Name: Modelo de apendicectomía murine del cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica por localización precisa del parche de Caecal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Aprende el procedimiento quirúrgico de apendicectomía en ratones mediante extracción del parche cecal. Este modelo murino permite estudiar el papel biológico del apéndice en la patogénesis del cáncer colorrectal asociado a colitis.

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Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de los Fondos de Investigación Fundamental de la Universidad Central (G2018KY0302), el Fondo de Desarrollo de Investigación Fundamental Universitaria (KT00062), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81870380), y el Premio de Investigación Clínica de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong en China (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Los autores agradecen al Dr. Chengxin Shi por sus sugerencias técnicas durante la fase de exploración temprana del modelo de apendicectomía murina, así como al patólogo Dr. Xi Liu por la evaluación de los resultados de tinción de H&E de colitis y tumores colorrectales. Y.L. realizó la demostración de cirugía, hizo análisis de datos y escribió el borrador del manuscrito; J.L., G.L., Z.P., y Y.M. participaron en la preparación quirúrgica, colecciones de tejidos y producción de video; M.Z. realizó la citometría de flujo y ELISA; Q.W. y H.X. proporcionaron el apoyo técnico para generar un modelo murino clínicamente relevante; R.X.Z. diseñó el estudio, supervisó la investigación y escribió y denitó el manuscrito; J.S. revisó el manuscrito.

