Name: Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células progenitoras multipotentes de tejido adiposo perivascular humano para diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica. Este método compara su potencial con células madre mesenquimales de médula ósea.

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Reconocemos la ayuda de navegación de la investigación en el centro médico de Maine para ayudar con la obtención de tejido clínico, histopatología y núcleo de histomorfometría (apoyado por 1P20GM121301, L. Liaw PI) en el Maine Medical Center Research Instituto de corte y coloración. Este trabajo fue financiado por los NIH grant HL141149 R01 (Liaw L.).

El uso de tejidos humanos en el presente estudio fue evaluado y aprobado por el institucional de Junta de Maine Medical Center, y todo el personal recibió entrenamiento apropiado antes de la experimentación.
1. preparaciones
<ol><li>Hacer buffer de disociación por reconstituir 50 mg animal-libre colagenasa/dispase mezcla solución con 1 mL de solución de trabajo de nanopure H2O. preparar 1 mg/mL mediante la adición de 49 mL de DMEM que contenía 1% w/v BSA a la colagenasa reconstituido de alta glucosa / solución dispase. Guardar alícuotas de trabajo de 5 mL a-20 ° C y caliente a 37 ° C utilizando a un previo baño de agua a utilizar.</li>
	<li>Hacer solución de antibiótico mediante la adición de 1 mL de solución antibiótico/antimicótico de 100 x (concentración final es de 200 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 200 de unidades/mL y 0,5 μg/mL fungizone) en 49 mL de HBSS y almacenar en hielo.</li>
	<li>Preparar solución de gelatina (0,2% p/v) disolviendo gelatina 200 mg de piel bovina en 100 mL de nanopure H2O. Autoclave la solución durante 20 minutos y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de crecimiento PVAT: glucosa alta DMEM/F12 con suplemento de glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, suplementado con 10% FBS y agente antimicrobiano 100 μg/mL (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Preparar medios de inducción de adipogenic 50 mL: glucosa alta 40,8 mL DMEM, complementada con medios de crecimiento 7,5 mL PVAT, 500 μl de 100 x antibiótico/antimicótico solución (concentración final es 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 de unidades/mL fungizone 0.25 μg/mL), 0,5 mM IBMX (stock de 500 mM en 0,1 M NaOH), la dexametasona de 1 μm (valores de 1 mM en etanol), 5 μm rosiglitazona (bolsa de 5 mM en DMSO), 33 μm biotina (stock de 66 mM en DMSO), 100 insulina nM (200 stock μm en ácido acético al 0.1%) y 20 μm ácido pantoténico (bolsa de 100 mM de H2 O).</li>
	<li>Preparar 50 mL de medio de inducción de control para el linaje de adipogenic: glucosa alta 40,8 mL DMEM suplementado con medios de crecimiento PVAT 7,5 mL y 500 μl de pen-strep (100 acciones de x).</li>
	<li>Preparar los medios de mantenimiento de adipogenic 50 mL: glucosa alta mL 41,5 DMEM suplementado con 7,5 mL PVAT medios de crecimiento en el paso 1.3, 500 μl pen-strep (100 acciones de x), dexametasona 1 μm (valores de 1 mM en EtOH), biotina μm 33 (valores de 66 mM en DMSO), insulina nM 100 (200 μm hasta la existencia en 0.1% CA ácido etic) y el ácido pantoténico μm 20 (bolsa de 100 mM de H2O).</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de crecimiento para los linajes osteogénicos y condrogénica: suplemento de glucosa alta αMEM suplementado con 10% FBS, glutamina x 1 (véase Tabla de materiales) y 5 mL de pen-strep (100 acciones de x).</li>
	<li>Preparar 50 mL de medio de inducción para el linaje osteogénico: 50 mL de los medios de crecimiento de MSC de médula ósea suplementados con 10 nM dexametasona y glicerofosfato-β de 10 mM.</li>
	<li>Preparar 50 mL de medio de inducción para la estirpe condrogénica: 50 mL de los medios de crecimiento de MSC de médula ósea con 100 nM dexametasona, 50 μg/mL ascorbato-2-fosfato de sodio y 10 ng/mL TGFβ1. Para las condiciones osteogénicos y condrogénica, los medios de crecimiento MSC de médula ósea basal servirá como los medios de no inducción.</li>
</ol>2. Protocolo n ° 1: Cultura PVAT humano las células de la fracción Vascular estromal
Nota: PVAT es resecado desde el sitio de la anastomosis del injerto en la aorta ascendente de anestesiados pacientes sometidos a procedimientos de injerto de bypass de arteria coronaria. PVAT aórtica se coloca un 15 mL cónico que contiene 10 mL hielo frío alta glucosa en DMEM F12 y trasladado desde el quirófano al laboratorio dentro de las 2 h de la resección. PVAT aórtica es tejido desechado durante el procedimiento de by-pass y ha sido considerado como investigación de sujetos no humanos por la Junta de revisión interna del centro médico de Maine.
