Name: Expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la Diabetes tipo 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a producir una vacuna oral candidata contra la Diabetes tipo 1 mediante transformación transitoria de hojas de remolacha roja. Este método de biotecnología vegetal permite obtener altos rendimientos de proteínas recombinantes para inducción de tolerancia oral.

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Este trabajo fue financiado por el proyecto "El uso de plantas para la producción de una vacuna comestible de diabetes autoinmune (eDIVA)" (proyecto ID: 891854) financiado por la Universidad de Verona, en el marco de la convocatoria 2014.

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<li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li>
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<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li>
<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
<li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li>
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<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li>
<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio mostramos análisis preliminar para el diseño de una vacuna oral de candidato para la diabetes autoinmune. La proteína diana para este experimento era una forma mutada de la humana 65 kDa glutamato descarboxilasa, que producción y funcionalidad son fácilmente detectables y medibles12. Su expresión en los tejidos de plantas comestibles fue mediada por los vectores5, que mediar un alto nivel de producción de proteínas recombinantes en un marco de tiempo muy cor...

Desde la revolución de biología molecular de plantas en la década de 1980, los sistemas basados en plantas para la producción de biofármacos pueden considerarse como una alternativa a los sistemas tradicionales basados en células microbianas y mamíferos1. Las plantas muestran varias ventajas sobre las plataformas tradicionales, con escalabilidad, eficacia y seguridad, siendo los más relevantes2. El producto recombinante puede ser purificado a partir de tejido vegetal transformado y entonces administrado, ya sea por vía parenteral o por vía oral y, además, transformada de plantas comestibles se pueden utilizar directamente para administración oral. La vía oral al mismo tiempo promueve la inmunidad mucosa y sistémica, y elimina la necesidad de agujas y personal médico especializado. Además, la administración oral elimina el complejo proceso aguas abajo, que normalmente representa el 80% del costo total de fabricación de una proteína recombinante3. Todas esas ventajas se pueden traducir en un ahorro en la producción, insumos y mano de obra reduciendo los costos de cada dosis, lo que el fármaco asequibles a la mayoría de la población mundial.
Varias estrategias, tanto para la transformación estable y expresión transitoria, fueron desarrolladas para la producción de proteínas recombinantes en plantas. Entre ellos, un sistema de expresión basados en virus de planta deconstruido de alto rendimiento (por ejemplo, magnICON) proporciona funcionamiento superior conduce a altos rendimientos de proteínas recombinantes sobre escalas de tiempo relativamente corto4. Se reportan muchos ejemplos de expresión transitoria mediante el sistema de expresión basados en virus vegetales en plantas de Nicotiana benthamiana , siendo el host de producción estándar de oro. Sin embargo, esta planta de modelo no se considera como una especie comestible debido a los alcaloides y otros metabolitos tóxicos que se acumulan en sus hojas.
En este trabajo, describimos la comparación entre dos sistemas de la planta comestible, remolacha roja (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (Spinacea oleracea cv Industria), para la expresión de dos formas de candidato de la isoforma 65 kDa de ácido glutámico decarboxilasa (GAD65), llevado a cabo por la planta basada en virus vectores5. GAD65 es un autoantigen importante asociado a Diabetes de tipo 1 (T1D) y actualmente está bajo investigación en ensayos clínicos en humanos para prevenir o retrasar la T1D induciendo tolerancia6. La producción de GAD65 en plantas se ha estudiado extensivamente en especies modelo como Nicotiana tabacum y N. benthamiana4,5,6,7. Aquí, describimos el uso de especies de plantas comestibles para la producción de la molécula en los tejidos que puede significar para una administración oral directa. Desde un punto de vista técnico, estudia y selecciona el sistema de planta agroinfiltration y la plataforma de plantas comestibles para la producción de GAD65 mediante la evaluación de diferentes parámetros: los niveles de la expresión de proteína recombinante, la carga microbiana residual en la planta tejido para administración oral, la resistencia de GAD65 en la digestión gástrica y la bioequivalencia de las plantas transformadas con el tipo salvaje.