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong (No. XJTULAC2019-1023).
1. Apendicectomía de ratones
<ol><li>House 8–10-week-old C57BL/6 ratones macho en un ambiente certificado libre de patógenos específicos (SPF) durante 1 semana antes de la cirugía.</li>
	<li>Prepare los siguientes instrumentos quirúrgicos estériles: un par de microtijeras, un par de microfórptos, dos tamaños (4-0 y 8-0) de suturas esterilizadas no absorbibles, una pluma de coagulación eléctrica con soporte de aguja, 75% alcohol médico, exfoliación a base de yodo ( por ejemplo, entoyodo), y un paquete de hisopos de algodón estériles.</li>
	<li>Llene una jeringa de 10 ml con una salina fisiológica precalentada del 0,9% para el lavado abdominal y la hidratación durante la cirugía.</li>
	<li>Anestetizar un ratón no enano por vía intraperitoneal (es decir) con un 1% de pentobarbital sódico a una dosis de 100 mg/kg. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a los reflejos del pedal. NOTA: Se administra una dosis anestésica única para garantizar un efecto sedante completo en el ratón. En caso de procedimientos cortos, 50 mg/kg de pentobarbital sódico i.p. pueden ser suficientes.</li>
	<li>Afiérate suavemente el vello abdominal con una afeitadora eléctrica.</li>
	<li>Poner el ratón en la almohadilla de calentamiento para evitar la hipotermia.</li>
	<li>Asegure el ratón sobre una plataforma en posición supina colocando cuatro tiras de cinta adhesiva médica a través de las extremidades para prevenir el movimiento postural durante la cirugía.</li>
	<li>Toque suavemente todo el abdomen para encontrar la sensación de un bulto. NOTA: En la mayoría de los casos, la sensación de un bulto siempre indica la posición exacta del caecum. Para evitar posibles daños en el resto del intestino, esta colocación previa del caecum antes de la incisión abdominal es importante.</li>
	<li>Cubrir con una cortina estéril y desinfectar la zona arasda del abdomen mediante la aplicación de exfoliaciones quirúrgicas alternas de solución a base de yodo y 75% de alcohol. Repita el proceso 2x.</li>
	<li>Hacer una incisión longitudinal que va de 0.5–1.0 cm en la línea media del abdomen.</li>
	<li>De acuerdo con la ubicación predeterminada del caecum, llegar al caecum y exteriorizar suavemente (1 cm) para identificar el parche cecaco. Utilice una solución salina estéril y precalentada de pH fisiológico para hidratar el intestino. NOTA: El parche cecacal de un ratón es parte del caecum y se caracteriza por la presencia de folículos blancos ovoides en la superficie.</li>
	<li>Para prevenir posibles complicaciones del sangrado y la infección postoperatorios, ligar los vasos sanguíneos mesentéricos del caecum usando el 8-0 Sutura. Hidrata el caecum con solución salina estéril.</li>
	<li>Marque la región de resección usando la sutura 4-0 con un bucle abierto cerca del ápice del caecum en el colon proximal. NOTA: Marcar el caecum con un bucle abierto también evita la fuga de contenido cecaico del corte.</li>
	<li>Corte el parche de ceca debajo de la resección marcada con microtijeras y limpie el contenido cecal residual con hisopos de algodón médicos. A continuación, desinfecte el muñón de caecum con exfoliación a base de yodo.</li>
	<li>Cierre el muñón con la sutura de carrera usando el 8-0 Sutura.</li>
	<li>Retire con cuidado el bucle de rosca 4-0 utilizado anteriormente para marcar la resección en el muñón del caecum.</li>
	<li>Esterilice la posición suturada con exfoliación a base de yodo. Rehidrata rhidrate el sitio quirúrgico con salina de nuevo.</li>
	<li>Cierre la capa de musculatura con la sutura de correr usando 8-0 hilo de sutura.</li>
	<li>Cierre las capas de la piel con suturas interrumpidas con hilo de sutura 4-0.</li>
	<li>Desinfectar el corte quirúrgico 2x con exfoliación a base de yodo, luego eliminar el yodo con 75% de alcohol médico.</li>
	<li>Voltee suavemente el ratón hacia atrás, por vía subcutánea (s.c.) inyectar 0,1 mg/kg de peso corporal de buprenorfina y 0,4 ml de salina fisiológica y dejar que el ratón descanse en la almohadilla de calor hasta que vuelva a la conciencia.</li>
	<li>Vuelva a colocar el ratón en la jaula estéril y monitoree de cerca si hay signos de dolor durante 3 días después de la cirugía para asegurar la recuperación. NOTA: Puede ser necesaria una aplicación postoperatoria de 0,05 mg/kg de buprenorfina para aliviar el dolor del ratón individual. Permita que los ratones se recuperen durante 7 días después de la cirugía para una mayor inducción del cáncer colorrectal asociado a la colitis.</li>
</ol>2. Inducción del cáncer colorrectal crónico asociado a la colitis con AOM y DSS
NOTA: Realice este procedimiento 7 días después de la apendicectomía.
<ol><li>Preparar la solución de stock AOM disolviendo 25 mg de AOM en 2,5 ml de solución salina estéril al 0,9% a una concentración de 10 mg/ml. NOTA: AOM es sensible a la luz.<ol>
<li>Aliquot 2,5 ml de solución de material AOM preparada en tubos de vidrio de 5 ml envueltos con papel de aluminio y almacenar a -20 oC cada vez en su uso.</li>
		<li>Descongelar una alícuota de AOM una vez y diluirla a una concentración de 1 mg/ml con 0,9% de solución salina estéril (relación 1:10). ADVERTENCIA: AOM es extremadamente cancerígeno; por lo tanto, realizar todo el procedimiento de preparación en una campana de humo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disolver 4 g de polvo DSS en 200 ml de agua autoclave para preparar una solución DSS al 2% (p/v). NOTA: La concentración de DSS puede variar dependiendo de la tensión del ratón, el sexo y el ciclo de inducción; 3% DSS se puede utilizar para otras cepas de ratones.</li>
	<li>Administre simultáneamente el AOM/DSS recién preparado a los ratones. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.<ol>
<li>Inyecte por vía intraperitoneal 0,01 ml/g de solución de trabajo AOM recién preparada para cada ratón y reemplace el agua autoclave por una solución DSS al 2% durante 5 días ad libitum. NOTA: Cada jaula contiene cinco ratones; revisar regularmente el frasco de dSS para asegurarse de que no se produce ningún precipitado durante el período de tratamiento.</li>
		<li>Peso y monitoree de cerca cada ratón todos los días. NOTA: Durante la administración, eutanasia ratones con hasta un 20% de pérdida de peso en comparación con su peso inicial o signos de la ampolla, entrecerrar los ojos, hipotermia y mala actividad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proporcione una botella fresca de agua autoclave en el día 6 después de la administración de AOM/DSS hasta el día 21 (Figura 1B). NOTA: Este es un ciclo completo que comprende de 21 días.</li>
	<li>Repita los pasos 2.3–2.4 para dos ciclos adicionales y sacrifique a los ratones el día 70.</li>
</ol>3. Evaluación de la inflamación del colon y el tumor (70 días después de la administración de AOM)
<ol><li>Sacrificar a los ratones por inhalación de CO2 a una tasa de llenado del 10% en la cámara de eutanasia seguida de luxación cervical.</li>
	<li>Cosecha todo el colon desde arriba de la unión ileo-cólico hasta el ano.</li>
	<li>Exponga el lado del lumen abriendo el colon longitudinalmente. Cortar todo el colon en trozos de 10 cm de largo y fijar el tejido del colon en 10% de formalina durante 72 h para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se obtuvo un modelo de apendicectomía murino de cáncer colorrectal asociado a la colitis mediante pasos quirúrgicos con una alta tasa de supervivencia en ratones. En la mayoría de los casos, dado que el caecum se colocó debajo de la pared abdominal (TablaSuplementaria 1, Tabla Suplementaria 2y Figura2), era difícil prejuzgar su ubicación sin laparotomía. En este protocolo quirúrgico, se introdujo un paso fácil de tocar el bache, y también se proporcionó una evaluación cuanti...