<ol><li>Este protocolo es para un pedazo de ~ 500 mg de PVAT humano (aproximadamente 3 x 1 x 0,5 cm3). Transferir PVAT humano fresco de DMEM a un tubo cónico de 50 mL conteniendo 25 mL de solución de antibiótico. Incubar con mecedora por 20 min a 4 ° C. Mientras que el PVAT es en solución antibiótica, descongele una alícuota del almacenador intermediario de la disociación a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de antibiótico/antimicótico de x 100 a 5 mL de tampón de disociación y esterilice usando un filtro de jeringa 0,22 μm. Añadir 1 mL de solución de gelatina al 1 bien de una placa de 24 pozos. En campana de flujo laminar, use pinzas estériles y tijeras para transferir PVAT de la solución de antibiótica a una placa de Petri estéril. Añadir 1 mL de tampón de disociación precalentado al tejido y Pique finamente el tejido entero en una mezcla (no trozos de más de ~ 2 x 2 mm2) utilizando pinzas estériles y tijeras de disección.</li>
	<li>Transferir la mezcla de 1 mL a 4 mL de tampón de disociación e incubar el tubo a su lado en un agitador orbital con 37 ° C a 200 rpm durante 1 hora. Después de 1 h, no pedazos de tejido visible estará presentes, y la solución aparecerá como una suspensión turbia.</li>
	<li>Filtrar la solución a través de un tamiz de célula μm 70 ubicado en lo alto de un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el filtro con una solución antibiótica adicional 10 mL para capturar tantas células como sea posible. No apriete el filtro.</li>
	<li>Sedimenten las células por 12 min a 300 x g en una centrífuga oscilante del cubo. Nota: Después de la centrifugación, se separará el tubo en una capa superior grasa de los adipocitos, una interfase y un diábolo. El pellet es la fracción vascular estromal que contiene las células endoteliales, células inmunes, las células de sangre y células progenitoras.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de HBSS y centrifugar durante 5 min a 300 x g. Repita este paso para un total de 2 lavados en HBSS. Después del último lavado, no lisar los glóbulos rojos. Varios intentos con varios búferes disponibles comercialmente y tiempos de incubación han conducido a reducciones marcadas en accesorio de la célula progenitora y viabilidad.</li>
	<li>Aspirar la gelatina de la placa de 24 pocillos. Lave suavemente el bien 1 x con HBSS quitar gelatina sin consolidar.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de la fracción vascular estromal con glóbulos rojos intactos en 1 mL de medio de crecimiento y semilla en el recubrimiento de gelatina bien. Añadir humanos FGF2 (resuspendió en PBS con 0,01% BSA w/v) a una concentración final de 25 ng/mL en medio de cultivo. Incubar durante 24 h a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Al día siguiente, quitar medios de cultivo y lavado pozos x 5 con HBSS para eliminar glóbulos rojos y las células muertas. Añadir 1 mL de medio fresco crecimiento suplementado con 25 ng/mL FGF2.</li>
	<li>Cambiar el medio cada 48 h, para complementar con 25 ng/mL FGF2 fresco cada vez.</li>
	<li>
Las células típicamente alcanzan confluencia 100% 7-10 días después de explante; células del paso a continuación:
	<ol>
<li>Aspirar monocapa de los medios de comunicación y lavado de crecimiento 2 x 1 ml HBSS. Aspire todo HBSS de los pozos y añadir unas gotas de solución de disociación celular.</li>
		<li>Toque y agitar a la placa e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 5-7 min levantar las células. Añadir ~ 1 mL de medio de cultivo fresco a las células separadas y distribuir 500 μl a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos, cada uno conteniendo 500 μl crecimiento los medios de comunicación y 25 ng FGF2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continúan expandiendo células humanas derivadas de PVAT como se indica en el paso anterior. Cada paso debe ser no mayor que una división de 1:2. Las células son pasadas 5 a 7 veces antes de la asignación para los ensayos de diferenciación.</li>
</ol>3. Protocolo 2: Cultura médula ósea humana MSC colonias
Nota: Médula ósea humana MSC son aislados como descrito8 y como primeros paso congelado las existencias congelar media (70% FBS 20% basal DMEM y 10% DMSO) ~ 100.000 células/ml en líquido N2.
