Name: Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a detectar mutaciones tumorales en ADN circulante mediante PCR digital en gotas usando biofluidos de pacientes. Este protocolo no invasivo permite monitorear la carga mutacional longitudinalmente.

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Los autores quieren reconocer la generosidad de todos los pacientes y sus familias. Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), la V Foundation (Atlanta, GA), The Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, Clinical and Translational Science Institute at Children's National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), Children's Brain Tumor Tissue Consortium (Philadelphia, PA) y Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).

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El método descrito en este manuscrito se incluye en una solicitud de patente internacional "Métodos para la detección de biomarcadores de cáncer" de Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.

Aquí hemos presentado nuestro método para detectar y cuantificar la frecuencia alélica de las mutaciones tumorales en cfDNA a partir de la biopsia líquida del paciente. Hacemos hincapié en los pasos críticos para el éxito de este método, incluido el procesamiento de muestras preanalíticas, la extracción de CFDNA, el diseño de ensayos de PCR y el análisis de datos. Para limitar el volumen de muestra utilizado, cfDNA se extrae de 1 ml de plasma, pero sólo 500 l de L de L de L de L de L de L de L. Al extraer de CSF, se utiliza el protocolo para la extracción de 1 ml de orina (siguiendo el manual 12 del kit de extracción de ADNación12), según la recomendación del fabricante. La diferencia en el volumen de muestra requerido entre plasma y LSN se debe a niveles más bajos de CFDNA específico stumoral en plasma en comparación con el LFC de pacientes con tumores cerebrales, lo que requiere mayores volúmenes de muestra para la detección de mutaciones8. Si la muestra está disponible, se puede extraer más de 1 ml de plasma para producir un mayor rendimiento del ADN. Sin embargo, en el caso de los pacientes pediátricos, es importante minimizar la cantidad de sangre utilizada siempre que sea posible, ya que incluso un procedimiento simple como la extracción de sangre es fatigoso para los pacientes pediátricos con cánceres sometidos a radioterapias. La extracción de 1 ml de alícuotas de plasma también permite replicar extracciones, de forma que el ensayo puede repetirse (por ejemplo, en casos de fallo en la extracción de ADN o contaminación de muestras).
En un esfuerzo por reducir cualquier uso de la muestra que no sea estrictamente necesario, cfDNA normalmente no se cuantifica. Sin embargo, hemos encontrado un rango de concentraciones de ADNes entre 0,2-2 ng/L y 0,6-13 ng/L en plasma y LSF, respectivamente. Dada la baja cantidad de ADNe cfDNA, y el hecho de que los alelos mutantes específicos del tumor están presentes a una frecuencia baja, es necesario un paso de preamplificación utilizando el mismo conjunto de imprimaciones utilizadas para la dPCR para aumentar significativamente la cantidad de ADN objetivo en la muestra, detección de mutaciones8. La dilución del producto preamplificado en el tampón de suspensión de ADN proporciona un volumen suficiente para réplicas técnicas, lo que ayuda a distinguir los verdaderos positivos. Debido a que el número de gotas mutantes puede ser bajo (por ejemplo, entre 0-2 gotas mutantes en una muestra de plasma), la inclusión de réplicas técnicas es clave para resolver el estado de la mutación. Mientras que un pozo de PCR puede producir 0 gotas mutantes, las otras dos pueden producir 1-2 para una sola muestra de plasma analizada en triplicado; por lo tanto, la inclusión de réplicas permite una mayor precisión a la hora de determinar el estado de la mutación. A continuación, el MAF se calcula como el promedio de los valores de réplica.
La preamplificación multiplexada (preamplificación de alelos silvestres y mutantes de dos mutaciones de interés) aumenta la utilidad de una sola muestra, ya que el mismo material de partida se puede utilizar para probar dos mutaciones. Es importante destacar que un producto de preamplificación multiplex se puede analizar en un solo plex durante dPCR para una mayor simplicidad, como se describe aquí. Sin embargo, tanto la PRER como la dPCR pueden multiplexarse. Al multiplexar, las condiciones deben optimizarse tanto para conjuntos de imprimaciones como para sondas: las temperaturas de recocido de imprimación deben ser similares a las que se ejecutan juntas en la amplificación de PCR, y las sondas deben diseñarse para generar clústeres distintos (basados en señal fluorescente y intensidad). Al validar un nuevo conjunto de imprimaciones y sondas, ejecute un gradiente de temperatura de recocido para determinar la temperatura de recocido óptima en función del rango sugerido por el fabricante. Antes de probar las sondas en muestras de ADNr del paciente, valide las construcciones de ADN sintético y/o gDNA de tejido tumoral de diferentes insumos (es decir, hasta 10 ng).