La apendicectomía clínica es un procedimiento quirúrgico estándar que implica la extirpación del apéndice principalmente debido a la inflamación (por ejemplo, apendicitis)1,2,3. Sin embargo, la función biológica del apéndice humano vermiforme sigue siendo controvertida4,5,6. El apéndice ha sido considerado como un remanente vestigial que se proyecta desde el cecum en el intestino grueso. Hasta hace poco, estudios evolutivos, inmunológicos, morfológicos y microbiológicos han sugerido que el apéndice puede poseer funciones distintas. Estas funciones incluyen la producción de inmunoglobinas (por ejemplo, IgA e IgG), una variedad de células B y células T críticas para respuestas inmunitarias adaptativas dentro de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), y la reposición del intestino grueso con microbiotas comensales 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.
Los estudios epidemiológicos clínicos de pacientes con apendicectomía previa o apendicitis aguda también han revelado sus posibles funciones en la patogénesis de enfermedades humanas, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), el cáncer colorrectal y el (p. ej., enfermedad de Parkinson y enfermedad cardiovascular)13,14,15,16,17,18. Por ejemplo, un gran estudio de cohorte de población asiática con 75.979 pacientes con apendicectomía mostró recientemente una asociación significativa entre la apendicectomía y el desarrollo posterior del cáncer colorrectal, uno de los tumores malignos más comunes con una alta incidencia y mortalidad14,19. En consecuencia, establecer un modelo adecuado de apendicectomía animal que se asemeje a un ser humano será útil para investigar las funciones biológicas y los mecanismos moleculares del apéndice en la patogénesis de la enfermedad.
Muchos mamíferos poseen un órgano similar a un apéndice o apéndice, incluyendo primates, lagomorfos (por ejemplo, conejos), algunos roedores y marsupiales20. Para animales de laboratorio pequeños y de uso común, el conejo posee el apéndice vermiforme que se asemeja morfológicamente al humano21,22, pero GALT en el conejo es extremadamente grande en comparación con el de los seres humanos, ya que la mayoría de los los tejidos linfoides también se encuentran en los parches de Peyer ubicados en los intestinos pequeños y grandes21. Además, el conejo muestra una estructura folicular linfoide diferente, distribución de células T, y la densidad de inmunoglobulina del humano, lo que hace que el estudio de sus apéndices inapropiado21.
Los ratones son el modelo animal más utilizado para estudiar la fisiopatología humana y probar las diversas terápticas existentes y novedosas23,24,25. Se cree que el único racimo linfoide grande blanco en el ápice del caecum en ratones, conocido como parche cecaico, realiza funciones similares al apéndice humano26,27,28. Sin embargo, es prácticamente difícil separar el parche cecaico de caecum en ratones. Hasta ahora, los procedimientos quirúrgicos comunes para inducir la apendicitis en un modelo de ratón implican una incisión relativamente grande (por ejemplo, 1-2 cm) a través de la pared abdominal para tener acceso a todo el caecum (TablaSuplementaria 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.
Aquí, para generar un modelo de apendicectomía asociado con la enfermedad gastrointestinal, este informe presenta un protocolo quirúrgico fácil para la extracción de parches de ceca en ratones. Esto es seguido por la administración combinada del agente genotóxico AOM y el agente proinflamatorio DSS para la inducción de cáncer colorrectal asociado a la colitis similar al observado en humanos. La EII ha demostrado ser un factor de riesgo de cáncer intestinal37,38. La combinación de cáncer colorrectal crónico asociado a colitis crónica inducido por AOM/DSS ha sido bien establecida, y los lectores pueden referirse a Neufert et al., y Thaker et al. para procedimientos detallados39,40. Este modelo de apendicectomía murino reproducible y rápida se puede utilizar para estudiar la inflamación intestinal modulada por apéndice y la microbiota de colon, especialmente en el desarrollo y progresión de la EII y el cáncer colorrectal.