<ol><li>Rápidamente descongelar un vial de médula ósea MSC del líquido N2 en un baño de agua de 37 ° C y la placa de un pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos que contienen 3 mL de medio de crecimiento de MSC e incubar durante una noche a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Al día siguiente, medios de cultivo MSC de aspirar y lavar las células 3 x en 2 mL de HBSS. En 100% de confluencia, medios de cultivo de aspirar y lavar las células 3 x en 2 mL de HBSS. Añadir 500 μL/pocillo celular separación solución, incubar a 37 ° C y 5% de CO2 por 5 min golpee ligeramente la placa para todas las células son desalojados y distribuir contenido a 2 pocillos de una placa de 6 pozos que contienen medios de cultivo 2 mL MSC.</li>
	<li>Ampliar la médula ósea humana y MSC PVAT derivado paralelamente durante aproximadamente 5 – 7 pasos o hasta cantidades suficientes para las pruebas se ha logrado.</li>
</ol>4. Protocolo 3: Placa e inducir Adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes
<ol><li>Replica los números apropiados de la placa de la médula y las células derivadas de PVAT por pozo de una placa de 12 pozos y apropiadas para cada condición experimental. Para adipogenic y osteogénicos condiciones, ~ 200, 000 – 225.000 células/pocillo se necesita, para condiciones condrogénica de células/pocillo se necesitan 150.000-175.000. Nota: Corrimos un mínimo de N = 3 pozos replicadas para el control e inducida por las condiciones de cada linaje experimental para los funcionamientos de un total de 2 independientes (N = total de 6 repeticiones).</li>
	<li>Disociar las células de la población de la célula humana PVAT progenitoras y la población de MSC de médula ósea humana usando solución de separación celular e incubación a 37 ° C y 5% CO2 para las poblaciones de piscina de 5 minutos en frascos cónicos separado 15 mL. Girar el frasco hacia abajo a 500 x g por 7 min para que sedimenten las células. Resuspender en 1 mL de PBS y un hemocitómetro para estimar el número de celular.</li>
	<li>Las células en pozo de 12 platos de la placa como se indica en el paso 4.1. Prever platos separados adipogenic inducida y no inducidas, osteogénico y las condiciones para que la condición no-inducida puede ser fijo en un momento anterior sin interrumpir continuar la cultura de la condición inducida.</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de adipogenic y medios de inducción osteogénica a cada pocillo de la condición inducida. Añadir 1,5 mL de adipogenic y medios no inducción osteogénicos a cada pocillo de la condición de no inducido. Comenzar la incubación de la adipogenic osteogénica células inducidas y no inducidas por poblaciones y en 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Girar hacia abajo el volumen restante de las células progenitoras PVAT humanas y médula ósea humana MSCs por 7 min a 500 x g.</li>
	<li>Determinar el volumen necesario para resuspender restantes la médula ósea y células PVAT pellets para lograr una densidad de 100.000 células/10 μl (106 células/mL). Resuspender el pellet en el volumen calculado de medios de cultivo de MSC para la inducción de estirpe condrogénica. Mueva suavemente el volumen de las células de arriba y abajo utilizando una pipeta para asegurar una distribución homogénea.</li>
	<li>Tomar con pipeta una gota de 10 μl de la solución concentrada de células en el centro de cada pozo para formar una micromass de 100.000 células. Coloque 1 mL de estéril de H2O en el pozo adyacente para evitar la evaporación. Incubar los cultivos micromass por 2 h a 37 ° C y 5% CO2 para permitir la micromass a agregado.</li>
	<li>Después de 2 horas, agregue cuidadosamente los medios de diferenciación condrogénica tacon con 10 ng/mL TGFβ1 humana a cada uno de los pozos de condición inducida. Cuidadosamente añadir 1,5 mL de los medios de no inducción (medio de crecimiento de MSC de médula ósea) en los pocillos de condición no-inducida. Utilizar placas 12-bien separadas para las condiciones inducidas y no inducidas por lo que la condición no-inducida puede ser fijo en un momento anterior.</li>
</ol>5. Protocolo 4: Cultura Adipogenic, osteogénico y linajes condrogénica durante 14 días
<ol><li>La cultura las condiciones inducidas y no inducidas de los tres linajes durante 4 días a 37 ° C y 5% CO2, actualizar los medios de comunicación cada 2 días. El día 4, cambiar la condición de linaje adipogenic inducida de los medios de inducción a los medios de mantenimiento para el resto del ensayo.</li>
	<li>Todas las condiciones inducidas por no fijar en formol al 10% para 12 h. dispone de formalina y lavado todo fijada pozos x 2 en PBS para eliminar todos los rastros de formol. Almacenar las placas en PBS a 4 ° C hasta el procesamiento.</li>
