Un modelo de cultivo por lotes In Vitro para estimar los efectos de los regímenes intervencionistas en la microbiota fecal humana
31 de julio de 2019
Este protocolo describe un sistema in vitro de fermentación de cultivo por lotes de microbiota fecal humana, utilizando inulina (un prebiótico bien conocido y uno de los moduladores de microbiota más ampliamente estudiados) para demostrar el uso de este sistema en la estimación de efectos específicos de sobre la composición de la microbiota fecal y las actividades metabólicas.
Teniendo en cuenta el papel emergente del microbioma intestinal en varias enfermedades humanas, varios moduladores de microbioma intestinal como probióticos, prebióticos, dietas y medicamentos pueden ayudar a aliviar las dolencias de salud asociadas al microbioma intestinal. Sin embargo, no hay un sistema de cribado rápido y asequible disponible para predecir los efectos de estos moduladores del microbioma intestinal, pero este sistema es lo suficientemente simple como para predecir cómo las intervenciones particulares pueden afectar el microbioma intestinal que en última instancia puede afectar la salud del huésped. Este protocolo es simple, asequible y práctico para los laboratorios que investigan los moduladores del microbioma intestinal y sus efectos sobre la microbiota y la salud del huésped.
El mantenimiento de condiciones asépticas y anaeróbicas es crucial para este experimento. También se debe utilizar de nuevo el espécimen fecal, inmediatamente después de la recolección. De lo contrario, si el experimento se planifica más adelante, la muestra debe almacenarse en menos 80 inmediatamente después de la recolección, sin ninguna exposición a la temperatura ambiente y al aire.
La precisión de manipulación durante la preparación de alícuotas y pipeteo también es importante para mantener la precisión y la reproducibilidad. Tomará menos de 12 horas durante el día. Podemos construir una cultura de la noche a la mañana si necesitan las muestras en 24 horas.
Luego, seguido de los ácidos grasos de cadena corta y la determinación del microbioma. Este proceso lo demostrarán dos grandes estudiantes uni, Shokouh Ahmadi y Rabina Mainali de mi laboratorio. Para preparar los medios de fermentación bajo una campana de humo, en una botella de reactivo sobre la mezcla de imán, mezclar la solución A, la solución B, la solución mineral traza, la solución de vitamina soluble en agua, la solución de biotina de folato, la solución de riboflavina, la solución de heminina, la mezcla de ácidos grasos de cadena corta y la resazurina.
A continuación, añadir en la botella extracto de levadura, carbonato de sodio, clorhidrato de cisteína monohidrato, y tripticasa. Añadir 296,1 mililitros de agua destilada, ajustar el pH con un hidrocloruro normal o hidróxido de sodio para asegurarse de que es alrededor de 7.0. Transfiera el vaso de precipitados a una estación de trabajo aséptica y utilice un filtro de vacío con tamaño de poro a 0,22 micrómetros para filtrar el medio para esterilizar.
Para preparar una solución de dilución anaeróbica de un litro, disolver cinco gramos de cloruro de sodio, dos gramos de glucosa y 0,3 gramos de clorhidrato de cisteína monohidrato en el agua ionizada. Autoclave la botella de reactivo con tapa a 121,1 grados Centígrados durante 15 minutos, y guárdela dentro de la cámara anaeróbica. Antes del inicio del experimento de fermentación, conservar todos los materiales, soluciones y herramientas necesarias para el experimento de fermentación dentro de la cámara anaeróbica durante al menos 48 horas, para asegurarse de que se elimina cualquier residuo de oxígeno.
Al menos 24 horas antes del experimento de fermentación, pesa 300 miligramos de inulina, y lo transfiere a un tubo de 50 mililitros, que luego se coloca dentro de la cámara anaeróbica. Añadir 26 mililitros de medios de fermentación esterilizados en el tubo, y vórtice para mezclar. Permitir la hidratación de la fibra durante aproximadamente 24 horas.
El día del experimento de fermentación, preparar el inóculo fecal. Primero, pesa cinco gramos de muestra fecal fresca en un tubo cónico de 50 mililitros. Añadir solución de dilución anaeróbica al tubo para alcanzar un volumen final de 50 mililitros.
Vórtice durante 15 minutos, o hasta que se homogeneice por completo. Mantenga los tubos inoculados a 37 grados Celsius dentro de la cámara anaeróbica, e invierta suavemente una vez cada hora para resuspender las fibras y el inóculo. Después de tres, seis, nueve o 24 horas, saque la cantidad adecuada de medios fermentados y centrifugar las muestras a 14.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Congelar inmediatamente el sobrenadante y el pellet en nitrógeno líquido, luego después de congelar, almacenar el sobrenadante para el análisis de ácidos grasos de cadena corta, y pellet para el análisis del microbioma, a menos 80 grados Celsius. Este protocolo se utiliza para demostrar el efecto de un prebiótico específico. Las heces de sujetos humanos sanos, después del tratamiento con inulina, mostraron un pH relativamente estable durante nueve horas, mientras que disminuyeron drásticamente después de 24 horas.
