utilizando un micropestle.</li>
		<li>Añadir otro 30 μl de la solución radical a la pastilla molida al hidrato más la muestra de hongos.</li>
		<li>Paquete de la pelotilla en un rotor de zafiro de 3,2 mm, apriete suavemente y eliminar el disolvente sobrante del DNP. Añadir un tapón de silicona de 3,2 mm para evitar la pérdida de hidratación. Por lo general, 5-30 mg de la muestra puede ser embalado para el rotor. La cantidad exacta debe ser determinada por el requisito de sensibilidad de los experimentos de NMR a llevarse a cabo.</li>
		<li>Insertar y girar la muestra en un espectrómetro de DNP, medir un espectro de DNP-realzada bajo irradiación de microondas y compararlo con el espectro de microondas. Esto conducirá a una mejora factor εencendido, que debe ser 20-40 para estos materiales complejos. Ejecutar los experimentos diseñados para determinar la estructura de la pared celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de biomasa vegetal para RMN y estudios DNP
<ol><li>Preparación de materiales de planta para NMR de estado sólido<ol>
<li>Producir uniformemente 13C-labeled plantas internas usando 13CO2 fuentes en una cámara o 13glucosa C medio de cultivo como se describe anteriormente46,47 o directamente comprar materiales etiquetados de empresas de etiquetado de isótopo. Nota: 13C-glucosa puede utilizarse en crecimiento oscuro para evitar la introducción de 12C por fotosíntesis.</li>
		<li>Cortar el uniforme 13C etiquetado como material vegetal en trozos pequeños (típicamente 1-2 mm de dimensión) usando una cuchilla de un laboratorio. Nota: Dependiendo de la finalidad, las paredes de la célula extraídas se utiliza a veces para caracterización estructural y se divulgan los protocolos detallados en anteriores estudios21,46.</li>
		<li>Si previamente fue secada la muestra, añadir 100 μl de agua a 30 mg de material vegetal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, vortex, equilibren a temperatura ambiente por 1 día. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min y retirar el exceso de agua con una pipeta.</li>
		<li>Si la muestra se seca nunca en cualquier punto, utilizar directamente la muestra sin tratamiento adicional.</li>
		<li>Paquete de los materiales resultantes de la planta en 3.2 mm o 4 mm ZrO2 rotores para experimentos de NMR de estado sólidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de materiales vegetales para estudios DNP<ol>
<li>Preparar la solución madre de 60 μL de 10 mM AMUPol radical como pasos descritos 2.2.1 y 2.2.2.</li>
		<li>Cortar el uniforme 13C etiquetado como material vegetal para ser estudiado en trozos pequeños (1-2 mm de dimensión) usando una cuchilla de un laboratorio y pesan 20 mg de los materiales de planta.</li>
		<li>Mano-moler los trozos de planta en partículas pequeñas (~ 1-2 mm de tamaño) usando un mortero y una maja. Los polvos finales tienen un aspecto homogéneo.</li>
		<li>Agregar 40 μl de la solución madre de DNP preparado en el paso anterior (paso 2.2.2) para el material vegetal y moler suavemente durante 5 minutos asegurar la homogénea mezclando con el radical.</li>
		<li>Añadir otro 20 μl de la solución madre para hidratar aún más el material vegetal después de la molienda.</li>
		<li>Paquete de la muestra de planta equilibrado en un rotor de zafiro de 3,2 mm para experimentos DNP. Introduzca un tapón de silicona para evitar la pérdida de hidratación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. experimentos de NMR de estado sólido norma para la inicial caracterización de biomateriales ricos en hidratos de carbono
Nota: Un breve resumen de los experimentos de NMR se proporciona en esta sección. Sin embargo, elucidación estructural típicamente requiere de amplia experiencia. Por lo tanto, se recomienda esfuerzos de colaboración con espectroscopistas NMR.
<ol><li>Medida D 1 13C Cruz de polarización (CP), 13C polarización directa (PD) con 2 y 35 reciclar retrasos y 1H -13C inepto48,49 espectros para obtener una comprensión general de la dinámica distribución de componentes de la célula (Figura 1a). Las paredes celulares son típicamente la porción relativamente rígida y exhibir las señales dominantes en el espectro de la CP.</li>
	<li>Medir una serie de experimentos de correlación estándar 2D 13C -13C para asignaciones de resonancia de 13C señales. Comenzar con insuficiente reorientación50,51 para obtener conectividad de carbono, que necesidad de ser asistido por una serie de experimentos a través de espacio como 1.5-ms RFDR52 (Figura 1b) y cable de 50 ms/DARR53 experimentos. Nota: Si es de interés para encontrar una muestra rica en un componente específico, por ejemplo, la primaria o las paredes celulares secundarias, luego varios segmentos o múltiples plantas deba medirse por separado para encontrar la muestra con la composición óptima.</li>
	<li>Realizar experimentos de correlación de13C 2D 15N - que pueden ser medidos para facilitar las tareas de la resonancia de proteínas y carbohidratos de nitrogenados. Nota: La asignación de la resonancia es generalmente desperdiciador de tiempo. Un método está desarrollando para facilitar la asignación de la resonancia de las señales de hidratos de carbono para los científicos sin experiencia previa.</li>
	<li>Medir más especializados experimentos para determinar las cercanías espaciales (figura 1C, d), hidratación y movilidades de biomoléculas complejas para determinar la estructura tridimensional de los materiales ricos en carbohidratos como sistemáticamente se ha descrito anteriormente22,29.</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