<table><tbody><tr><td>Azoximetano(AOM)</td><td>Sigma-Aldrich,Inc.</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de sulfato de dextrano (DSS)</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td>160110</td><td></td></tr><tr><td>Entoyodine</td><td>Shanghai likon alta tecnología desinfección co. LTD</td><td>310102</td><td></td></tr><tr><td>calibrador digital</td><td>Ningbo yuanneng trading co. LTD</td><td>4859263</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Suturas de seda</td><td>Yuanlikang co. LTD</td><td>20172650032</td><td></td></tr><tr><td>8-0 Prolene Sutures</td><td>Yuanlikang co. LTD 20172650032</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluma de coagulación eléctrica</td><td>Chuang mei medical equipment co. LTD</td><td>28221777292</td><td></td></tr><tr><td>jeringa desechable 1ml</td><td>Shengguang medical products co. LTD</td><td>3262-2014</td><td></td></tr><tr><td>jeringa desechable 10ml</td><td>Shengguang medical products co. LTD</td><td>3262-2014</td><td></td></tr><tr><td>75% Alcohol medicinal</td><td>Shandong anjie tecnología de desinfección de alta tecnología co. LTD</td><td>371402AAJ008</td><td></td></tr><tr><td>Sal</td> <td>de sodio de pentobarbitalSigma-Aldrich, Inc.</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina fisiológica</td><td>Shandong qidu pharmaceutical co. LTD</td><td>H37020766</td><td></td></tr><tr><td>Hisopo de algodón absorbente</td><td>Henan ruike medical co., LTD</td><td>RK051</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos quirúrgicos-Oftálmico</td><td>Jinzhong Shanghai co. LTD</td><td>WA3050</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de apendicectomía murine del cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica por localización precisa del parche de caecal

Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch

El apéndice humano ha sido implicado recientemente para desempeñar importantes papeles biológicos en la patogénesis de diversas enfermedades complejas, como el cáncer colorrectal, la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad de Parkinson. Para estudiar la función del apéndice, se ha establecido un modelo de apendicectomía murino asociado a la enfermedad intestinal y su protocolo paso a paso se describe aquí. Este informe introduce un protocolo fácil para la eliminación de parches de cecal en ratones seguido de la inducción química del cáncer colorrectal crónico asociado a la colitis utilizando una combinación de sulfato de dextran sódico (DSS) y azoximetano (AOM). Las células específicas de IgA y la concentración de IgA se redujeron significativamente tras la eliminación del parche ceaquídico en ratones machoC57BL/6 en comparación con los del grupo falso. La administración simultánea del 2% de DSS y AOM dio lugar a casi el 80% de supervivencia de ratones en grupos de farsa y apendicectomía sin pérdida significativa de peso corporal. Los resultados histológicos confirmaron la inflamación colónica y diferentes grados de adenocarcinoma. Este modelo se puede utilizar para el estudio del papel funcional del apéndice en el mantenimiento de la homeostasis de la microbiota intestinal y la patogénesis de la colitis intestinal y neoplasias malignas, así como para el desarrollo potencial de terapias de segmentación de fármacos.

Establecimiento del modelo de apendicectomía murina
Este modelo de apendicectomía murina de cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica se puede generar siguiendo los pasos quirúrgicos e inducción secuenciales como se ilustra en la Figura1. Las posiciones más frecuentes de caecum están en la fosa ilíaca izquierda y derecha seguida de la línea media del abdomen (Figura2). La tasa exitosa de prelocalización de caec...

El protocolo presentado describe una extirpación quirúrgica fácil del apéndice (parche cecaco) en un ratón seguido de la inducción del cáncer colorrectal asociado a la enfermedad inflamatoria intestinal. Este modelo de apendicectomía murina permite investigar el papel biológico del apéndice en la patogénesis de la enfermedad gastrointestinal humana.

Modelo de apendicectomía murine del cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica por localización precisa del parche de Caecal

The human appendix has been recently implicated to play important biological roles in the pathogenesis of various complex diseases, such as colorectal ...

El protocolo general describe los procedimientos quirúrgicos fácilmente realizados para extraer el apéndice conocido como parche caecal en ratones. El modelo de apendicectomía murina se puede utilizar para estudiar las funciones biológicas del apéndice en la patogénesis de la enfermedad gastrointestinal humana. El apéndice humano es un órgano discutible.Estudios recientes han sugerido que el apéndice juega un papel importante en el mantenimiento de la salud intestinal. Para estudiar la función biológica del apéndice, la generación de un modelo animal de apendicectomía asociada a la enfermedad es fundamental. En este protocolo, describiremos un simple y seguro pasos quirúrgicos para extraer el apéndice, conocido como parche caecal en ratones.Para garantizar el éxito de este modelo, hay tres pasos clave como verá en el siguiente vídeo. Primero, localice el cecum de los ratones antes de la cirugía. Segundo, hacer una pequeña incisión en el abdomen.Tercero, desinfectar y cerrar el muñón de cecum. La primera parte, la apendicectomía de ratones. Preparar instrumentos quirúrgicos estériles y soluciones de limpieza antes de la cirugía.Anestesice y asegure el ratón en una plataforma en posi

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Modelo de apendicectomía murine del cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica por localización precisa del parche de Caecal (Video) | JoVE Journal

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