La inoculación de la inulina aumentó significativamente los niveles de ácidos grasos de cadena corta y el lactato en la muestra fecal tratada con inulina se compara con el cultivo de microbiota fecal no tratado. El análisis de coordenadas principales muestra una composición de microbiota diferente a las medidas UniFrac ponderadas y no ponderadas de la diversidad beta entre las muestras tratadas con inulina y las no tratadas. Los índices de diversidad alfa frente a la diversidad filogenética a través de PD árbol entero, riqueza de especies, unidades taxonómicas operativas, paridad de especies, así como abundancia relativa de estatus y géneros importantes, presentan diferentes firmas de microbiota intestinal entre las muestras tratadas con inulina y no tratadas.
El cladograma taxonómico, derivado del análisis lineal del tamaño del efecto discriminante de las secuencias 16S, representa los taxones diferencialmente abundantes entre diferentes grupos de muestras. Siga todos los pasos cuidadosamente. Lo más importante es mantener condiciones asépticas y anaeróbicas estrictas.
El sobrenadante y del experimento se puede utilizar para tratar los cambios de nivel de ácidos grasos de cadena corta como resultado de la fermentación a base de fibras. Además, el en el pellet se puede utilizar para analizar los cambios en la composición del microbioma intestinal. Algunos productos químicos utilizados para fabricar los medios de cultivo son potencialmente peligrosos.
Por favor, la hoja MSDS y tome precauciones en consecuencia.
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Descripción general
Este protocolo describe un sistema de fermentación en cultivo por lotes in vitro de la microbiota fecal humana, que utiliza inulina para evaluar los efectos de intervenciones específicas sobre la composición de la microbiota fecal y sus actividades metabólicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación del microbioma
- Sistema digestivo saludable
- Efectos prebióticos
Antecedentes
- El microbioma intestinal desempeña un papel crucial en la salud humana.
- Moduladores como los prebióticos pueden influir en la microbiota intestinal.
- Los sistemas actuales de cribado para evaluar los efectos sobre el microbioma intestinal son limitados.
- Este protocolo ofrece una solución práctica para los laboratorios.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un sistema de cribado sencillo y asequible.
- Predecir el impacto de las intervenciones sobre la microbiota intestinal.
- Mejorar la comprensión del papel de la microbiota en la salud del huésped.
Métodos Utilizados
- Sistema de fermentación en cultivo por lotes in vitro.
- Uso de muestras fecales frescas o almacenamiento adecuado a -80 °C.
- Mantenimiento de condiciones asépticas y anaeróbicas.
- Evaluación de la composición de la microbiota y sus actividades metabólicas.
Resultados principales
- El sistema predice eficazmente los efectos de intervenciones específicas.
- Se demostraron cambios en la composición de la microbiota fecal.
- Se destacaron las actividades metabólicas influenciadas por la inulina.
- Proporcionó información sobre la modulación del microbioma intestinal.
Conclusiones
- Este protocolo es una herramienta valiosa para la investigación del microbioma.
- Permite la evaluación de intervenciones en la salud intestinal.
- Avala estudios adicionales sobre la microbiota y la salud del huésped.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos de cultivo por lotes in vitro de alto rendimiento para la microbiota fecal humana permiten la evaluación rápida y escalable de moduladores del microbioma sin depender de estudios en animales ni en humanos. Este enfoque facilita la reducción temprana de riesgos de intervenciones candidatas al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles sobre la composición de la microbiota y sus productos metabólicos. La integración de estos modelos en las líneas de descubrimiento acelera la evaluación de prebióticos, probióticos y compuestos dietéticos para carteras orientadas a la salud intestinal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación funcional de moduladores del microbioma en comunidades microbianas derivadas de humanos.
- Apoya la desactivación del riesgo biológico mediante la cuantificación de cambios en la diversidad microbiana y la actividad metabólica.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de intervenciones prometedoras para su posterior desarrollo.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un sistema estandarizado y reproducible para evaluar los efectos de intervenciones sobre la composición de la microbiota.
- Genera resultados cuantitativos, como niveles de pH, lactato y ácidos grasos de cadena corta, para análisis comparativo.
- Permite la evaluación escalable de múltiples compuestos o regímenes en flujos de trabajo paralelos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona hallazgos in vitro con firmas del microbioma relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos basado en lecturas mecanicistas y metabólicas.
- Favorece el descubrimiento de biomarcadores al vincular los cambios inducidos por la intervención con resultados medibles.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este modelo de cultivo por lotes in vitro se sitúa en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos prometedores, proporcionando datos accionables antes de los estudios preclínicos in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la modulación del microbioma y los efectos en las vías metabólicas.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para la comparación de intervenciones.
- Análisis: Permite el análisis estadístico de la composición del microbiota y los cambios metabólicos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con la validación preclínica cuando se respaldan con resultados de diversidad y metabolismo.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la evaluación continua de diversos candidatos dirigidos al microbioma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el descubrimiento dirigido al microbioma.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo y mejora la reproducibilidad entre campañas de cribado.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la asignación de capital al proporcionar datos tempranos y accionables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de moduladores del microbioma para su desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microbiología anaerobia y técnica aséptica.
- Exige acceso a cámaras anaerobias y plataformas analíticas para el perfilado de metabolitos y microbiomas.
- Necesita una estandarización estricta entre equipos para el manejo de muestras y el análisis de datos.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes fuentes de donantes o tipos de intervención.
- Los riesgos potenciales derivados de reactivos químicos requieren el cumplimiento de protocolos de seguridad.