En comparación con los métodos bioquímicos, NMR de estado sólido tiene ventajas como una técnica no destructiva y de alta resolución. NMR es también cuantitativa en el análisis compositivo, y a diferencia de la mayoría otros métodos analíticos, no han las incertidumbres introducidas por la solubilidad limitada de los biopolímeros. Establecimiento del protocolo actual facilita futuros estudios sobre biomateriales ricos en hidratos de carbono y polímeros funcionalizados. Sin embargo, debe señalarse que el análisis de datos...

Hidratos de carbono juegan un papel central en varios procesos biológicos tales como almacenamiento de energía, construcción estructural y reconocimiento celular y adhesión. Se enriquecen en la pared celular, que es un componente fundamental en plantas, hongos, algas y bacterias1,2,3. La pared celular sirve como una fuente central para la producción de biocombustibles y biomateriales, así como un objetivo prometedor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.
La comprensión contemporánea de estos materiales complejos se ha avanzado sustancialmente por décadas de esfuerzos que se dedicaron a la caracterización estructural mediante cuatro principales métodos bioquímicos o genéticos. El primer método principal se basa en tratamientos secuenciales usando productos químicos fuertes o enzimas para romper las paredes celulares en diferentes porciones, que es seguida de composición y análisis del acoplamiento de los azúcares en cada fracción de10. Este método arroja luz sobre la distribución del dominio de los polímeros, pero la interpretación puede ser engañosa debido a las propiedades químicas y físicas de las biomoléculas. Por ejemplo, es difícil determinar si la fracción extraíble de álcali origina de un solo dominio de moléculas menos estructurados o de moléculas espacialmente separadas con solubilidad comparable. En segundo lugar, las porciones extraídas o toda las paredes celulares puede también medirse usando la solución NMR para determinar la vinculación covalente, denominada también como entrecruzamiento entre moléculas diferentes11,12,13, 14,15. De esta manera, la detallada estructura de covalentes anclajes podría ser sondada, pero pueden existir limitaciones debido a la baja solubilidad de los polisacáridos, el relativamente pequeño número de sitios de entrecruzamiento y la ignorancia de los efectos no covalente que estabiliza embalaje de polisacáridos, incluyendo la vinculación de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, interacción electrostática y enredo de polímero. En tercer lugar, la afinidad ha sido determinado en vitro usando polisacáridos aislados16,17,18,19, pero la purificación procedimientos pueden alterar sustancialmente la estructura y propiedades de estas biomoléculas. Este método también es incapaz de replicar la deposición sofisticada y montaje de macromoléculas después de biosíntesis. Finalmente, el fenotipo, la morfología celular y propiedades mecánicas de los mutantes genéticos con producción atenuada de cierto componente de la pared celular arrojan luces sobre las funciones estructurales de los polisacáridos, pero se necesitan pruebas más molecular para estos observaciones macroscópicas con la función de ingeniería de proteína maquinarias20.
Los recientes avances en el desarrollo y aplicación de la espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional han introducido una oportunidad única para resolver estos rompecabezas estructurales. Experimentos de NMR estado sólidos 2D/3D permiten la investigación de alta resolución de la composición y arquitectura de materiales ricos en hidratos de carbono en el estado nativo sin mayor perturbación. Se han realizado con éxito estudios estructurales en primaria y pared celular secundaria de las plantas, la biomasa tratada catalíticamente, biofilm bacteriano, el pigmento fantasmas en hongos y, recientemente por los autores, las paredes celulares intactas en un hongo patógeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. el desarrollo de la polarización nuclear dinámica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita la elucidación estructural de NMR como la mejora de la sensibilidad por DNP notablemente acorta el tiempo experimental de estos biomateriales complejo. El protocolo descrito aquí detalla los procedimientos para el hongo a. fumigatus de isótopo-etiquetado y preparación de hongos y plantas muestras de estado sólido caracterización NMR y DNP. Similares procedimientos de etiquetado debe ser aplicable a otros hongos con medio alterado, y los procedimientos de preparación de la muestra deben ser generalmente aplicables a otros biomateriales ricos en hidratos de carbono.