	<li>La cultura las condiciones inducidas por un total de 14 días, actualizar los medios de comunicación cada 2 días. Añadir TGFβ1 fresco a 10 ng/mL concentración final con cada actualización de los medios de inducción condrogénica. Continuar a la cultura del linaje adipogenic en adipogenic mantenimiento medios de comunicación y los medios de inducción linaje osteogénico, refrescante cada 2 días. En el día 14, fijar condiciones todo inducidas por 12 h en formalina al 10% para tinción.</li>
	<li>Raspe o vierta el micromass en la condición de inducción condrogénica en un cassette para empotrar. Deshidratar el micromass en una serie de baños de alcohol cada vez más concentrado por 5 min, comenzando en 70%, entonces, dos veces de 95%, 80% y dos veces más en alcohol absoluto. Coloque el cartucho en un agente de desalcoholización y entonces finalmente insertar el cassette en parafina para el seccionamiento y la coloración.</li>
</ol>6. Protocolo 5: Tinción Adipogenic condición con aceite O rojo
<ol><li>Preparar solución stock aceite rojo O disolviendo 350 mg de aceite rojo O en 100 mL de isopropanol al 100%. Mezcle por 2 h con una barra de agitación y vacío a través de un filtro de 0.2 μm. Solución madre se puede almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 año.</li>
	<li>Preparar aceite rojo O solución diluida mezclando 3 partes solución a 2 partes diH20 (por ejemplo, 60 mL de solución madre a 40 mL diH20). La concentración final de aceite rojo O en la solución de trabajo es de 2,1 mg/mL.</li>
	<li>Retire todo el líquido de pozos. Lavar cada pozo 2 x con isopropanol al 60%, asegurándose de eliminar completamente toda el agua de los lados de los pocillos. Aspire isopropanol al 60% y agregar rápidamente la solución de trabajo de aceite rojo O sin tocar las paredes de los pozos para cubrir el fondo. Es fundamental que este paso se hace rápidamente para que no sequen los pozos.</li>
	<li>Una vez que se agrega el aceite rojo O, incubar 10 min a temperatura ambiente con el suave balanceo.</li>
	<li>Quite todo aceite rojo O y añadir agua destilada H2O. Wash con agua destilada de H2O 10 m empezar a quitar Oil Red O. Después de 10 minutos, aspirar aceite rojo O y repita el procedimiento de lavado 3 x.</li>
	<li>Una vez finalizado el lavado, añadir PBS y las células de la imagen. Almacenar las células en PBS a 4 ° C.</li>
</ol>7. Protocolo 6: Tinción condición osteogénica con rojo de alizarina
<ol><li>Retire todo el líquido de cada pocillo. Añadir volumen apropiado de solución al 2% rojo de alizarina colorante a cada pozo (1,5 mL por pocillo de una placa de 12 pozos) y suavemente incline el plato de lado a lado hasta que la solución cubra totalmente el fondo del pozo.</li>
	<li>Incubar por 15 min a temperatura ambiente. Quitar el rojo de alizarina de los pozos. Enjuague suavemente cada bien cuatro veces con agua destilada de H2O, teniendo precaución para no desalojar los cristales de calcio. Deje que se seque.</li>
</ol>8. Protocolo 7: Coloración Trichrome condrogénica condición de Masson
<ol><li>
Hornear los portaobjetos en un horno seco de 60 ° C durante 30 minutos secciones Deparaffinize e hidratan en agua destilada.
	<ol>
<li>Para rehidratar, coloque los portaobjetos en tres incubaciones de 5 min con agentes de desalcoholización, seguidos de incubaciones de 5 min en bajar las concentraciones de alcohol como sigue: dos al 100% (etanol absoluto), dos en el 95% de alcohol, dos en 80%, dos al 70% y finalmente dos en agua destilada H2O. las diapositivas puede permanecer en H2O mientras se prepara el fijador de Bouin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lugar 40 mL de fijador de Bouin en un tarro de plástico coplin para microondas (descubierto). Microondas en high para llevar la temperatura a 55 ° C. Coloque los portaobjetos en solución caliente por 20 min; deje en reposo sobre la superficie de cubierta. Lavar en agua corriente durante 10 minutos o hasta que todo el color amarillo desaparezca.</li>
	<li>Mancha de secciones en hematoxilina de Weigert durante 10 minutos lavado en agua corriente durante 10 minutos.</li>
	<li>Secciones de Beibrich escarlata ácido en solución durante 10 minutos lavado 3 x 10 min en agua del grifo de la mancha. Mordiente los portaobjetos en solución de ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico durante 10 minutos. No enjuague.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en solución anilina azul para 10 minutos enjuague con dos breves inmersiones en agua del grifo.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en solución de ácido acético al 1% durante 3 a 5 min lavado en agua corriente durante 1 minuto lugar en etanol al 95% durante 1 minuto deshidratar como se indica en el paso 5.4 y montar con resina sintética.</li>
</ol>

