Un método para la reconstrucción 3D y el análisis de realidad virtual de células gliales y neuronales
September 28th, 2019
La tubería descrita está diseñada para la segmentación de conjuntos de datos de microscopía electrónica mayores que gigabytes, para extraer morfologías de células enteras. Una vez que las células se reconstruyen en 3D, el software personalizado diseñado en torno a las necesidades individuales se puede utilizar para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo directamente en 3D, también utilizando la realidad virtual para superar la oclusión de la vista.
La de las técnicas automatizadas de microscopía electrónica de sección serial. El paso de limitación de velocidad en la tubería que conduce a la generación de modelos tridimensionales biológicos de procesamiento de imágenes. Nuestro protocolo proporciona una guía paso a paso para producir una construcción más densa de volúmenes de imagen en tan solo unos días.
Combinado con un enfoque para mediciones cuantitativas utilizando modelos tridimensionales. Con esta técnica, la estructura 3D de los tejidos, aparte del cerebro, potencialmente se puede analizar para identificar las deficiencias estructurales típicas de ciertas enfermedades y mejorar la estrategia diagnóstica. La segmentación es un paso tedioso.
Tómese el tiempo para que sea lo más preciso posible para evitar la corrección de una segmentación incorrecta y tener que reiniciar todo el proceso. El diseño del software a veces no es muy fácil de usar. Por lo tanto, es importante ver el trabajo de inicio en la segmentación.
Abra la pila de imágenes arrastrando y soltando el archivo nativo desde el microscopio que contiene la pila o compre arrastrando y soltando la carpeta que contiene toda la pila de imágenes en la ventana de software Una vez que se abre la pila vaya a la imagen, propiedades, para asegurarse de que el tamaño de los voxels se ha leído de los metadatos. Transforme la imagen en 8 bits haciendo clic en la imagen, escriba y seleccione 8 bits. Si la pila original se adquiere como baldosas diferentes, aplique costuras dentro de TrakEM2.
Cree un nuevo proyecto TrakEM2 utilizando Nuevas funciones integradas TrakEM2, si es necesario. En el gooey de TrakEM2, haga clic con el botón derecho en cualquier cosa'debajo de la ventana de plantilla, y seleccione agregar nueva lista de área secundaria'Arrastrar y soltar cualquier cosa'en la carpeta, bajo objetos del proyecto'y uno cualquier cosa'would appear there. Arrastre y suelte, la lista de áreas'de la plantilla a la cosa'ubicado bajo objetos de proyecto'En la ventana gráfica de la pila de imágenes, seleccione el espacio Z' con el cursor.
La lista de áreas aparecerá con el número de identificación único. Seleccione la herramienta de pincel en la parte superior y utilice el ratón para segmentar una estructura rellenando su citosol sobre toda la pila Z. Exportar la masa segmentada, que se utilizará en Ilastik como semilla para el tallado.
Para ello, haga clic con el botón derecho en el objeto de lista de áreas de la lista de espacios Z o en la máscara del puerto de vista y seleccione export'area list'as labels T-I-F. Dependiendo de la resolución necesaria para reconstrucciones adicionales, reduzca el tamaño de píxel de la pila de imágenes mediante el muestreo descendente. Tenga en cuenta los requisitos de memoria del software que se utilizará para la segmentación y reconstrucción.
Ilastik maneja pilas de hasta quinientos píxeles en X-Y. Tenga en cuenta, el tamaño mínimo que los objetos todavía parecen reconocibles y por lo tanto se pueden segmentar. Usar image'adjust size'Para mejorar el contraste y ayudar a la segmentación, el filtro de máscara desenfocada se puede aplicar para hacer que las membranas sean más nítidas.
Utilice process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images' para su posterior procesamiento en el software de segmentación, utilizando file'save as'image sequence' y elija TIFF'format. En la gooey principal de Ilastik, seleccione el módulo de tallado. Cargue la pila de imágenes, utilizando add new'y agregue un único volumen 3D/4D de la secuencia'Seleccionar directorio completo'y elija la carpeta que contiene la pila de imágenes guardada como archivos individuales'En la parte inferior de la nueva ventana, donde las opciones para cargar las imágenes están presentes, asegúrese de mantener Z"seleccionado.
Para los siguientes pasos, todas las operaciones y botones se pueden encontrar en el lado izquierdo del software principal gooey. En la ficha de preprocesamiento, utilice las opciones estándar ya activadas. Utilice los filtros ricos de líneas brillantes y mantenga la escala de filtro en 1.600.
Este perímetro puede modificarse después. Una vez finalizado el preprocesamiento, seleccione la página siguiente en el menú desplegable del módulo de etiquetado. Un objeto y un fondo están presentes de forma predeterminada.
Seleccione la semilla del objeto haciendo clic en ella y dibuje una línea encima de la estructura de interés. A continuación, seleccione la inicialización de fondo y dibuje una o varias líneas fuera del objeto que se va a reconstruir. Ahora, haga clic en segment'y espere.