<table><tbody><tr><td>Molibdato de amonio tetrahidrato</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de pesaje analítica</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Modelo PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Armario de bioseguridad</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Tienda VWR</td><td>BDH9222</td><td>a las 15-30 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Honeywell |Fluka</td><td>60820</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Corning Incubadora de agitación LSE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99,9 átomo</td></tr><tr><td>% D d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99,9 átomo % D</td></tr><tr><td>d8-glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 átomo %</td></tr><tr><td>D Tubo de diálisis 3,2 kDa</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Fosfato dipotásico</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge; 99.5 %</td></tr><tr><td>Centrífuga Heraus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Máximo RCF 25,830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS Kit de inserto desechable</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) Heptahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio Heptahidratado</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>almacenar a 18-26 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>Fosfato monopotásico</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo B706689216</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilendiaminatetraacetato tetrasódico</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99.5 %</td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-glicerol</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99,95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-glucosa</td><td>Sigma Alrdrich 364606</td><td></td><td>&ge; 99 % (PC)</td></tr><tr><td>15N-nitrato sódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; 98 % 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr><tr><td>Zafiro de 3,2 mm Rotor NMR</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de silicona de 3,2 mm</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Kit de rotor MAS</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zirconia</td></tr></tbody></table>

preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante rmn de estado sólido de polarización nuclear dinámica

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Este protocolo muestra cómo uniformemente 13C, 15N etiquetado materiales fungicidas pueden ser producidos y experimentos de cómo estos materiales blandos deben ser procedidos para NMR de estado sólido y la sensibilidad mejorada del DNP. También se detalla el procedimiento de procesamiento de las muestras de biomasa vegetal. Este método permite la medición de una serie de 1D y 2D 13C -13C / espectros de correlaciones de15N, que permite alta resolución elucidación estructural de complejos biomateriales en su estado natal, con la mínima perturbación. El isótopo de etiquetado puede ser examinado mediante la cuantificación de la intensidad en espectros 1D y la eficacia de la transferencia de polarización en espectros de correlación 2D. El éxito de la preparación de la muestra de la polarización nuclear dinámica (DNP) puede ser evaluado por el factor de mejora de la sensibilidad. Otros experimentos examinando los aspectos estructurales de los polisacáridos y las proteínas dará lugar a un modelo de la arquitectura tridimensional. Estos métodos pueden ser modificados y adaptados para investigar una amplia gama de materiales ricos en hidratos de carbono, incluyendo las paredes de la célula naturales de plantas, hongos, algas y bacterias, así como sintetizados o diseñado polímeros de hidratos de carbono y su complejo con otros moléculas.