<table><tbody><tr><td>0.2-&mu; m Filtros de membrana Minisart RC4</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Tóxico; 4 % para hacer tampón de carga con glicerol, SDS y Tris-HCl</td></tr><tr><td>Ácido 4-morfolineetanosulfónico (MES)</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>27221</td> Acetonitrilo <td>corrosivo</td></tr><tr><td>grado LC-MS Sigma</td><td></td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acetosiringa</td><td>Sigma D134406</td><td></td><td>Tóxico &ndash; 0,1 M de stock en DMSO</td></tr><tr><td>Agar Bacteriológico</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>15 g/L para hacer medio LB (pH 7,5 con NaOH) con extracto de levadura, NaCl y triptona</td></tr><tr><td>Formiato de amonio</td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-eGFP</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD 65/67</td><td>Anticuerpo Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-LHCB2</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 Column</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &mu; m) Columna</td></tr><tr><td>C18 Columna de Guardia</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &mu; m) Guardia&nbsp; Columna</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>Fertilizante</td></tr><tr><td>Carbenicillina disódica</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Sistema de imagen por quimioluminiscencia</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Sistema de imagen táctil</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Detergente</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td>Polisorbato 20</td></tr><tr><td>Lector de fluorescencia</td><td>Perkin-Elmer</td><td>&nbsp; 1420-011</td><td>VICTOR Multilabel Counter</td></tr><tr><td>Ácido fórmico LC-MS grado</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15 % para hacer tampón de carga con Tris-HCl, SDS y 2&ndash; mercaptoetanol</td></tr><tr><td>GoTaq G2 polimerasa</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Columna</td></tr><tr><td>HILIC corrosiva</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; tamaño de partículas: 2,7 &mu; m) Columna</td></tr><tr><td>HILIC Guard Columna</td><td>Grace</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Visión HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 &mu; m) Guardia&nbsp; Columna</td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante (HRP)-anticuerpo anti-conejo conjugado</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>No congelar/descongelar demasiadas veces</td></tr><tr><td>Muestreador automático de HPLC</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Sistema Gold 508 Autosampler</td></tr><tr><td>Sistema HPLC Beckman</td><td>Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Sistema Gold 128 Módulo de solvente HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td> inflamable <td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>2 g / L con NaCl , Na2HPO4 y KH2PO4 para hacer PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2.4 g/L con NaCl, Na2HPO4 y KCl para hacer PBS</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td><td></td>de carga</tr><tr><td>Solución de luminol</td><td>Ge Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>Prepare la solución utilizando el kit comercial del sistema de transferencia occidental ECL Prime</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas</td><td>Bruker -Bruker</td><td></td> <td>Esquire 6000; el espectrómetro de masas estaba equipado con una fuente ESI y el analizador era una trampa de iones</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bloqueo de leche</td><td>Ristora</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>3 % en PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Úselo con NaH2PO4 para hacer tampón de fosfato de sodio</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 g/L con KCl, Na2HPO4 y KH2PO4 para hacer PBS; 10 g/L para hacer medio LB (pH 7,5 con NaOH) con extracto de levadura, Triptona y agar Grado bacteriológico</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp; Úselo con Na2HPO4 para hacer tampón de fosfato de sodio; 14,4 g/L para fabricar PBS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulasa</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina de mucosa gástrica porcina</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato de peroxidasa ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td>Material sensible a la luz</td></tr><tr><td>Prensa de vacío con bomba</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Utilice 50 partes de este reactivo con 1 parte del reactivo B para preparar la solución de trabajo de BCA</td></tr><tr><td>Reactivo B</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Utilice 1 parte de este reactivo con 50 partes de reactivo A para preparar la solución de trabajo de BCA</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Tóxico &ndash; 25 mg/mL de stock en DMSO</td></tr><tr><td>SDS (Dodecil sulfato de sodio)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Inflamables, tóxicos, corrosivos-10 % de existencias; 3 % para hacer tampón de carga con Tris-HCl, glicerol y 2&ndash; mercaptoetanol</td></tr><tr><td>Metabisulfito de sodio</td><td>Sigma</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Sistema sonicador</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&reg; 2200 MH; frecuencia 40 khz</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Terumo</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td></td></tr><tr><td>Fijo transparente 300-&micro; Tubos de vidrio de inserción L</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Ajuste el pH con 1N HCl para hacer tampón Tris-HCl, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) para hacer tampón de carga con SDS, glicerol y 2&ndash; mercaptoetanol</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>10 g/L para hacer medio LB (pH 7,5 con NaOH) con extracto de levadura, NaCl y agar Grado bacteriológico</td></tr><tr><td>Concentrador de vacío</td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Speed-vac System</td></tr><tr><td>Water LC-MS grade Sigma</td><td></td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td>5 g/L para hacer medio LB (pH 7.5 con NaOH) con Triptona, NaCl y Agar Grado Bacteriológico</td></tr></tbody></table>

expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la diabetes tipo 1

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Planta la agricultura molecular es el uso de plantas para producir moléculas de interés. En esta perspectiva, las plantas pueden utilizarse tanto como biorreactores para la producción y purificación posterior del producto final y para la administración oral directa de proteínas heterólogas al utilizar especies de plantas comestibles. En este trabajo presentamos el desarrollo de la vacuna oral contra la Diabetes de tipo 1 (T1D) candidato en sistemas de plantas comestibles utilizando tecnología del ADN recombinante basado en el virus de la planta deconstruido, entregada con infiltración vacío. Nuestros resultados muestran que una remolacha roja es un huésped adecuado para la expresión transitoria de un autoantígeno derivada humana asociada a T1D, considerado como un candidato prometedor como vacuna T1D. Hojas produciendo el autoantígeno bien se caracterizaron por su resistencia a la digestión gástrica, la presencia de carga bacteriana residual y su perfil metabólico secundario, dando una visión general de la producción de proceso para el uso potencial de las plantas para administración oral directa de una proteína heteróloga. Nuestro análisis demostró la degradación casi completa de la vacuna oral liofilizada candidato tras una digestión gástrica simulada, lo que sugiere que una estrategia de encapsulación en la fabricación de la vacuna de GAD de origen vegetal se requiere.

En este trabajo se presenta el flujo de trabajo para el desarrollo de una vacuna oral en los tejidos vegetales comestibles. El enfoque de este trabajo es la expresión de una proteína de la blanco en una especie vegetal comestible y la caracterización de la potencial vacuna oral.
El primer paso implicó la evaluación de la idoneidad de la tecnología de expresión basada en el virus de la planta para producir proteínas recombinantes...

Aquí, presentamos un protocolo para producir a un candidato de vacuna oral contra la diabetes tipo 1 en una planta comestible.

Expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la Diabetes tipo 1

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Entre las diferentes estrategias para la producción de proteína recombinante en plantas, la expresión DES a base de plantas deconstruida proporciona un rendimiento superior, lo que conduce a altos rendimientos en un período de tiempo relativamente corto. La replicación de esta tecnología para la producción de una vacuna oral tiene un gran potencial para convertirse en una alternativa a las vacunas convencionales en un futuro próximo. Las hojas de remolacha roja liofilizadas transformadas transitoriamente acumulan una cantidad de antígenos fotográficos adecuados para la inducción de tolerancia oral en la prevención de la diabetes tipo uno.Este protocolo experimental podría extenderse a muchas especies comestibles diferentes después de una evaluación caso por caso de acumulación de proteínas recombinantes. Demostrarán el procedimiento serán Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo y Roberta Zampieri. Para comenzar este procedimiento, cultivar remolacha roja y plantas de espinacas en una cámara de crecimiento como se describe en el protocolo de texto.Después de la germinación de la semilla, fertilizar las plantas dos veces por semana con una solución de fertilizante comercialmente disponible a una concentración de un gramo por litro. Para la agroinfiltración, utilice espinacas de cinco semanas de edad y plantas de remolacha roja de seis semanas de edad. Después de construir los vectores de expresión vegetal, inocular los tres transformadores A.tumefaciens en 50 mililitros de medio LB que contiene rifampicina a una concentración de 50 microgramos por mililitro y antibióticos específicos de vectores como se describe en el protocolo de texto.Crece temblando durante la noche a 28 grados centígrados. Al día siguiente, peletizar los cultivos bacterianos por centrifugar a 4500 veces G durante 20 minutos. Resuspender el pellet en 100 mililitros de tampón de infiltración que contiene 10 MES mililolares y 10 sulfato de magnesio milimolar.Incubar las suspensiones a temperatura ambiente durante tres horas. Mezclar un volumen igual de una suspensión bacteriana que contenga uno de los módulos que se muestran aquí, con el módulo de cinco primos y el módulo de integrasa. Con una jeringa sin aguja, saque cinco mililitros de la mezcla de suspensión.Presione la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja de la planta mientras aplica suavemente la presión de contador al otro lado de la hoja. Infiltrar las tres primeras hojas completamente expandidas, a partir del ápice, para cada planta. Etiquete las hojas agroinfiltradas con la etiqueta de papel en el tallo de la hoja.A continuación, devuelva las plantas a la cámara de crecimiento en condiciones estándar. En los días cuatro a 14 después de la infección, recoger las hojas agroinfiltradas y congelarlas en nitrógeno líquido. Almacene este tejido vegetal a menos 80 grados centígrados.En primer lugar, crecer por separado los tres transformadores A.tumefaciens en 50 mililitros de medio LB que contiene rifampicina a una concentración de 50 microlitros por mililitro, y antibióticos específicos de vectores apropiados agitando durante la noche a 28 grados centígrados. Al día siguiente, peletizar los cultivos bacterianos por centrifugar a 4500 veces G durante 20 minutos. Resuspender el pellet en 1 litro de tampón de infiltración a un OD600 de 0.35, e incubar las suspensiones a temperatura ambiente durante tres horas.A continuación, añada el 0,01% del detergente a cada suspensión. Mezclar un volumen igual de una suspensión bacteriana que contenga uno de los módulos que se muestran aquí con el módulo de cinco primos y el módulo de integrasa. Inserte una planta de remolacha roja de seis semanas de edad en el soporte.Invierta el soporte y colóquelo encima de un vaso de precipitados que contenga dos litros de un baño de infiltración para sumergir las hojas en la suspensión de infiltración. Después de esto, transfiera el baño de infiltración con la planta sumergida a la cámara de infiltración y ciérrela. Encienda la bomba de vacío y abra la válvula de admisión de vacío en la cámara de infiltración.Una vez que la presión en la cámara ha caído a 90 milibares, mantener el vacío durante tres minutos. A continuación, suelte el vacío durante 45 segundos. Cuando la cámara haya vuelto a la presión atmosférica, abra la cámara y retire la planta infiltrada del baño bacteriano.Devuelva la planta a la cámara de crecimiento. El día de máxima expresión, cosecha las hojas infiltradas y congelarlas en nitrógeno líquido como se describió anteriormente. En primer lugar, cosechar el vacío agroinfiltrado delta 87 GAD65mut expresando hojas de remolacha roja en el pico de expresión, y congelarlas en nitrógeno líquido.Liofilizar