Dependiendo de la potencia del equipo y del tamaño de la pila, la segmentación podría tardar de unos segundos a horas. Una vez hecho esto, una máscara semitransparente que resalta la segmentación debe aparecer en la parte superior de la estructura segmentada. Desplácese por la pila para comprobar la segmentación.
La segmentación, podría no ser precisa si no sigue la estructura de interés o se derrama de ella. Corrija cualquier derrame colocando una semilla de fondo en la segmentación derramada. Y agregue una semilla de objeto sobre el segmento no reconstruido del objeto de interés.
La corrección visual precisa de la segmentación con Ilastik puede ser tediosa, pero es esencial asegurarse de que los objetos exportados no contienen artefactos. Si la segmentación sigue sin ser correcta, intente modificar con el parámetro bias'que aumentará o disminuirá la cantidad de píxeles clasificados inciertos aceptados. Su valor es 0.95 de forma predeterminada.
Disminuya para limitar cualquier derrame o aumentar si la segmentación es demasiado conservadora. Otra posibilidad es hacer clic en el preprocesamiento y modificar el tamaño del filtro. Aumentar el valor minimizará los efectos similares al ruido de la sal y la pimienta, pero también hará que las membranas sean más borrosas y los detalles más pequeños más difíciles de detectar.
Esto podría limitar el derrame. Reitere todo lo que sea necesario siempre y cuando todos los objetos deseados se hayan segmentado. Una vez que un objeto haya terminado, navegue hasta segment'y haga clic en guardar el objeto actual'Dos nuevas semillas aparecerán para iniciar la segmentación de un nuevo objeto.
La superficie abstracta mide de inmediato como archivos O-B-J haciendo clic en exportar todas las mallas'Para visualizar los modelos segmentados manualmente en 3D dentro de TrakEM2, haga clic con el botón derecho en la lista de áreas, luego seleccione mostrar en 3D'A valor más alto generará una malla de menor resolución. Por último, exporte la malla 3D como WaveFront O-B-J' eligiendo en el archivo de menú'exportar superficies'WaveFront'Después de instalar el kit de herramientas neuro morph como se describe en el protocolo de texto, abra la licuadora. Importe los objetos mediante la importación por lotes de neuro morph haciendo clic en importar objetos en el menú de escena para importar varios objetos a la vez.
Asegúrese de activar, utilice re-mesh y sombreado suave. Seleccione el objeto de interés en el forro exterior y modifique la profundidad de ocárbol de la función de re-malla en el menú del modificador. Trabaje de forma iterativa para minimizar el número de vértices y evitar perder detalles en resolución y morfología correcta.
Al cambiar la profundidad de Octree, la malla en el gooey principal cambiará en consecuencia. Una vez terminado, haga clic en aplicar para finalizar el proceso. Navegue hasta el menú neuro morph en el panel izquierdo y utilice las interacciones de pila de imágenes de la herramienta de superposición de imágenes para cargar la pila de imágenes.
Asegúrese de introducir el tamaño físico de la pila de imágenes para X, Y y Z y seleccione la ruta de la pila haciendo clic en la fuente Z.X e Y son planos ortogonales. Son opcionales y se cargarán solo si el usuario inserta la ruta de acceso válida. A continuación, seleccione una malla en el puerto de vista haciendo clic con el botón derecho en ella.
Entre en el modo de edición presionando la pestaña, seleccione uno o más vértices con el botón derecho del ratón y, finalmente, haga clic en mostrar la imagen en el vértice. Uno o más planos cortados con el micrográfico aparecerán superpuestos en la parte superior de la malla. Seleccione el plano de corte haciendo clic con el botón derecho en él.
A continuación, presione el control Y y desplácese sobre el modelo 3D con el desplazamiento del ratón. Esto también se puede utilizar como método de corrección. Aquí se muestra la segmentación y reconstrucción utilizando TrakEM2 e Ilastik.
El gooey TrakEM2 se muestra con objetos segmentados manualmente en rojo. La máscara exportada se puede utilizar como entrada para la segmentación semiautomática. Desde Ilastik, las máscaras se pueden exportar a TrakEM2 para su corrección manual.
Las máscaras se pueden exportar como mallas triangulares 3D para revelar estructuras reconstruidas. En este ejemplo, cuatro neuronas, astrocitos, microglia y pericitos fueron reconstruidos usando este proceso. Se muestra un análisis 3D de morfologías reconstruidas utilizando herramientas personalizadas.
Aquí hay un volumen de imagen isotrópico de un conjunto de datos de microscopía electrónica de barrido de haz iónico enfocado. Una reconstrucción densa de estos datos revela axones, el proceso astrocítico y dendritas. Esta micrografía muestra ejemplos de objetivos para cuantificaciones como sinapsis y gránulos de glucógeno astrocítico.
La máscara de ese micrografo muestra la distribución de gránulos de glucógeno alrededor de las sinapsis. Aquí se muestra una ilustración gráfica de la entrada y salida de la visualización gráfica del modelo de absorción de lactato derivado del glucógeno o GLAM'Here, un usuario se muestra usando una realidad virtual o auriculares V-R mientras trabaja en la reconstrucción densa a partir de un conjunto de datos de microscopía electrónica de barrido de haz iónico enfocado. A partir de un subconjunto de neuritas, se puede observar una escena V-R inmersiva.