El etiquetado del isótopo sustancialmente incrementa la sensibilidad de NMR y hace posible medir una serie de 2D 13C -13C y 13C -15N espectros de correlación para analizar la composición, la hidratación, la movilidad y el embalaje de polímeros, que se integrarán para construir un modelo tridimensional de la arquitectura de la pared celular (figura 1). Si el etiquetado uniforme tiene éxito, un conjunto completo de 1D...

Se presenta un protocolo para preparar 13C,15marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Este protocolo se puede utilizar para preparar materiales fúngicos y vegetales para la resonancia magnética nuclear de estado sólido, o RMN, y la polarización nuclear dinámica, o DNP, experimentos para la caracterización compleja del biosistema. Esta técnica nos permite investigar biomateriales a un nivel de resolución atómica en su entorno nativo, por ejemplo, en células enteras. La adquisición de información estructural de alta resolución sobre materiales fúngicos ayudará en el desarrollo de fármacos antifúngicos.El método proporciona información sobre la composición y la estructura de carbohidratos complejos en las paredes celulares de hongos y se puede aplicar a muchos organismos ricos en carbohidratos, incluyendo plantas, hongos, algas y bacterias. Algunos investigadores pueden tener problemas con la contaminación por hongos en sus cultivos celulares. Mi consejo es esterilizar el medio y el equipo a fondo antes de su uso para evitar esta contaminación.Esta demostración ayudará a los investigadores con poca experiencia en RMN o cultivo celular a aprender cómo implementar estas técnicas en sistemas de hongos y plantas. Para preparar un medio de crecimiento líquido sin etiquetar, disolver 6,5 gramos de dextrosa de peptona de extracto de levadura o polvo de YPD en 100 mililitros de agua destilada, y luego autoclave la solución resultante durante 25 minutos a 134 grados Celsius. Para preparar un medio de crecimiento sólido sin etiquetar, agregue 6,5 gramos de polvo de agar YPD a 100 mililitros de agua destilada, y autoclave el medio durante 25 minutos a 121 grados centígrados, antes de enfriar el medio a aproximadamente 50 grados centígrados.A continuación, transfiera de 13 a 15 mililitros del medio de crecimiento sólido fundido a platos Petri de plástico estéril individuales, e inmediatamente coloque las tapas en los platos. Para preparar el medio de crecimiento líquido con etiqueta de nitrógeno-13, nitrógeno-15, ajuste un volumen de 100 mililitros de isótopo medio mínimo que contenga un pH de 6,6 con ácido o base según sea necesario. A continuación, disolver las sales enumeradas en la tabla en 100 mililitros de agua destilada, añadir al medio de crecimiento líquido con etiqueta de carbono-13, nitrógeno-15, y autoclave la solución resultante durante 25 minutos a 121 grados Celsius.Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, añada 100 microlitros de solución de oligoelementos a todo el volumen de carbono-13, nitrógeno-15-etiquetado medio mínimo. Para cultivar los materiales fúngicos, utilice un bucle de inoculación para transferir una pequeña cantidad de hongos del almacenamiento a una placa YPD, y el cultivo del hongo durante dos días en una incubadora de grados Celsius de 30 grados. Al final de la incubación, utilice un nuevo bucle de inoculación para transferir un borde de hongos de crecimiento activo al medio de crecimiento líquido con etiqueta de carbono-13, nitrógeno-15, y coloque el cultivo en 30 grados celsius y 220 rotaciones por minuto durante tres a cinco días en una incubadora de temblores.Cuando grandes cantidades del hongo cubran el fondo del matraz y floten en el líquido, recoja los hongos por centrifugación y deseche el sobrenadante. Hidratar el pellet con una solución adecuada, y utilizar fórceps para recoger alrededor de 0,5 gramos del pellet bien hidratado para análisis de RMN y DNP. A continuación, mezcle el material restante con una solución de 20% de glicerol en un tubo cónico y coloque la muestra de hongos a menos 80 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.Para preparar el A.fumigatus para el análisis de RMN de estado sólido, primero utilice una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 3.5-kilodalton para marcar la muestra de hongos con etiqueta de nitrógeno de 0,5 gramos de carbono-13 contra un litro de búfer de fosfato de 10 mililitrolares a cuatro grados Celsius durante tres días para eliminar moléculas pequeñas del crecimiento medio. Al final de la diálisis, transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros para centrifugación, y