Para la detección de alelos mutantes con mayor especificidad y reducción de las desajustes en la hibridación de la sonda al ADN objetivo, se utilizan sondas de ácido nucleico (LNA) bloqueadas. LNA es un análogo de ácido nucleico con un puente de metileno queconecta el 2'-oxígeno y 4'-carbono del anillo de ribosa 9. El puente de metileno bloquea el ácido nucleico en una conformación rígida bicíclica que restringe la flexibilidad, aumenta la estabilidad de los dúplex térmicos y mejora la especificidad de la hibridación de la sonda para apuntar al ADN10,18, 19. Si existe una sola discordancia de base entre la sonda LNA y el ADN de la plantilla, la formación dúplex entre la sonda y el objetivo se desestabilizará. Como tal, las sondas LNA mejoran la especificidad de la unión de la sonda y dan como resultado una mayor relación señal-ruido11. El análisis del plasma y el LSF de pacientes pediátricos no enfermos del SNC ha establecido la especificidad de nuestro ensayo con sondas LNA dirigidas a H3F3A p.K27M, para determinar que una frecuencia alélica igual o inferior al 0,001% se considera un falso positivo 8. Para consideraciones adicionales para optimizar el diseño de sondas y imprimaciones, incluyendo contenido GC, tamaño de amplificación, colorantes de reportero de sonda y quenchers, consulte las directrices del fabricante dPCR14,17. Aunque nuestro método está optimizado para su uso con el sistema RainDance, el protocolo puede adaptarse para su uso con otras plataformas dPCR.
El método presentado aquí obtiene fuerza de la alta sensibilidad y el enriquecimiento objetivo logrado por dPCR, que sigue siendo la plataforma de elección para detectar mutaciones tumorales raras en cfDNA. Aunque es potente, el dPCR está limitado en el número de mutaciones que se pueden probar en un solo ensayo. Una alternativa a la dPCR es la secuenciación de próxima generación (NGS), que puede detectar múltiples mutaciones en muchos genes, aumentando la utilidad de una sola muestra. NGS puede detectar mutaciones en el LCP y el plasma de pacientes con gliomas de tronco cerebral20, sin embargo, actualmente es menos sensible que la dPCR en la detección de mutaciones tumorales en cfDNA, con límites de detección de 0.1-10% MAF en comparación con 0.001% en enfoques basados en PCR21 . dPCR también logra un tiempo de respuesta más rápido que el NGS, lo que permite una detección rápida de mutaciones de interés. El enfoque de PCR es aplicable en todos los tipos de cáncer y se puede ampliar para detectar mutaciones de puntos críticos y cfDNA22metilado.
La biopsia líquida está en su infancia y requerirá un mayor desarrollo para la adaptación a enfermedades específicas. El monitoreo tumoral en el contexto de la evolución tumoral será el próximo reto, donde sería necesaria una plataforma capaz de detectar mutaciones emergentes con alta sensibilidad. Además, las plataformas capaces de detectar una variedad de biomoléculas (péptidos, citoquinas, ARN) serán altamente beneficiosas a la hora de evaluar la respuesta tumoral al tratamiento, así como avanzar en intervenciones clínicas personalizadas.