El láser verde apunta a un GLAM'peak. es de importancia primaria, ya que determina el tamaño correcto de los objetos 3D exportados y determina que sus mediciones reflejan su tamaño real. El concepto de imágenes de sección serie, segmentación de imágenes y construcción 3D es bastante antiguo.
Descubrir la aceleración técnica está llevando a avances en colectomies en la revisión de los libros de texto de anatomía. Aunque el método fue desarrollado para la investigación cerebral en microscopía electrónica, se puede generalizar a cualquier y la técnica de microscopía generando datos Además, cualquier tipo de técnica de imagen 3D puede beneficiarse de tales técnicas de segmentación y construcción de imágenes. Incluyendo escaneos C-T y M-R-I.
Descripción general
Este estudio presenta un pipeline diseñado para segmentar grandes conjuntos de datos de microscopía electrónica para reconstruir morfologías de células completas en 3D. El software personalizado permite análisis cualitativos y cuantitativos aprovechando la realidad virtual para mejorar la visualización y abordar problemas de ocultación.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Microscopía electrónica
- Reconstrucción 3D
Antecedentes
- Se utilizan técnicas automatizadas de microscopía electrónica de secciones seriadas.
- El pipeline tiene como objetivo acortar el tiempo necesario para la generación de modelos 3D biológicos.
- La segmentación es crítica, ya que las inexactitudes pueden llevar a un extenso trabajo de revisión.
- El uso de software personalizado puede mejorar las capacidades de análisis.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo simplificado para la reconstrucción de volúmenes de imágenes densos.
- Permitir evaluaciones cualitativas y cuantitativas en 3D.
- Analizar estructuras 3D de varios tejidos para detectar deterioros relacionados con enfermedades.
Métodos utilizados
- El estudio emplea microscopía electrónica para crear conjuntos de datos volumétricos.
- Los métodos se centran en la segmentación precisa de estructuras celulares en grandes pilas de imágenes utilizando diferentes herramientas de software.
- Los pasos de procesamiento de imágenes incluyen la preparación de la pila de imágenes, la segmentación y la exportación de objetos para la visualización 3D.
- Los pasos críticos incluyen asegurar la precisión del tamaño de los vóxeles, aplicar filtros y la revisión manual de las segmentaciones.
Principales resultados
- El pipeline automatizado reconstruye con éxito modelos 3D precisos a partir de grandes conjuntos de datos.
- Los métodos de segmentación demostraron ser robustos en el manejo de estructuras complejas.
- La revisión visual es esencial para garantizar la fiabilidad de los objetos reconstruidos.
- El enfoque tiene aplicaciones potenciales en el diagnóstico de deterioros estructurales en varios tejidos.
Conclusiones
- Este estudio proporciona una metodología fundamental para segmentar con precisión datos de microscopía electrónica a gran escala.
- El pipeline descrito mejora la eficiencia en el análisis de estructuras biológicas complejas, lo que puede mejorar las estrategias diagnósticas.
- Las implicaciones incluyen el avance de nuestra comprensión de la estructura del tejido en contextos de salud y enfermedad.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of cellular ultrastructure enables mechanistic de-risking in target validation by resolving ambiguities in morphology-function relationships. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative structural readouts that inform hypothesis testing and pathway clarification. Integration of virtual reality analysis enhances reproducibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through detailed visualization of glial and neuronal ultrastructure.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by clarifying complex morphologies that may be misinterpreted in 2D.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by identifying structural impairments indicative of disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating dense, accurate 3D models of tissue architecture.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative measurements derived from reconstructed structures.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by enabling reliable compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through analysis of structural impairments in axons, dendrites, and astrocytic processes.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking 3D morphology to functional hypotheses like the glycogen-derived lactate absorption model (GLAM).
- Strategic Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling visualization of synaptic targets and glycogen granule distribution for biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through quantitative 3D structural analysis.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing ultrastructural patterns unresolved in 2D imaging.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative outputs such as synapse and glycogen granule quantification.
- Analytics: Highlights measurements and readouts that help teams compare conditions, including structural impairments typical of certain diseases.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity and biomarker alignment via visualization of disease-related structural changes in neural and glial cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across microscopy techniques including CT and MRI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in glial and neuronal morphology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D model generation from electron microscopy datasets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative 3D morphology analysis.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy, image segmentation, and 3D visualization software such as TrakEM2, Ilastik, and Blender.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include high-resolution EM imaging systems and computational resources for processing large image stacks.
- Cross-team standardization requirements for segmentation protocols and proofreading to ensure consistency across users and sites.
- Adaptation considerations across model systems, as the method can be generalized to any microscopy technique generating 3D data.
- Practical limitations include the tedious nature of segmentation and the need for accurate voxel size calibration to avoid measurement artifacts.