empaque de 70 a 80 miligramos de la pasta de muestra etiquetada uniformemente con carbono-13 y bien hidratada en un rotor de dióxido de circonio de cuatro milímetros. Utilice una varilla metálica para apretar suavemente y repetitivamente la muestra, utilizando papel para absorber el exceso de agua.A continuación, tapone firmemente el rotor e inserte la muestra en el espectrómetro para la caracterización de RMN de estado sólido. Para preparar el A.fumigatus para el análisis de DNP, agregue 100 microlitros de matriz DNP en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por muestra de hongos con etiqueta de carbono-15 y disuelva 0,7 miligramos de agente polarizador a cada tubo para formar una solución de stock radical de 10 milificaciones. Después de vórtices durante dos a tres minutos para asegurar que los radicales se disuelvan completamente en la solución, remoje 10 miligramos de carbono-13 dializado, muestra de hongos etiquetada con nitrógeno-15 en 50 microlitros de la solución del agente polarizador, y utilice un pestillo y un mortero para moler suavemente la mezcla para asegurar la penetración de los radicales en las paredes celulares porosas.Agregue otros 30 microlitros de la solución radical al pellet molido para hidratar aún más la muestra de hongos, y empaquete el pellet en un rotor de zafiro de 3,2 milímetros. Apriete suavemente y retire el exceso de disolvente DNP como se ha demostrado, y agregue un tapón de silicona de 3,2 milímetros para evitar la pérdida de hidratación. A continuación, añada el rotor a un espectrómetro de RMN para un experimento de rutina o un espectrómetro DNP para la medición del espectro mejorado por DNP bajo irradiación de microondas.Para preparar materiales vegetales para estudios DNP, utilice una cuchilla de afeitar para cortar el material vegetal etiquetado uniformemente con carbono-13 en piezas de uno a dos milímetros. Utilice un mortero y un mortero para moler las piezas en partículas más pequeñas hasta que el polvo final tenga un aspecto homogéneo. Añadir 40 microlitros de solución de stock radical de 10 mililitros al material vegetal, y moler ligeramente la muestra durante cinco minutos adicionales para asegurar una mezcla homogénea con el radical.Hidratar la muestra de tierra con otros 20 microlitros de solución de stock radical, y empaquetar la muestra de planta equilibrada en un rotor de zafiro de 3,2 milímetros para el análisis DNP. A continuación, inserte un tapón de silicona para evitar la pérdida de hidratación y cargue la muestra en el espectrofotómetro DNP. El etiquetado de isótopos mejora sustancialmente la sensibilidad a la RMN y permite medir una serie de espectros de correlación de carbono-13-carbono-13 y carbono-13-nitrógeno-15 bidimensionales para analizar la composición, hidratación, movilidad y embalaje de los polímeros para su integración para la construcción de un modelo tridimensional de arquitectura de pared celular.Si las señales fuera de la diagonal son difíciles de obtener en el espectro 2D de carbono-13-carbono-13, el etiquetado estadístico podría haber ocurrido. Los dos picos de carbono-13 de 96 y 92 partes por millón son señales de carbono-1 de la firma de glucosa. Por lo tanto, sus intensidades fuertes en los espectros cuantitativos de polarización directa de carbono-13 medidos con largos retrasos de reciclaje de 35 segundos suelen indicar el dominio de moléculas pequeñas debido a la diálisis o lavado incompletos.Con muestras bien etiquetadas, las correlaciones de largo alcance se pueden medir aún más para detectar las proximidades espaciales de las biomoléculas y para construir un modelo estructural de las paredes celulares intactas. Esta técnica permite explorar la función de la estructura en muchos materiales naturales y diseñados, facilitando estudios futuros de biomateriales ricos en carbohidratos y polímeros funcionalizados. Como algunos hongos pueden causar infecciones o enfermedades sistemáticas en los seres humanos, asegúrese de manejar materiales fúngicos en una capucha de flujo laminar para protegerse y minimizar la exposición.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Órganos aéreos de las plantas están protegidos por la cutícula, una supramolecular biopolyester la cera de montaje. Se presentan los protocolos para controlar la eliminación selectiva de epi-y las ceras de la cutícula intracuticular fruta de tomate en las escalas moleculares y micro por la RMN en estado sólido y la microscopía de fuerza atómica, respectivamente, y para evaluar la capacidad de entrecruzamiento de ingeniería biopolyesters cuticulares.