Debido a las limitaciones en la disponibilidad de tejido tumoral para análisis moleculares, es necesario el desarrollo de métodos altamente sensibles capaces de detectar mutaciones somáticas tumorales en biofluidos del paciente, incluyendo plasma, suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) . Por ejemplo, los gliomas de línea media difusa pediátrica (DDM) presentan un desafío debido a su ubicación neuroanatómica. Durante la última década, el perfil molecular de las muestras de tejido DMG ha descubierto mutaciones de conductores en este tumor tipo1 y ha revelado heterogeneidad espacial y temporal de mutaciones, haciendo que la biopsia sea necesaria para caracterizar a un paciente dentro de una enfermedad subgrupo y la promoción de terapias dirigidas molecularmente2. Como tal, los ensayos clínicos abogan por la integración de biopsias quirúrgicas para el perfil molecular tumoral en el diagnóstico inicial3,4,5,6. Durante el tratamiento, el seguimiento de la respuesta terapéutica en los DMR se limita a la RMN, que carece de sensibilidad para detectar pequeños cambios o evolución genómica tumoral. La RMN también es propensa a detectar la pseudoprogresión, inflamación transitoria en el sitio del tumor que imita la verdadera progresión en la imagen y puede desinformar la interpretación de la respuesta tumoral7. Por lo tanto, los DDM representan un tipo de tumor con una alta necesidad de un medio alternativo y mínimamente invasivo de detectar mutaciones tumorales y monitorear la respuesta clínica. Para hacer frente a estas necesidades, desarrollamos y optimizamos un protocolo para detectar y cuantificar la frecuencia alélica de lasmutaciones tumorales en cfDNA a partir de plasma, suero y LSN de niños con gliomas de línea media 8. Dado que los DMG de la infancia a menudo (>80%) una mutación somática de lisina a metionina en la posición 27 de la variante histona H3.1 (H3.1K27M, 20% de los casos) o H3.3 (H3.3K27M, 60% de los casos)1, estas y otras mutaciones características de los DDM (es decir, ACVR1, PIK3R1) fueron dirigidas a cuantificación de alelo mutante utilizando cfDNA8. Este ensayo se puede adaptar para detectar mutaciones de puntos críticos en otros tipos de tumores utilizando imprimaciones y sondas específicas de la secuencia. La versatilidad de este enfoque hace que sea aplicable a una variedad de cánceres que se beneficiarían de la integración de herramientas de diagnóstico basadas en adNado cfdna y monitoreo terapéutico.
Para detectar con sensibilidad mutaciones de baja frecuencia alélica en cfDNA, empleamos un enfoque basado en PCR digital de gotas (dPCR). En este método, la mezcla de reacción PCR se divide en un máximo teórico de 10 millones de gotas utilizando la plataforma dPCR (por ejemplo, RainDance), con 7-9 millones de gotas por PCR que normalmente se ven experimentalmente. Debido al alto grado de partición de muestras, a lo sumo sólo una o dos moléculas de ADN pueden estar presentes en cada gota. La amplificación de PCR y la hibridación de la sonda fluorescente específica de la secuencia pueden ocurrir en cada gota, de modo que se producen millones de reacciones. Esto maximiza la sensibilidad y permite la detección de alelos mutantes raros, que de lo contrario podrían pasar desapercibidos en un fondo de ADN de tipo salvaje. La utilización de sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) mejora la especificidad del ensayoal restringir la hibridación de discordancia y apoyar la detección precisa de mutaciones 9,10,11. Aquí, describimos nuestros métodos de procesamiento de muestras, extracción de ADNes cfDNA, preamplificación de alelos objetivo, dPCR y análisis de datos.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl, 0,1 mM Tampón de suspensión de ADN EDTA (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7,2 mg Tubos de extracción de sangre (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367525</td><td>Para la extracción de plasma</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Tubo de suero de plástico con cierre rojo BD Hemogard (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367895</td><td>Para la recolección de suero</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>General Proveedor</td><td></td><td></td>de laboratorio</tr><tr><td>Tampón ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de recolección de sangre de ADN libre de células</td><td>Streck</td><td>218961</td><td>tubos de recolección de sangre cfDNA (opcional)</td></tr><tr><td>Concentrador CentriVap</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Diseño personalizado</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto de grado de biología molecular (200 pruebas)</td><td>Proveedor de laboratorio general</td> Mutant Probe <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Diseño personalizado</td></tr><tr><td>Tubos de ADNc de sangre PAXgene Tubos de recolección de</td> sangre <td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>cfDNA (opcional)</td></tr><tr><td>Tapas de tubo de tira de 8 pocillos PCR VWR</td><td></td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tira de 8 pocillos PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (p20, p200, p1000)</td><td>Proveedor</td><td></td><td></td>de laboratorio general</tr><tr><td>Puntas de filtro de pipeta (p20, p200, p1000)</td><td>Proveedor</td><td></td><td></td>general</tr><tr><td>de laboratorio Q5 Arranque en caliente de alta fidelidad 2x Master Mix New</td><td>England Biolabs Inc</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Manual de ácido nucleico circulante&nbsp;</td><td>Manual del kit de extracción de ADNcf de Qiagen</td><td></td><td></td> (edición 2013)</tr><tr><td>Kit de ácido nucleico circulante QIAamp</td> Kit de extracción de ADNcf <td>Qiagen</td><td>55114</td><td>(Paso 4 del protocolo)&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>Kit opcional para la extracción de ADN de pequeños (< o =200 &micro; L) volúmenes de muestra</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Para usar con el kit de ácidos nucleicos circulantes QIAamp</td></tr><tr><td>Kit de consumibles Raindance</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>Contiene chips de instrumentos generadores de gotas, chips de instrumentos de cuantificación, tapas de tiras de PCR, incluidas las tapas de alta velocidad, y aceite estabilizador de gotas</td></tr><tr><td>Instrumento Raindance Sense Bio-Rad</td><td></td><td></td><td>Instrumento de cuantificación (utilizado en Paso de protocolo 9)</td></tr><tr><td>Instrumento de fuente de lluvia</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Instrumento generador de gotas (utilizado en el paso de protocolo 9)</td></tr><tr><td>Software RainDrop Analyst II</td> Software <td>RainDance Technologies</td><td></td><td>Analyst utilizado para el análisis de datos (paso de protocolo 10)</td></tr><tr><td>Trampa de vapor refrigerada</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Diseño personalizado</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genotyping Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4371353</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT Probe</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Diseño a medida</td></tr></tbody></table>

detección y seguimiento del adn circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Las complicaciones asociadas con el muestreo de tejido quirúrgico inicial y repetido presentan la necesidad de plataformas mínimamente invasivas capaces de subclasificación molecular y monitoreo temporal de la respuesta tumoral a la terapia. Aquí, describimos nuestro método basado en dPCR para la detección de mutaciones somáticas tumorales en el ADN libre de células (CFDNA), fácilmente disponible en biofluidos de pacientes. Aunque limitado en el número de mutaciones que se pueden probar en cada ensayo, este método proporciona un alto nivel de sensibilidad y especificidad. El monitoreo de la abundancia de mutaciones, calculado por MAF, permite la evaluación de la respuesta tumoral a la terapia, proporcionando así un suplemento muy necesario a las imágenes radiográficas.

La Figura 1 muestra resultados representativos para la detección exitosa de la mutación H3F3A p.K27M en plasma preamplificado (panel superior izquierdo) y CFDNA CSF (panel superior derecho) de dos niños con DMG. las muestras de adNC cfse se analizaron en replicación, pero solo se muestra un gráfico representativo para cada tipo de muestra. Las gráficas dPCR muestran una generación exitosa de gotas, con 7-9 millones de gotas por PCR (la mayoría de las cuales son gotas negativas que no contienen ADN objetivo). Un mínimo de 7 millones de gotas por PCR indica bien una gota de caletización exitosa, mientras que menos de 7 millones indican un error del ensayo, en cuyo caso el usuario no debe proceder con el análisis de datos. La Figura 1 muestra una clara separación entre los cúmulos de mutantes y de tipo salvaje a lo largo de los ejes X e Y, respectivamente. Los sólidos cúmulos de tipo silvestre indican que la extracción del ADNcf se realizó correctamente porque el ADN de la plantilla está presente. Los cúmulos mutantes muestran un MAF de 1,60% y 39,92% para las muestras de plasma y LSN, respectivamente, lo que demuestra una detección positiva de la mutación. Para estos pacientes, los resultados de la dPCR están de acuerdo con el estado de la mutación tumoral, como se confirma mediante el análisis genómico del tejido tumoral de la biopsia8. El control negativo (panel inferior izquierdo) muestra 0 gotas mutantes y 0 gotas de tipo salvaje, lo que indica que no hubo contaminación de la mezcla de reacción de PCR. El gDNA del tejido tumoral de control positivo (panel inferior derecho) muestra la mutación que se detecta en la frecuencia alélica esperada para la muestra de tumor en particular seleccionada.