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<li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Using+human+adipose-derived+stem%2Fstromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li>
<li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Células progenitoras adiposas de diferentes depósitos varían ampliamente en la diferenciación y el fenotipo potencial9. Cultivo de progenitores PVAT derivado de un solo donante paciente en inducción simultánea por tres linajes diferentes, adipogenic, osteogénica y condrogénica, permite una investigación bien controlada de la capacidad pluripotencial de esta novela población de células progenitoras. La metodología descrita en este informe se puede utilizar para probar la capacidad de diferenciación...

Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica linajes1. Este tejido se expande a través de la hipertrofia de los adipocitos maduros y de diferenciación de novo de MSC residente a adipocitos. El tejido adiposo perivascular (PVAT) rodea los vasos sanguíneos y regula la función vascular2,3. Expansión PVAT inducida por la obesidad exacerba la patología cardiovascular. Mientras que el potencial multipotent de MSC de depósitos adiposos subcutáneos humanos han sido bien estudiadas4,5, ningún estudio explantados y evaluó la capacidad de diferenciación de las células progenitoras PVAT derivado humano, probablemente debido a la invasividad de la contratación. Así, el objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología de explantación y propagar células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes con enfermedades cardiovasculares y para probar su propensión a diferenciar a osteogénico condrogénica y adipogenic linajes. Nuestra fuente de PVAT es desde el sitio de la anastomosis del injerto de bypass en el ascendente de la aorta de pacientes obesos sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. PVAT recién aislado es enzimáticamente disociado y la fracción vascular estromal es aislada y propagada in vitro, lo que nos permite probar por primera vez la capacidad de diferenciación de células progenitoras derivadas de PVAT humana.
Usando primaria cultivados humanos PVAT stromal vascular fracción, probamos tres ensayos diseñados para inducir a las células madre/progenitoras para diferenciar hacia adipogenic, osteogénico, o linajes condrogénica. Nuestro estudio anterior identificó una población de CD73 +, CD105 + y células PDGFRa + (CD140a) que robusta pueden diferenciarse en adipocitos6, aunque no fue probado su multipotencia. PVAT directamente regula el tono y la inflamación vascular7. El fundamento para probar el potencial de diferenciación de esta población celular nuevo es comenzar a comprender la influencia especializada de PVAT sobre la función vascular y los mecanismos de expansión PVAT durante la obesidad. Esta metodología aumenta nuestra comprensión de las funciones de las células madre derivadas de tejido adiposo y nos permite identificar y comparar las similitudes y diferencias de las células progenitoras procedentes de diferentes tejidos. Se basan en enfoques establecidos y validados para aislar y diferenciar MSC hacia diversos linajes y optimizar procedimientos para maximizar la viabilidad de las células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en los campos del vástago y del progenitor investigación y tejido adiposo desarrollo de la célula.