El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

La mejora de la sensibilidad proporcionada por la polarización nuclear dinámica de disolución (DNP) permite seguir los procesos metabólicos en tiempo real mediante RMN y RMN. Se discuten las características y rendimientos de una configuración DNP de disolución dedicada diseñada para el estudio de reacciones enzimáticas.

Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de las secuencias reductoras de glicosil extremo (RE) e interno de los heteroxilanos mediante el marcaje del RE con 2 aminobenzamida antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa) y luego el análisis de los oligosacáridos resultantes mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Aquí se presenta un protocolo para la transferencia criogénica de muestras congeladas a la sonda de resonancia magnética nuclear (RMN) de ángulo mágico de polarización nuclear (DNP) de giro mágico (MAS). El protocolo incluye instrucciones para el almacenamiento del rotor antes del experimento e instrucciones para las mediciones de viabilidad antes y después del experimento.

Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

31 La RMN P es una herramienta poderosa para la elucidación estructural de polifenoles. Este procedimiento analítico rápido, fácil, preciso, cuantitativo y altamente reproducible, que permite la cuantificación y diferenciación de los diferentes tipos de grupos hidroxi, fenólico y carboxílico en ligninas y taninos se ha convertido en una herramienta analítica rutinaria.

Análisis cuantitativo de RMN de 31P de ligninas y taninos

Este artículo presenta el uso de PSYCHE y SAPPHIRE-PSYCHE en el perfil metabólico de las plantas e incluye procedimientos detallados para la preparación de muestras y el registro óptimo de los espectros de RMN de Pure Shift. Se discuten ejemplos a través de los cuales la ganancia en resolución lograda por el desacoplamiento homonuclear permite una comprensión más completa del sistema.

Resonancia magnética nuclear de desplazamiento puro: una nueva herramienta para la metabolómica de las plantas

Se presenta un protocolo para la aplicación de espectroscopía de RMN de mejora de la relajación paramagnética para detectar interacciones inter e intramoleculares débiles y transitorias en proteínas intrínsecamente desordenadas.

Mejora de la relajación paramagnética para detectar y caracterizar las autoasociaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Este protocolo integra un sistema de biorreactor hecho a medida con espectroscopia de RMN de ¹³C hiperpolarizada para medir el metabolismo del piruvato en tiempo real en células vivas, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética para estudios metabólicos y aplicaciones de detección de fármacos.

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

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Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Aprenda a preparar hongos y plantas para RMN de estado sólido con polarización nuclear dinámica. Este método permite caracterizar biosistemas complejos a resolución atómica en su entorno nativo para estudios estructurales.

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica (Video) | JoVE Journal

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

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