En la Figura2, se muestran resultados representativos para la detección fallida de la mutación de interés, H3F3A p.K27M, en cfDNA plasmático de un niño con DMG. El estado de la mutaciónse confirmó mediante un análisis genómico del tejido tumoral 8. Se muestran los resultados representativos de dos pozos de PCR replicados (paneles superiores). El número total de gotas, incluidas las gotas negativas, es de entre 7-9 millones por PCR, lo que indica una gota exitosa. Los racimos de tipo silvestre, trazados a lo largo del eje Y, muestran aproximadamente 7-8.000 gotas de tipo salvaje por pozo de PCR para el CFDNA plasmático, lo que indica una extracción exitosa del ADNcf (ya que hay ADN de tipo salvaje objetivo en la muestra). Sin embargo, se detectan 0 gotas mutantes en la muestra de plasma. El panel inferior izquierdo muestra control negativo (MB H2O) sin tipo salvaje o gotas mutantes; y el panel inferior derecho muestra el control positivo preamplificado tejido tumoral gDNA (0.025 ng) con detección de mutación positiva. Como se muestra en esta figura, la ausencia de detección de mutaciones en plasma puede no significar necesariamente que el paciente sea de tipo salvaje para la mutación de interés, ya que se producen falsos negativos8. En algunos casos, cuando se pierde la mutación en el plasma recogido en la biopsia inicial,se detecta en el plasma obtenido del mismo paciente en un momento posterior 8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg"> Figura 1 : Detección exitosa de H3F3A mutación p.K27M en plasma preamplificado y ADNr CSF de niños con gliomas de línea media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg"> Figura 2 : Resultados negativos falsos obtenidos a partir del análisis de una muestra de ADNamiento plasmático preamplificado de un paciente conocido por albergar la mutación de interés, H3F3A p.K27M, en el tumor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Este protocolo permite la detección de mutaciones asociadas al tumor y actualmente complementa los procedimientos quirúrgicos invasivos. Otra fuerza es la capacidad de utilizar este protocolo para monitorear la carga de mutaciones tumorales horas extras. La técnica permite el genotipado tumoral sin necesidad de biopsia de tejido quirúrgico real, que es particularmente útil para tumores en lugares desafiantes, como el tronco cerebral con acceso restringido a los tejidos.En ausencia de biopsia repetida, los datos moleculares longitudinales no están disponibles para complementar la RMN. El monitoreo digital de PCR facilita un suplemento molecular al diagnóstico, lo que permite un proceso de toma de decisiones de tratamiento más informado. Métodos similares se pueden utilizar para detectar la expresión de genes en un sistema particular, con sondas convencionales Fluo-4 y quencher-linked pero con una mayor sensibilidad que con la PCR cuantitativa.Antes de comenzar el procedimiento de PCR digital de gotas, limpie el espacio del banco y el equipo con 10% de lejía y 70% de etanol y vórtice suavemente y centrifugar brevemente todos los reactivos, excepto el aceite estabilizador de gotas. Confirme que el cilindro de gas nitrógeno comprimido está unido al instrumento de generación de gotas y que el tanque de cilindros se establece en 90 libras por pulgada cuadrada. Y 38 microlitros de mezcla de reacción PCR digital directamente en la parte inferior de cada pozo de una tira de tubo PCR de ocho pozos, eliminando cualquier burbuja con una punta de pipeta limpia.Añadir 12 microlitros de muestra de ADN preamplificado en triplicado a los pozos apropiados de la tira de tubo. Pipetear suavemente el volumen completo 10 veces para mezclar la mezcla de reacción con la muestra de ADN y pipetear el volumen completo de cada pozo en los canales A a H correspondientes de un chip de instrumento generador de gotas. Inserte una nueva tira de tubo PCR en el instrumento de generación de gotas y escanee el ID de chip del instrumento generador de gotas en el software del ordenador del instrumento.A continuación, haga clic en Iniciar la ejecución para comenzar a colocar muestras. Cuando se complete la gotletización, retire la tira del tubo PCR y aplique las tapas de la tira de tubo. Transfiera