<table><tbody><tr><td>Mezcla de colagenasa/dispasa sin animales I &nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>Azul Alcián</td><td>NewComerSupply</td><td>1003A</td><td>1% Solución acuosa pH 2.5</td></tr><tr><td>Rojo Alizarina</td><td>Amresco</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td>ThermoFisher 12561056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de anilina</td><td>NewComerSupply</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Beibrich ácido escarlata fucsina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-glicerofosfato</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrich Scarlet</td><td>EKI</td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Fijador de Bouin</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A</td><td></td></tr><tr><td>Bovino albúmina sérica</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td>almacenada a 4 & ° </td></tr><tr><td>Solución de desprendimiento de células</td> C <td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de campana (70 mm)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L glucosa, L-glut y piruvato</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>alto en glucosa, glutamax, sodio bicarboninato</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, piel de bovino</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>suplemento de glutamina</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Aceite rojo O</td><td>Millipore-Sigma</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pantoténico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido fosfotúngstico/fosfomoibdico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P4006-100G/221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td>, <td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Reactivo antimicrobiano para medios de cultivo.</td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina de Weigert</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

capacidad de diferenciación de las células del progenitor humano aórtica adiposo perivascular gratis

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica. Adipogenic diferenciación de células progenitoras es un mecanismo importante de conducción disfunción y expansión del tejido adiposo en respuesta a la obesidad. Los cambios de comprensión en el tejido adiposo perivascular (PVAT) es clínicamente relevante en la enfermedad metabólica. Sin embargo, estudios previos han sido predominantemente en el ratón y otros animales modelos. Este protocolo utiliza humanos torácica PVAT las muestras recolectadas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. Tejido adiposo de la aorta ascendente fue recogido y utilizado para la explantación de la fracción vascular estromal. Previamente confirmamos la presencia de células progenitoras adiposas en PVAT humano con capacidad de diferenciarse en que contiene lípidos adipocitos. En este estudio, se analizaron además el potencial de diferenciación de las células de la fracción vascular estromal, que presumiblemente contiene células progenitoras multi-potente. Comparamos las células PVAT derivadas de médula ósea humana MSC para la diferenciación en adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes. Después de 14 días de diferenciación, las manchas específicas fueron utilizadas para detectar acumulación de lípidos en los adipocitos (O aceite rojo), depósitos calcíficos en células osteogénicos (alizarina rojo), o glicosaminoglicanos y colágeno en las células condrogénica (TRICROMICA de Masson). Mientras que la médula ósea MSC distingue eficientemente en los tres linajes, células derivadas del PVAT tenían adipogenic y condrogénica potencial, pero carecía de potencial osteogénico robusto.

Aislamiento de la fracción vascular estromal de PVAT humana
Figura 1A se muestra un diagrama esquemático de la región anatómica donde se obtuvo la PVAT que cubre la aorta ascendente. Anteriormente Describimos los grupos de pacientes sometidos a injerto de puente de arteria coronaria que estas muestras eran derivadas6. Figura 1B m...

El objetivo de este protocolo es para poner a prueba la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes celulares de células progenitoras derivadas de tejido adiposo de humanos perivascular. Diferenciación fue comparada con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana, que se conoce a diferenciarse en adipocitos, Osteocito y linajes de condrocitos.

Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

El tejido adiposo perivascular rodea los vasos sanguíneos y regula la fisiología cardiovascular. Este protocolo se utiliza para responder preguntas clave relacionadas con la función de los progenitores adiposos humanos en el microambiente vascular. Las células progenitoras adiposas varían según su ubicación anatómica.Mostramos que una población de progenitores multipotentes puede derivarse con éxito del tejido adiposo perivascular de pacientes con enfermedad cardiovascular. Demostrando el procedimiento estará Spencer Scott, un estudiante de medicina de mi laboratorio. Obtener una pieza de 500 miligramos de tejido adiposo perivascular humano o PVAT del quirófano como se describe en el protocolo de texto.Transfiera PVAT humano fresco de DMEM a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución antibiótica. Incubar con balanceo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras el PVAT está en solución antibiótica, descongele una alícuota de tampón de disociación a 37 grados centígrados.Añadir 50 microlitros de solución antibiótica/antimicótica 100x a cinco mililitros de tampón de disociación y esterilizar utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micras. Añadir un mililitro de solución de gelatina a un pozo de una placa de 24 pozos. En una capucha de flujo laminar, utilice fórceps y tijeras estériles para transferir PVAT de la solución antibiótica a un plato estéril de Petri.Agregue un mililitro de tampón de disociación precalentado al tejido. Picar finamente todo el tejido en una suspensión usando fórceps estériles y tijeras de disección. Transfiera la suspensión de un mililitro a cuatro mililitros de tampón de disociación.Incubar el tubo de su lado en un agitador orbital de 37 grados Celsius precalgado a 200 rpm durante una hora. Después de una hora, no deben estar presentes piezas de tejido visible y la solución aparecerá como una suspensión celular turbia. Filtrar la solución a través de un colador celular de 70 micras encima de un tubo cónico de 50 mililitros.Enjuague el colador con 10 mililitros adicionales de solución antibiótica para capturar tantas células como sea posible. No apriete el colador. Ahora pele las células durante 12 minutos a 300 veces g en una centrífuga de cubo oscilante.Después de la centrifugación, el tubo se separará en una capa superior grasa de adipocitos, una interfase y un pellet. El pellet es la fracción vascular estromal que contiene células endoteliales, células inmunitarias, células sanguíneas y células progenitoras. Resuspender el pellet en 10 mililitros de HBSS y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces g.Repita este paso para un total de dos lavados en HBSS. Ahora aspira la gelatina de un plato de 24 pozos. Lave suavemente el pozo una vez con HBSS para eliminar la gelatina sin anzar.Resuspender el pellet de fracción vascular estromal con glóbulos rojos intactos en un mililitro de medio de crecimiento y semilla sobre el pozo recubierto de gelatina. A continuación, añadir FGF2 humano a una concentración final de 25 nanogramos por mililitro en medio de cultivo. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados con 5%CO2.Después de cultivar las células durante 24 horas, retire los medios de crecimiento y lave las células cinco veces con HBSS. Este paso de lavado elimina los glóbulos rojos y las células muertas. A continuación, añadir un mililitro de medios de crecimiento fresco complementado con 25 nanogramos por mililitro FGF2 a cada pozo.Cambie los medios cada 48 horas asegurándose de complementar con 25 nanogramos por mililitro de FGF2 fresco cada vez. Las células de paso una vez que alcanzan el 100% de confluencia de siete a 10 días después de la explanta. Para ello, aspirar medios de crecimiento y lavar la monocapa dos veces con un mililitro HBSS.Aspirar todo el HBSS de los pozos y añadir unas gotas de solución de disociación celular. Toque y gire la placa varias veces e incubar a 37 grados Celsius con 5%CO2 durante cinco a siete minutos para levantar las células. Luego agregue aproximadamente un mililitro de medio de cultivo fresco a las células separadas.Distribuir 500 microlitros de las células separadas a dos pozos de una placa de 24 pozos cada uno que contiene 500 microlitros de medios de crecimiento y 25 nanogramos FGF2. También, cultivo de médula ósea humana Células madre mesenquimales o colonias de MSC como se describe en el protocolo de texto. Placa el número apropiado de médula ósea y células derivadas de PVAT por pozo de una placa de 12 pozos.Para condiciones adipogénicas y osteogénicas, placa de aproximadamente 200.000 a 225.000 células por pozo. Mientras que para condiciones condrogénicas, placa 150,000 a 175, 000 células por pozo. Luego disociar las células tanto de la población humana de células progenitoras de PVAT como de la población de MSC de médula ósea humana mediante la adición de solución de desprendimiento celular.Incubar las células en la solución de desprendimiento a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante cinco minutos. Tire de las poblaciones en viales cónicos separados de 15 mililitros. Gire los viales hacia abajo a 500 veces g durante siete minutos para peletizar las células.Luego resuspenda las células en un mililitro de PBS y usa un hemocitoómetro para estimar el número de célula. Plato de las celdas en platos de 12 pozos como antes. Proporcionar platos separados para las condiciones adipogénicas y osteogénicas inducidas y no inducidas.Y añadir 1,5 mililitros de medios de conducción adipogénicos y osteogénicos a cada pozo de la condición inducida. A continuación, añadir 1,5 