las hojas congeladas a menos 50 grados Celsius y a 0.04 milibar durante 72 horas. A continuación, guárdelos a menos 80 grados centígrados. Cuando esté listo para proceder, muele las hojas a un polvo fino y guárdelos a temperatura ambiente en un recipiente sellado con gel de sílice para excluir la humedad.Para la simulación de digestión gástrica, pesar 100 miligramos de las hojas de remolacha roja seca congelada finamente molida, y resuspender en seis mililitros de PBS. Utilice seis molares de ácido clorhídrico para ajustar el pH de la muestra a dos. Añadir cuatro miligramos por mililitros de pepsina de la mucosa gástrica porcina, y 10 ácido clorhídrico milimolar, para obtener una concentración final de pepsina de un miligramo por mililitro.Agitar la muestra a 37 grados centígrados durante 120 minutos. A continuación, utilice hidróxido de sodio para ajustar el pH de la muestra a ocho e inactivar la pepsina. Transfiera 750 microlitros alícuotas de cada muestra a tubos de microcentrífuga, y centrifuga las alícuotas a 20.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.Recoger cada sobrenadante por separado, y resuspender cada pellet en un volumen de sobrenadante de búfer de carga. A continuación, analice tanto el sobrenadante como el pellet resuspendido por el análisis de manchas occidentales. Para el análisis de la integridad celular, preparar dos muestras de 100 miligramos de las hojas de remolacha roja liofilizado finamente molidas, y resuspender ambos en seis mililitros de PBS.Utilice seis molares de ácido clorhídrico para ajustar el pH de una muestra a dos. Agitar ambas muestras a 37 grados centígrados durante 120 minutos. A continuación, aliquot 750 microlitros de cada muestra a tubos de microcentrífuga.Centrifugar a 20.000 veces G y a 4 grados centígrados durante 20 minutos. Recoger cada sobrenadante por separado, y resuspender cada pellet en un volumen de sobrenadante de búfer de carga. A continuación, analice tanto el sobrenadante como el pellet resuspendido por el análisis de manchas occidentales.Primero, pesa 100 miligramos de las hojas de remolacha roja liofilizado finamente molidas, y la resuspend en ocho mililitros de PBS estéril. Vórtice por un minuto. Placa un mililitro de cada homogeneización de hoja liofilizada en uno de los cinco medios SELECTos DE LB preparados.Incubar las placas a 28 grados centígrados durante tres días. Después de esto, contar las colonias de agrobacterium cultivadas en cada plato, y calcular la carga bacteriana residual como el número de unidades formadoras de colonias por mililitro del homogeneario de hoja liofilizada. En este trabajo, se desarrolla una vacuna oral en tejido vegetal comestible.Las plantas de remolacha roja y espinacas se agroinfiltran manualmente con suspensiones de A.tumefaciens que llevan vectores de expresión recombinante EGFP, y la expresión de proteína fluorescente se visualiza mediante el análisis de manchas occidentales y se cuantifica bajo la luz UV. El sistema de remolacha roja se caracteriza por una mayor expresión de EGFP, alcanzando aproximadamente 544 microgramos por gramo de peso fresco de la hoja a los nueve días después de la infección, mientras que la espinaca sólo alcanzó un nivel máximo de aproximadamente 113,4 microgramos por gramo de peso fresco de la hoja en 11 días después de la infección. Debido a esto, la remolacha roja se selecciona como host de expresión para todos los experimentos posteriores.Las plantas se infiltran al vacío con una suspensión A.tumefaciens. Después de la extracción de TSP de hojas de agroinfiltración, las muestras son analizadas por Western blot, y la proteína recombinante se cuantifica relativamente mediante un análisis de densitometría. Por último, se evalúan los parámetros para el desarrollo de una posible vacuna oral.Como se ve aquí, la proteína diana se ve estable después del proceso de liofilización. La digestión gástrica se simula añadiendo la enzima gástrica porcina al material liofilado, ya sea a una concentración final de un miligramo por mililitro, o una relación de uno a 20, a TSP. Ambas condiciones de tratamiento digestivo resultan en la degradación de la proteína recombinante.La ausencia de una señal específica en las muestras de pellets después de la digestión de la pepsina sugiere que después del secado por congelación, las células de la planta perdieron su integridad, y esto condujo a la degradación de la proteína objetivo. El procedimiento debe adaptarse cuidadosamente a las especies vegetales con respecto a la infiltración al vacío y a la proteína recombinante objetivo con respecto al análisis del curso de tiempo. El procedimiento de demostración también podría utilizarse para la producción de productos biofarmacéuticos destinados a la administración oral, como la vacuna y los anticuerpos.

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