la tira de tubo a un ciclor térmico y equilibre el tubo con otra tira de tubo que contenga 80 microlitros de agua por pozo.A continuación, ejecute el ciclor térmico en las condiciones de ciclo térmico adecuadas. Sustituya las tapas de las tiras por tapas de alta velocidad. Cuando el ciclo térmico esté completo, transfiera la tira de tubo al instrumento de cuantificación, haga clic en Configurar un funcionamiento en el software de instrumentos y coloque la tira de tubo en el instrumento de cuantificación.Coloque el escudo metálico encima de un nuevo chip de instrumento de cuantificación, escanee el ID de chip en el instrumento e inserte el chip en la máquina. Cierre la tapa del instrumento. En el software del ordenador, escriba un nombre para la ejecución de PCR digital y para cada uno de los ocho canales, seleccione Modo rápido y haga clic en Iniciar para comenzar la cuantificación.Para analizar los datos espectrales sin procesar, inicie el software de analista y abra los archivos fcs. En la vista de análisis, seleccione intactos. En la vista de ejemplo, haga clic en los cuadros situados junto a cada uno de los ocho ejemplos.El software trazará las señales para los alelos mutantes y salvajes a lo largo del eje x e y respectivamente. Utilice la función de matriz calculada para aplicar la compensación espectral en las gotas intactas, según los instructores de los fabricantes y ajustar la configuración del eje en las opciones del eje. Establezca el eje x en un mínimo de cero y un máximo de 30.000 y el eje y en un mínimo de menos 5.000 y un máximo de 10.000.Cuando se hayan identificado los clústeres de gotas, ajuste el eje para reducir el espacio vacío en el gráfico. Seleccione la muestra correspondiente al ADN genómico del tejido tumoral de control positivo para establecer las puertas de tipo mutante y salvaje negativas, asegurando que los racimos sean distintos y fáciles de identificar. A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Aplicar todos los ajustes a las muestras seleccionadas para aplicar la configuración de puerta para el control positivo a todas las muestras.En la vista gráfica, haga clic en varios ejemplos para ver los trazados de todas las muestras seleccionadas y exportar la imagen como un archivo tif. A continuación, en Espacio de trabajo, seleccione Exportar análisis y guarde el archivo de datos analizado como un archivo csv. Aquí, se muestran resultados representativos para una detección exitosa de una mutación en un plasma preamplificado y ADN libre de células de líquido cefalorraquídeo de dos niños con gliomas difusos de línea media.En este experimento, se puede observar una separación clara entre los racimos de tipo mutante y salvaje a lo largo del eje x e y respectivamente. Los grupos robustos de tipo salvaje indican que la extracción de ADN libre de células tuvo éxito porque el ADN de la plantilla está presente. Para estos pacientes, los grupos mutantes muestran una frecuencia alélica mutación de 1,6 y 39,32 por ciento para las muestras de plasma y líquido cefalorraquídeo respectivamente de acuerdo con el estado de mutación tumoral, según lo confirmado por el análisis genómico del tejido tumoral biopsiado.El control negativo, por otro lado, muestra cero gotas mutantes y cero de tipo salvaje que indican que no hubo contaminación de la mezcla de reacción PCR. El ADN genómico del tejido tumoral de control positivo muestra que la mutación se detecta a la frecuencia alélica esperada para la muestra tumoral seleccionada. La ausencia de detección de mutaciones dentro del plasma puede no significar que un paciente es de tipo salvaje para la mutación de interés a medida que se producen falsos negativos.Por ejemplo, en este paciente, aunque no se detectó la mutación de interés, el estado de la mutación se confirmó mediante un análisis genómico del tejido tumoral. El PCR es una técnica muy sensible que exige una descontaminación frecuente del área de trabajo y del equipo para evitar la adquisición de datos falsos positivos.

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Investigación

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Investigación del cáncer

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