mililitros de medios adipogénicos y osteogénicos de no inducción a cada pozo de la condición no inducida. Comenzar la incubación de las poblaciones celulares inducidas y no inducidas adipogénicas y osteogénicas a 37 grados celsius y 5%CO2.Gire hacia abajo el volumen restante de células progenitoras PVAT humanas y MSC de médula ósea humana durante siete minutos a 500 veces g. Determinar el volumen necesario para resuspender la médula ósea restante y los gránulos celulares derivados de PVAT para lograr una densidad de 100.000 células por cada 10 microlitros. A continuación, resuspender los pellets en el volumen calculado de medios de crecimiento MSC para la inducción de linaje condrógeno.Mueva suavemente el volumen de las células hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta para asegurar una distribución homogénea. Ahora pipetear una gota de 10 microlitros de la solución celular concentrada en el centro de cada pozo para formar una micro masa de 100.000 células. Coloque un mililitro de agua estéril en el pozo adyacente para evitar la evaporación.Incubar los cultivos de micro masa durante dos horas a 37 grados celsius y 5%CO2 para permitir que la micro masa se agregue. Después de dos horas, añadir cuidadosamente medios de diferenciación condrógenos con 10 nanogramos por mililitro humano TGF-beta-one a cada uno de los pozos de condición inducida. Ahora agregue cuidadosamente 1,5 mililitros de los medios sin inducción a los pozos de condición no inducidos.Raspar o verter la micro masa en la condición condrógena inducida en un casete con el fin de deshidratar, incrustar y manchar la muestra como se describe en el protocolo de texto. Los estudios de diferenciación adipogénico se realizaron en paralelo con células progenitoras derivadas de la médula ósea humana. En la condición no inducida, no hay acumulación de lípidos es evidente.Esto contrasta con la condición inducida que se muestra después de la tinción de lípidos neutros con aceite rojo O.Mientras que el grado de diferenciación en las células madre aórticas derivadas de PVAT es más robusto, ambas fuentes de células humanas mostraron la capacidad de diferenciar para el linaje adipogénico. El protocolo de diferenciación osteogénica se utilizó para las MSC derivadas de la médula ósea humana y las células derivadas de PVAT. Las células no inducidas no mancharon con Alizarin Red.Después del protocolo de diferenciación osteogénica, los MSC humanos desarrollaron nódulos calcificados que se tiñeban con Alizarin Red mientras que las células PVAT aórticas humanas no lo hacían. Células derivadas de MSC de médula ósea humana y PVAT humano muestran características características de la diferenciación condrogénica con abundante acumulación de colágeno en la micro masa. La micro masa se forma a partir de MSC de médula ósea humana y células aórticas derivadas de PVAT también presentan una abundante acumulación de glicosaminoglicanos según lo indicado por la tinción azul alciano.Morfológicamente, se detectaron estructuras similares a las lagunas con células sentadas en cavidades rodeadas de deposición de colágeno. Es fundamental picar finamente el tejido adiposo perivascular antes de la disociación enzimática y asegurar que las densidades celulares adecuadas estén chapadas para cada ensayo de diferenciación de linaje. Tras este procedimiento, se debe utilizar la PCR cuantitativa combinada con la mancha occidental y la citometría de flujo para caracterizar marcadores específicos del linaje de progenitores diferenciados de fuentes de adiposo perivascular y médula ósea.Con esta técnica, podemos empezar a entender los mecanismos que regulan la expansión y disfunción del tejido adiposo perivascular durante la obesidad y las implicaciones que las células progenitoras tienen en la función vascular y las enfermedades cardiovasculares.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de...

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Los adipocitos maduros pueden representar una fuente abundante de células madre a través de la desdiferenciación, lo que conduce a una población homogénea de células similares a los fibroblastos. La digestión de la colagenasa se utiliza para aislar los adipocitos maduros de la grasa humana. El objetivo de nuestro protocolo es obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Este protocolo describe el aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo de cerdo (pADSC) de tejidos adiposos subcutáneos con examen de multipotencia. Los pADSC multipotentes se utilizan para delinear procesos de diferenciación de adipocitos y estudiar la transdiferenciación en múltiples linajes celulares de mesénquima mesodérmico o linajes adicionales de ectodermo y endodermo para estudios regenerativos.

El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Presentamos un protocolo para el aislamiento, el cultivo y la inducción adipogénica de células madre derivadas de cresta neural derivadas de la cresta adiposa (NCADSC) del tejido adiposorio periaortico de Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los NCADSC pueden ser una fuente de aXenatos de fácil acceso para modelar adipogénesis o lipogénesis in vitro.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de células madre originales adiposas de raíz de la cresta neuronal del tejido adiposorio

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Aprende a aislar y cultivar células progenitoras multipotentes de tejido adiposo perivascular humano para diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica. Este método compara su potencial con células madre mesenquimales de médula ósea.

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